http://dx.doi.org/10.5369/JSST.2015.24.6.423 pISSN 1225-5475/eISSN 2093-7563
반사광 측정 모드에서 금과 은의 쌍금속 표면 플라즈몬 공명 칩의 특성과 임계각을 이용한 굴절률 계산
김형진1·이성엽2·김홍탁2·양기원2·손영수1,+
Characteristics of Gold and Silver Bimetallic Surface Plasmon Resonance Chip in Intensity Measurement Mode and Calculation of Refractive Index using Critical Angle
Hyungjin Kim1, Sung-Youp Lee2, Hong Tak Kim2, Ki-Won Yang2, and Young-Soo Sohn1,+
Abstract
A bimetallic chip made of gold and silver was investigated in intensity interrogation mode to confirm enhancement of the SPR sensor resolution. Both reflectance curves of the bimetallic chip and the conventional gold chip was acquired and compared. The line width of the reflectance curve of the bimetallic chip was narrower than that of the conventional Au chip, resulting in steeper tangential slope. The reflectance was monitored at the angle related to the steepest tangential slope. The change in reflectance of the bimetallic chip was larger than that of the Au chip. The critical angle was analyzed by dif- ferentiating the reflectance with respect to incident angle twice. Acquiring the critical angle regarding to the sample informs the refractive index of the sample. Using various concentration of Bovine Serum Albumin, we confirmed that refractive index was linearly related to variation of reflectance of the bimetallic chip.
Keywords: Bimetallic chip, SPR sensor, Intensity interrogation mode, Critical angle, Refractive index
1. 서 론
최근 고령화 사회로 접어들면서 노년 생활의 삶의 질에 대한 관심이 증가하고 있다. 노년 인구의 건강한 삶의 질을 위해서 질병 발병 후 치료보다 질병의 예방과 조기진단 및 관리에 대 한 중요성이 대두되고 있다[1-3]. 특히 질병의 예방과 조기 진 단은 개인의 의료비뿐만 아니라 국가의 의료비 절감에도 기여 할 수 있다. 이러한 이유로 최근 조기 진단 및 현장 진단용 의 료기기에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있다[3]. 그 중 바 이오 및 나노 기술의 발달과 함께 부상하는 의료기기가 바이오 센서이며, 바이오센서는 분석하고자 하는 생체분자의 특정 정보
및 반응을 사용하기 편한 전기적 신호로 전환시켜 주는 장치이 다[3]. 질병을 진단하는 대표적인 바이오센서에는 면역센서가 있 다. 면역센서는 항원과 항체 사이의 특이적인 반응을 바탕으로 질병의 바이오마커(biomarker)에 해당되는 항원을 선택적으로 감지할 수 있는 센서이다[4,5]. 현재 면역 센서에 많이 활용하는 방법은 효소결합 면역흡착 분석법(ELISA: Enzyme-linked immunosorbent assay)으로 한번에 다량분석이 가능하지만 항원 을 측정하기 위해 형광 물질, 방사능 표식 등과 같은 별도의 표 지(label)를 사용해야 하고, 이를 위해 복잡한 전 처리 과정이 요 구된다[6]. 하지만 비표지(label-free) 방식의 분석법은 처리 과 정이 상대적으로 단순하고 측정하고자 하는 바이오마커 등과 같 은 생체분자 자체의 고유 성질을 변화시키지 않아 신뢰성 확보 에 유리한 장점이 있다[7]. 이러한 장점으로 최근에는 비표지 방 식의 연구가 활발하게 이루어지고 있으며, 그 대표적인 방법으 로 surface plasmon resonance(SPR)[8], field effect transistor (FET)[9], micro-cantilever[10] 등이 있다. 이 중 민감도가 우수 한 SPR에 대한 관심이 집중되고 있다. SPR이란 특정 입사각으 로 금속 경계면에 평행하게 입사한 빛에 의해 발생한 소산파 (evanescent wave) 와 금속 표면의 플라즈몬파(plasmon wave)의 파수벡터가 일치했을 때 발생하는 현상으로 반사광의 강도가 약 해지다가 최저가 되며 이 때의 입사각을 공명각(resonace angle) 이라 한다. SPR 현상에 따른 반응을 입사각에 대한 반사광 강
1대구가톨릭대학교 의공학과(Dept. of Biomedical Engineering, Catholic University of Daegu)
St. Dominic Hall, 13-13 Hayang-ro, Hayang-eup, Gyeongsan-si, Gyeongbuk 38430, Korea
2경북대학교 물리학과 (Dept. of Physics, Kyungpook National Unversity) NS-1, 80 Daehakro, Bukgu, Daegu, 41566, Korea
+Corresponding author: [email protected]
(Received : Oct. 07, 2015, Revised : Nov. 23, 2015, Accepted : Nov. 25, 2015)
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도의 그래프로 나타낼 수 있는데 이를 SPR 반사도 곡선(reflectance curve) 이라 한다[8]. SPR 현상을 이용한 센서는 금속 표면 근처 에서 굴절률 변화에 따라 반사도 곡선이 변화하게 되는 현상을 이용한 센서로 실시간으로 탐지 가능하며, 초저농도의 분석물질 도 검출 가능한 고감도 생화학 센서이다[11, 12]. 따라서 질병뿐 만 아니라 물리ㆍ화학적 성질 규명, 약품 특성 조사, 국방 과학, 각종 산업 등에서 각광 받고 있다.
SPR 센서 칩 표면 재료로는 플라즈몬 공명 현상을 잘 일으키 는 금(Au), 은(Ag), 알루미늄(Al), 구리(Cu)와 같은 금속이 사용 된다[13]. 센서 칩 표면 금속은 일반적으로 생체 적합성, 내구성, 화학적 안정성이 뛰어난 금을 주로 사용하여 제작한다. 은은 소 산파의 투과 영역이 길어 금을 이용한 칩 보다 칩 표면으로부 터 더 먼 지점까지 분석이 가능하지만 산화가 잘 일어나는 등 화학적으로 불안정하여 단일 금속 박막으로는 사용되지 못하고 있다[14,15]. 최근 연구결과에 의하면 은과 금을 함께 사용하여 은의 장점과 금의 장점을 동시에 활용한 쌍금속 칩에 대한 연 구가 진행되었다[16,17]. SPR 센서의 측정 방법에는 공명각 변 화 측정(angular interrogation mode), 반사광 변화 측정(intensity interrogation mode), 위상차 변화 측정(phase interrogation mode), 파장 변화 측정(wavelength interrogation mode) 4가지 방법이 주로 사용되고 있다[7,18]. 이 중에서 일반적으로 사용하는 것이 공명각 변화 측정 방법이다. 공명각 변화 측정 방법은 금속 표 면 근처에서 굴절률 변화에 따른 공명각의 변화를 측정하는 방 식으로 일반적으로 공명각의 변화가 큰 금 칩을 이용한 연구가 많이 이루어지고 있다.
금과 은을 사용한 쌍금속 칩은 은을 사용하기 때문에 SPR 반 사도 곡선이 일반 금 칩의 반사도 곡선의 선 폭에 비해 좁은 특 성으로 인해 반사도 곡선에서 접선의 기울기를 크게 할 수 있 다. 따라서 반사도 곡선의 기울기가 가장 큰 지점에 광원을 고 정하고 반사광 변화를 측정하는 방법이 공명각 변화를 측정하 는 방법보다 큰 변화값을 얻을 수 있다. 또한 반사광 변화 측정 방법을 이용하게 되면 광원의 입사각을 움질일 필요가 없기 때 문에 모터와 같은 기계적 장치가 필요치 않아 소형화에 유리한 장점을 갖는다.
본 연구는 금과 은을 사용한 쌍금속 칩으로 초정수에서 반사 도 곡선을 얻고 일반 Au 칩의 반사도 곡선 선 폭과 비교하였다.
또한 쌍금속 칩의 반사도 곡선에서 접선의 기울기가 가장 큰 지 점에 광원을 고정하고 샘플의 변화에 따른 반사광 변화를 측정 하고 이를 Au 칩과 비교하였다. 반사도 곡선에서 임계각을 측 정하여 입사각을 보정할 수 있고, 이를 이용하여 역으로 샘플의 굴절률을 얻을 수 있었다.
2. 연구 방법 2.1 SPR 센서 시스템
본 연구에 사용된 SPR 센서 시스템은 Fig. 1(a)에서 보는 바 와 같이 Kretschman configuration을 기반으로 하고 있다. 광원 은 피크 파장 770 nm의 LED(Opnext Inc., Japan)를 사용하였다.
광원은 band pass filter(770±5 nm)와 편광계를 지나 p-편광 된 쐐기 빔 형태로 프리즘(BK-7, 원통형)을 통과한 후 센서 칩에 도달한다. 센서 칩에서 반사된 광원은 7.14
o의 범위로 2D- CMOS(1,280×1,024 pixel, IDS Co., Germany)에 입사된다. 프 리즘과 센서 칩 사이에는 matching oil을 사용하여 빈 공간 없 이 밀착 시킨다. 이를 통해 프리즘과 센서 칩 사이 미세 공기에 의한 굴절률 변화를 차단할 수 있다. 광원의 쐐기빔 중심을 43.5
o~ 75
o까지 조절 가능하며 이로 인해 액체 또는 기체와 같은 다 양한 물질의 공명 현상을 확인할 수 있다. SPR 센서의 분석 채 널은 Fig. 1(b)에서 보는 바와 같이 총 3개로 구성되어 있다. 그 림에서 검정 부분이 짙은 곳은 반사광의 강도가 약하기 때문에 나타나는 현상이고, 검정 부분이 가장 강한 곳이 반사광 강도가 가장 작은 곳으로 공명 현상이 나타난 부분이다. 본 센서 시스 템은 1개의 채널은 대조군(reference)으로 사용하고 2개의 채널 은 샘플 채널로 사용할 수 있다. 대조군을 사용함으로써 온도 Fig. 1(a). Schematic diagram of Kretschmann SPR sensor system
Fig. 1(b). Grey scale image of 3-channel SPR.
등 외부 환경에 의한 신호 간섭을 제거할 수 있다. 모든 샘플 용액은 펌프(peristaltic pump)를 이용하여 30 μl/min의 일정한 유속으로 주입하고 탈기 장치를 이용하여 기포를 제거한 후 SPR 센서로 주입된다. 탈기 장치는 용액 속에 존재하는 기체로 인한 굴절률 변화를 제거하기 위해 사용한다. 모든 실험 온도는 상온 에서 진행하였다.
SPR 쌍금속 칩을 제작하기 위해 먼저 프리즘과 같은 재질인 BK-7(12 mm × 12 mm × 0.3 mm)을 60
oC 의 piranha 용액(H
2SO
4: H
2O
2= 2:1) 속에 15분 담구어 세척을 진행하고, 아세톤, 메탄 올, 초정수 용액에 담궈 차례로 초음파를 이용하여 세척을 진행 하였다. 금속은 evaporator 증착기를 이용하여 증착하였고, 증착 시 진공 상태는 1×10
-6Torr 이었다.
실험 진행은 제작한 SPR 칩을 센서 시스템에 고정시킨 후 초 정수를 주입하여 반사도 곡선을 얻어 공명 현상을 확인하였다.
반사도 곡선이 안정화 될 때까지 충분한 시간 동안 초정수를 주 입하였고, 안정화 된 후에 3개의 채널 중 한 개의 채널(샘플 채 널)에 PBS(Phosphate-buffered saline) 용액을 주입하여 반사도 곡선의 변화를 관찰하였다. PBS 용액을 주입한 후 평형 상태에 이르면 PBS 용액에 희석한 BSA 100 ng/ml, 1 μg/ml, 10 μg/ml, 100 μg/ml를 각각 500 μl씩 샘플 채널에 주입하였다. 또한 센서 시스템의 입사각 보정을 위해 공기에 대한 임계각을 구하고 스 넬의 법칙과 비교하여 장비를 보정하였다. 또한 임계각을 이용 하여 BSA 100 ng/ml, 1 μg/ml, 10 μg/ml, 100 μg/ml 농도에 대 한 굴절률을 역으로 계산하였다.
3. 결과 및 고찰
3.1 임계각을 이용한 입사각 보정
SPR( 표면 플라즈몬 공명) 현상이 일어나기 위해서는 전제 조 건으로 전반사 현상이 나타나야 한다. 전반사는 굴절률이 큰 매 질(n
1) 에서 굴절률이 작은 매질(n
2) 로 빛이 진행할 때 나타나는 현상으로 어떤 특정 입사각(임계각) 이상으로 빛이 입사되면 굴 절각이 존재하지 않고 입사된 빛이 반사를 하게 되는 현상이 다. 임계각은 보통 굴절각을 계산하는 스넬의 법칙(식(1) 참조) 을 이용하여 알 수 있다. 전반사가 일어나는 조건은 굴절률이 작은 매질에서의 굴절각(θ
2) 이 90
o일 때이다.
n
1·sinθ
1= n
2·sinθ
2(1) 본 SPR 실험에서 굴절률이 큰 매질은 프리즘(n
1= 1.5114) 이 되고, 굴절률이 작은 매질은 샘플이 된다. 따라서, 임계각을 알 면 샘플의 굴절률을 역으로 계산해 낼 수 있고, 두 매질의 굴절 률을 알고 임계각을 알면 역으로 입사각을 알 수 있어 SPR 장 비의 입사각에 대한 보정이 가능하다. 일반적으로 임계각은 Fig.
2(a) 에서처럼 반사도 곡선을 통해 알 수 있다. 임계각은 반사도
곡선에서 Fig. 2(a)의 확대한 영역에서 보듯이 반사광이 급격히 증가하는 지점으로 설정할 수 있다. Fig. 2(a)는 굴절률이 1.5114 인 프리즘에서 Cr(2 nm)/Au(48 nm)의 박막을 경계로 하고 굴절 률이 1.335인 샘플에 대한 반사도 곡선이다(http://corninfo.ps.uci.
edu/calculations.html). 이 때의 임계각은 62.05
o이다. Fig. 2(b)는 Fig. 2(a)의 반사광을 입사각에 대해 1차 미분한 값과 2차 미분 한 값을 나타내었다. Fig. 2(b)에서 보듯이 반사도 곡선을 2차 미분한 값에서 음의 최대값에 해당되는 입사각이 임계각이 됨 을 알 수 있다.
Fig. 3(a) 는 본 연구에 사용된 Fig. 1(a)의 센서 시스템으로 공 기를 굴절률이 작은 매질로 설정하고 임계각 범위에서 측정한 그래프이다. Fig. 3(a) 그래프 안에 표시된 각은 LED 쐐기빔의 중심이 입사하는 각을 나타낸다. 세 각도에서 입사했을 때 보는 바와 같이 전반사가 이루어지는 임계각이 아주 비슷하다는 것 을 알 수 있다. Fig. 3(b)는 LED 쐐기빔의 중심이 44
o로 입사할 때 반사광 강도와 그 반사광 강도를 입사각에 대해 1차 미분한 Fig. 2(a). Calculated reflectance curve of the conventional Au SPR
chip.
Fig. 2(b). Relationship between critical angle and derivatives of the
reflectance curve.
값과 2차 미분한 값을 나타내었다. 임계각은 Fig. 2(b)에서 보듯 이 반사도 곡선의 접선 기울기가 가장 크게 감소할 때이므로 반 사도 곡선을 입사각에 대해 2차 미분하여 최대 음의 값이 나오 는 각을 임계각으로 정하였다. 그 결과 측정을 통해 얻은 임계 각은 41.435
o로 스넬의 법칙을 이용하여 계산한 41.425
o와 아주 근사함을 확인하였다.
3.2 반사광 측정 모드에서 쌍금속 칩의 특성
Fig. 4(a) 는 Cr 2 nm/Ag 25 nm/Au 25 nm(쌍금속 칩) 칩과 일반적인 상용 SPR 칩의 조건인 Cr 2 nm/Au 50 nm(Au 칩) 칩을 이용하여 초정수에 대한 반사도 곡선을 나타내었다. 쌍 금속 칩의 반사도 곡선 선 폭이 Au 칩의 반사도 곡선 선 폭 에 비해 좁다는 것을 Fig. 4(a)을 통해 확인할 수 있다. 따 라서 쌍금속 칩의 반사도 곡선에서 접선의 최대 기울기 크 기(-74.469 %/
o) 가 Au 칩의 반사도 곡선에서 접선의 최대 기
울기 크기(-55.639 %/
o)보다 크다. 따라서 쌍금속 칩의 접선 의 최대 기울기에 해당하는 입사각에 광원을 고정하고 그 때 샘플의 변화에 따른 반사광의 변화를 측정하면 동일한 샘플 변화에 대해 Au 칩의 반사광 변화보다 크게 된다. Fig. 4(b) 는 쌍금속 칩을 이용하여 초정수에서 PBS 용액을 바꾸었을 때의 각각의 반사도 곡선이다. 이 때 초정수에 대한 SPR 센 서 시스템의 반사도 곡선에서 최대 접선 기울기에 해당하는 입사각(65.85
o) 을 구하고, 샘플이 초정수에서 PBS 용액으로 바 뀌었을 때 이 입사각에 해당되는 반사광 강도를 모니터링 하 였다. 이때 반사광 강도의 변화량은 10.568%로 나타났다. 이 는 동일한 샘플 변화와 동일한 측정 방법으로 Au 칩의 반사 광 강도를 모니터링 하였을 때 반사광 변화량(9.270%)보다 크 게 나타났다. 두 구조의 SPR 칩에 대한 반사도 곡선의 특성 과 초정수에서 PBS 용액으로 바뀌었을 때의 공명각의 변화와 반사광 강도의 변화를 Table 1에 나타내었다.
Fig. 3(a). Reflectance curve with respect to air.
Fig. 3(b). Reflectance curve with respect to air at incident angle of 44
oof LED beam and its 1
stand 2
ndderivatives with respect to incident angle
Fig. 4(a). Reflectance curves of the bimetallic (Ag/Au) SPR chip and the Au SPR chip.
Fig. 4(b). Reflectance curves of the bimetallic (Ag/Au) SPR chip
with respect to DI water and PBS solution.
3.3 반사광 측정 모드에서 쌍금속 칩의 특성
쌍금속 칩을 본 SPR센서 시스템에 장착한 후 채널에 PBS 용 액을 주입하여 평형을 이루게 되면 PBS 용액에 용해시킨 BSA 를 낮은 농도인 100 ng/ml 부터 1 μg/ml, 10 μg/ml, 100 μg/ml까 지 각각 500 μl 주입하였다. 두 개의 채널을 이용하여 실험 하 였으며, 한 개의 채널에는 PBS 용액만 주입하여 대조군으로 사 용하였기 때문에 샘플 채널에서 대조군 채널을 빼줌으로써 온도 등 외부 환경에 의한 신호를 제거하였다. PBS 용액을 기준으로 하였을 때 반사도 곡선에서 최대 기울기에 해당되는 입사각에 광을 고정하고 반사광을 측정하면 PBS 일때 48.56741%, BSA 100 ng/ml 주입 후 반사광 강도는 49.04851%, BSA 1 μg/ml 주 입 후 반사광 강도는 49.77255%, BSA 10 μg/ml 주입 후 반사 광 강도는 50.13204%, BSA 100 μg/ml 주입 후 반사광 강도는 51.89831% 로 측정되었다.
그 다음 각각의 BSA 농도에 따른 반사도 곡선을 획득한 후 임계각을 측정하여 각 샘플의 굴절률을 역으로 계산하였다. 100
ng/ml 에서의 굴절률은 1.32242, 1 μg/ml 에서의 굴절률은 1.32292, 10 μg/ml에서의 굴절률은 1.32342, 100 μg/ml에서의 굴절률은 1.32406 이었다.
이 측정값들을 기반으로 굴절률과 반사광 변화량과의 관계를 Fig. 5 에 나타내었다. Fig. 5에 나타난 바와 같이 굴절률과 반사 광 변화량이 선형적으로 변하는 것을 확인할 수 있어 바이오센 서로서 사용가능성을 확인하였다.
4. 결 론
본 연구에서는 상용 Au SPR 칩 재료의 한계를 벗어나 금과 은의 쌍금속 칩을 이용하여 반사광 측정 모드에서 상용 Au 칩 과의 특성을 비교하였다. 또한 SPR반사도 곡선에서 나타나는 임계각을 이용하여 입사광의 입사각에 대한 보정 가능성을 제 시하였고, 역으로 미지의 샘플에 대한 굴절률을 계산할 수 있었 다. 입사각 보정 및 굴절률 계산을 위해서 먼저 공기를 이용한 임계각을 계산하고 실험값과 비교하여 근사값을 도출하였다. 쌍 금속 칩과 Au 칩의 특성 비교를 위해 두 종류 칩의 반사도 곡 선을 얻고 접선의 기울기를 계산하였다. 쌍금속 칩 반사도 곡선 에서 접선의 최대 기울기 크기(-74.469%/
o)가 Au 칩의 반사도 곡선에서 접선의 최대 기울기 크기(-55.639%/
o) 보다 크며, 쌍금 속 칩의 반사도 곡선 선 폭이 Au 칩의 반사도 곡선 선 폭보다 더 좁음을 확인하였다. 또한 동일한 샘플 변화(초정수에서 PBS 용액)에서 최대 기울기 지점 반사광 변화량이 쌍금속 칩(10.568%) 이 Au 칩(9.270%) 보다 큼을 확인하였다. 쌍금속 칩에 BSA 농 도를 100 ng/ml 부터 1 μg/ml, 10 μg/ml, 100 μg/ml까지 주입하 여 반사도 곡선을 획득하고, 임계각으로부터 역으로 굴절률을 계산할 수 있었으며, PBS 용액을 기준으로 최대 기울기 지점에 광원을 고정하고 반사광 변화량을 측정하였다. 굴절률과 반사광 그래프를 통해 선형성을 확인하였다.
감사의 글
This research was supported by Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF) funded by the Ministry of Education (NRF- 2013R1A1A2010028).
REFERENCES
