대한소화기학회지 2007;49:263-266 □ SELECTED SUMMARIES □
요약: S100P는 태반에서 처음으로 추출된 S100 단백질군 의 하나로 췌장암의 90% 이상에서 발현되고 종양 증식 및 전이와 관련되어 있다. 이 연구의 목적은 S100P 기능을 억제 하는 항알레르기 약물인 cromolyn disodium 1,3-bis[(2'-carbo- xylatochromon-5'-μl)oxy]-2-hydroxy-propane의 효과를 알아보 고자 하였다. Cromolyn과 S100P의 상호작용은 drug affinity column과 S100P와 RAGE (receptor for advanced glycation end-products)의 coimmunoprecipitation (복합면역침전법)에 미 치는 cromolyn 효과 등을 평가하여 분석하였다. 그리고 내 인 S100P 활성이 있는 췌장암 세포(BxPC-3, MPanc-96)와 활 성이 없는 췌장암 세포(Panc-1)에서 cell proliferation assay, cell invasion assay, luciferase reporter gene assay 등을 이용하 여 cromolyn이 세포 증식, 전이, nuclear factor-κB (NFκB)의 활성에 미치는 영향을 분석하였다. BxPC-3, MPanc-96, Panc- 1세포를 이용한 orthotopic mouse model (각 군=20 mice)에서 cromolyn (5 mg/kg body weight, 일) 단독 또는 gemcitabine (125 mg/kg body weight, 격주)과 병용투여 군을 비교하여 in vivo에서 종양 증식에 미치는 cromolyn 효과를 평가하였고, 종양 증식은 reporter gene 발현으로 분석하였다. 그 결과 drug affinity chromatography 분석을 통해 S100P는 cromolyn 과 상호작용함을 확인하였고, cromolyn은 S100P와 RAGE의 복합면역침전작용을 억제하였다. In vitro 실험에서 cromolyn (100μM)은 S100P에 의한 Panc-1 췌장암 세포의 증식, 전이, NFκB 활성을 억제하였다. In vivo 실험에서는 cromolyn은 내인 S100P 활성이 있는 췌장암 세포(BxPC-3, MPanc-96) mice 모델에서 종양 증식을 억제하였고 gemcitabine 효과를 증가시켰으나, 내인 S100P 활성이 없는 췌장암 세포(Panc-1) 모델에서는 효과가 없었다. 결론으로 cromolyn은 S100P에 결합하여 RAGE의 활성을 방해하여 종양 성장을 억제하고 실험 췌장암 모델에서 gemcitabine 효과를 증가시켰다.
해설: 췌장암은 5년 생존율이 5% 미만이고, 6개월 이내 에 진단된 환자의 반 이상이 사망하는 가장 치명적인 암의 하나이다. 최근 분자생물학적으로 상당한 연구의 진전이 있 었으나 실제로 과거에 비해 치료성적은 향상되지 못하고 있
다. 췌장암은 조기 절제가 가장 효과적인 치료이지만 수술 이 가능한 환자는 극히 일부이다. 또한, 가장 일반적인 췌장 암의 항함 치료제로 gemcitabine을 이용하나 그 효과는 미미 하고, gemcitabine과 방사선 치료 또는 다른 항암제와의 병 용효과도 결과가 실망스럽다. 이와 같이 현재 사용하는 치 료 반응이 좋지 않기 때문에 최근에는 잘 알려진 발암 기전 을 표적으로 하는 분자생물학적인 치료에 관심이 집중되고 있다. 이러한 예로는 vascular endothelial growth factor receptor, bevacizumab; epidermal growth factor receptor (EGFR), cetuximab; EGFR-activating tyrosine kinase, erlotinib과 gefi- tinib; K-ras, farnesyl transferase inhibitor, tipifarnib 등이 있다.
그러나 이러한 새로운 약제의 초기 임상 실험의 결과는 gemcitabine 표준 치료에 비해 효과가 없거나 미미한 생존 향상만을 보였다.1,2 따라서 새로운 표적을 찾아 약제를 발 견하는 것이 필요하며, 이러한 분자의 기능적인 중요성을 확인하고 작용 기전을 이해하는 것이 중요하다.
S100P는 췌장암,3 유방암,4 폐암5등에서 과발현된다. S100P 는 S100군의 95-아미노산 성분으로 췌장암 세포 성장과 생 존에서 기능적으로 중요한 역할을 하고, S100P의 세포 내 발현 정도가 종양 성장률(in vivo)과 5-fluorouracil 내성(in vitro)에 영향을 준다.6 또한 S100P는 대장암 세포주에서 항 암 치료 내성, 폐암 환자에서는 생존 기간 감소, 그리고 유 방암에서는 전이 증가 및 생존 기간 감소와 관련된 것으로 알려져 있다. 이러한 보고를 종합해 볼 때 S100P 과발현은 종양 성장과 전이를 증가시키고, 환자의 생존 기간을 감소 시킬 수 있다. 따라서 S100P 기능을 억제한다면 췌장암 치 료 반응을 향상시킬 수도 있다.
S100P 작용 기전은 최근 췌장암 세포주를 이용한 연구에 서 밝혀졌는데 췌장암 세포가 S100P를 분비하고 RAGE에 대한 세포 표면 단백질 수용체와 상호작용을 통해 세포외적 으로 작용한다.7 RAGE는 multiligand 수용체로서 advanced glycation end-products, S100 단백질군(S100B, S100A12, S100P), amyloid, amphotericin 등 다양한 분자들과 상호 작용하고, Alzheimer병, 당뇨, 염증반응, 암 등 여러 병적인 질환에도 관여한다.8 S100P에 의한 RAGE 활성은 이차적으로 mito-
M o u s e 모델에서 S 1 0 0 P 와 R A G E , 췌장암 증식과 전이의 상호작용에 미치는 C r o m o l y n 의 효과
( E f f e c t o f C r o m o l y n o n S 1 0 0 P I n t e r a c t i o n s w i t h R A G E a n d P a n c r e a t i c C a n c e r G r o w t h a n d I n v a s i o n i n M o u s e M o d e l s . J N a t l C a n c e r I n s t
2 0 0 6 ; 9 8 : 1 8 0 6 - 1 8 1 8 )
264 대한소화기학회지: 제49권 제4호, 2007
gen-activated protein (MAP) kinase와 NFκB 등 몇몇 세포신 호전달 체계를 활성화시킬 수 있다.7 대부분의 췌장암 세포 에서 기저 NFκB 활성이 증가되어 있고,9 이렇게 증가된 NFκB 활성은 치료 내성을 증가시키므로10 NFκB 신호는 췌장암에서 매우 중요한 역할을 한다. 따라서 RAGE를 활성 화시키는 S100P를 억제한다면 치료 효과를 얻을 수도 있다.
따라서 이번 연구에서는 S100 단백질군(S100A1, S100A12, S100A13)과 특이적으로 결합하는11-13 항알레르기 약물인 cromolyn의 효과를 평가하였다. 그 결과 cromolyn은 S100P 에 결합하여 S100P와 RAGE의 상호작용을 방해함으로써 S100P에 의한 암세포 증식, 생존, 전이 증가를 억제하였고 (in vitro), 내인 S100P 활성이 있는 췌장암 세포주의 기저 NFκB 활성을 감소시켰다(in vitro, in vivo). 이와 같이 cromolyn이 RAGE를 활성화시키는 S100P의 소분자 억제제 로 작용함을 확인하여, mouse 모델에서 cromolyn이 gemcita- bine의 췌장암 세포 억제 효과를 증가시키는 것으로 추정한 다.
Cromolyn은 천식의 예방 치료제로써 널리 사용되고 있는 데 이것은 cromolyn이 비만세포(mast cell)를 안정화시켜 분 비를 억제하기 때문으로 생각하나 정확한 기전은 확실치 않 다. 하나의 기전으로는 Ca2+channel에 관여하여 Ca2+유입 과 비만세포 분비를 억제한다고 제시되었지만, 모든 비만세 포가 cromolyn에 의하여 억제되지 않을 뿐 아니라 cromolyn 억제 효과가 Ca2+에 비의존적이라는 상반된 보고가 있다.
이외에 cromolyn의 표적이 될 수 있는 물질로 moesin, Cl- channel, protein kinase C, nucleotide diphosphate kinase 등이 제시되었으나 cromolyn이 세포에 비투과적이기 때문에 이러 한 물질의 생물학적인 활동을 설명하기는 어렵다. 최근 cromolyn은 S100군에 속하는 Ca2+결합 분자에 친화력이 높 은 것으로 밝혀졌다. 비록 cromolyn과 S100분자의 상호작용 이 비만세포에 영향을 주는지는 확실치 않지만, 이러한 상 호작용이 이번 연구 결과처럼 cromolyn이 췌장암에 미치는 효과를 일부 설명할 수 있을 것이다. 종양에서 cromolyn의 효과는 cromolyn이 유방암 동물모델에서 혈액응고를 증가시 키고 저산소증을 증가시킨다는 보고13와 백서에서 발암물질 의 종양 유발을 억제시킨다는 보고가 있다.14 두 보고 모두 cromolyn 항암효과는 비만세포 억제효과 때문으로 추정하였 으나, 비만세포 역할이나 cromolyn이 비만세포 기능을 억제 한다는 직접적인 증거는 제시하지 못하였다. 하지만 이번 연구에서 cromolyn이 S100P 단백질과 상호 작용하여 암을 억제한다는 사실을 새롭게 제시하였다.
S100분자는 소분자량(9-12 kDa)의 calcium 결합 단백질군 으로 30-50%의 homology가 있다. S100군은 19가지 이상으 로 구성되어 있고 대부분 chromosome 1q21에 위치하나, S100P는 4q16에 위치해 있다. Cromolyn은 S100 단백질 A1,
B, A12, A13에 각각 결합할 뿐 아니라11-13 이번 연구에서처 럼 S100P와도 결합하는데 이는 cromolyn이 각각의 S100군 에서 공통 구조에 결합하기 때문으로 추정한다. S100 단백 질은 다양한 세포 반응에 관여하는데 염증 반응15뿐 아니라 여러 종양에서 발현되기 때문에3,5,16 암에서 S100 단백질의 열할에 대한 관심이 증대되고 있다. 몇몇 S100 단백질 발현 이 췌장종양에서 관찰되었는데5,17 S100 단백질 A2, A4, A5, A6, A9, A10, A11, A13, A14 등은 췌장암과 만성췌장염 환 자에서 모두 발현되는 반면 S100P는 췌장암에서만 높게 발 현된다.3몇 가지 형태의 S100 단백질이 췌장암 세포에서 발 현되기 때문에 다른 S100 단백질도 췌장암 세포에서 분비 되어 종양 증식과 생존에 자가조절 형태로 관여할 가능성도 배제할 수는 없다. 저자 등은 이전 실험에서 S100P를 silencing했을 때 확연하게 종양 증식, 생존, 전이로 억제하 였고(in vitro) mouse에서도 종양 증식을 억제함을 보고하였 다(in vivo).6 그러므로 이번 연구 결과에서 보이는 항암효과 는 cromolyn이 S100P에 결합하여 활성을 억제함으로써 나타 난다고 설명할 수 있다. 췌장암 세포에 미치는 cromolyn의 주된 효과가 S100P와 상호 작용에 의한다는 증거는 첫째, cromolyn은 외부에서 투여한 S100P이 췌장암 세포에 미치는 영향을 억제하였지만 PDGF나 serum의 경우에는 이러한 효 과가 없었다. 둘째, cromolyn은 내인 S100P 발현이 높은 췌 장암 세포(BxPC-3, MPanc- 96)에서 종양 성장, 전이, NFκB promoter 활성 및 세포독성약제의 내성을 억제하고(in vitro), 종양 증식과 gemcitabine 내성을 억제하였으나(in vivo), S100P 발현이 없는 췌장암 세포(Panc-1)에서는 in vitro와 in vivo 모두 세포 기능과 종양 성장에 어떠한 효과도 없었다.
셋째, cromolyn은 NIH3T3 세포처럼 췌장암 세포주 이외의 S100P 결핍 세포에서도 종양 성장과 전이에 효과가 없었다.
따라서 cromolyn이 S100P 이외에 다른 표적이 있을지라도 S100P가 췌장암과 관련된 중요한 표적이다. S100P는 RAGE 활성에 의해 중재되는데, 특히 short- peptide RAGE 길항제 나 anti-RAGE antibody를 억제하면 S100P와 RAGE의 상호작 용과 S100P에 의한 세포기능 자극을 억제함이 밝혀졌다.7 이번 연구에서도 S100P와 RAGE 복합체의 상호면역침전물 감소를 통해 cromolyn이 S100P와 RAGE의 상호작용을 방해 한다는 사실을 확인하였다. 또한 cromolyn은 RAGE 활성을 억제하는 다른 방법과 유사하게 S100P의 기능을 특이적으 로 강력하게 억제하여 cromolyn의 췌장암 억제효과는 S100P 에 의한 RAGE활성 억제가 중요한 기전임을 알 수 있었다.
NFκB 활성도는 대부분의 췌장암에서 상승되어 있으며9 항세포사멸 신호(antiapototic singnaling)를 중재하기 때문에 NFκB 억제는 췌장암 세포에서 세포 독성 약물 효과를 증 대시킨다.18 이번 연구에서도 Panc-1 세포에서 외부에서 투 여한 S100P 용량에 비례해서 NFκB 활성이 증가하였고,
서정훈. Mouse 모델에서 S100P와 RAGE, 췌장암 증식과 전이의 상호작용에 미치는 Cromolyn의 효과 265
cromolyn은 S100P에 의한 NFκB 활성 증가를 완전히 억제 하였다. 또한 bioluminescence imaging을 이용하여 내인 S100P 활성이 높은 BxPC-3 췌장암 세포에서 cromolyn이 기 저 NFκB 활성을 억제함을 확인하였다(in vitro, in vivo). 이 러한 결과는 췌장암 세포에서 NFκB 활성을 감소시키는 치 료의 효율성을 보여주는 첫 in vivo 실험이었다. Cromolyn이 gemcitabine과 같은 세포 독성 항암제 치료의 효율성을 증가 시킬 수 있는 것은 아마도 기저 NFκB 활성을 억제시킬 수 있는 것과 관련이 있을 수 있다. 그러나 cromolyn의 항암효 과에서 NFκB 활성 억제 역할을 규명하려는 노력이 추가로 필요하다. S100P는 암세포 증식에 대한 효과뿐 아니라 암전 이에서도 중요한 역할을 할 수 있다. 이전 보고에서 siRNA 로 S100P를 silencing했을 때 in vivo와 in vitro 실험 모두에 서 암전이를 억제하였고,6 유방암에서도 S100P 활성은 암전 이뿐 아니라 환자의 생존 감소와 관련되었을 뿐 아니라 유 방암 세포주에 S100P를 유전적으로 주입한 동물실험에서 전이를 획기적으로 유도하였다.4 이번 연구에서도 cromolyn 은 내인 S100P를 발현하는 췌장암 세포주의 전이를 억제하 였고(in vitro), orthotopic tumor model에서도 원격 전이된 종 양의 부피를 현격히 감소시켰을 뿐 아니라 gemcitabine에 의 한 종양 부피 감소 효율성을 증가시켰다. 그러나 cromolyn 이 암전이 수에는 유의한 효과를 보이지는 못하였기 때문에 암전이보다는 주로 원발부위의 암세포 증식을 억제하는 것 으로 추정되나 추후 추가 실험이 필요하다.
이번 연구는 몇 가지 제한점이 있는데, 그중 하나는 cro- molyn의 특이도이다. Cromolyn이 S100P와 RAGE의 상호작 용을 억제하였으나(in vitro), in vivo에서 다른 중요한 표적이 있을 가능성도 있다. 췌장암 세포가 S100P를 분비하고 cro- molyn이 종양 미세환경에서 다른 세포와 S100P의 상호작용 을 억제할 수도 있고, 또한 cromlyn이 다른 분자, 즉 S100군 의 다른 구성원 또는 확인되지 않은 표적과 상호작용 할 수 있다. 또 다른 제한점은 in vivo에서 종양 증식의 평가인데 임상적으로 유용하기 위해서는 기존 종양의 성장을 억제하 여야만 한다. 따라서 향후 cromolyn 단독 치료가 종양의 크 기를 줄일 수 있는지 여부와 병용요법에서 cromolyn이 gemcitabine과 다른 항암제의 효과를 증가시킬 수 있는지에 대해 추가 연구가 필요하다.
결론으로 S100P는 췌장암의 침습적인 특성과 관련된 중 요한 인자이고, 항알레르기 약물인 cromolyn이 S100P와 결 합하여 RAGE를 활성화를 억제하여 세포와 동물실험에서 효과를 보였다. 또한 췌장암 동물모델에서 cromolyn은 gem- citabine과 병용치료 시 췌장암 성장과 전이를 강력히 억제 하였다. 그러나 cromolyn과 gemcitabine의 병용치료가 예후 가 불량한 췌장암 환자의 치료 성적을 향상시킬 수 있는지 는 향후 추가 연구가 필요하다.
(정리: 국민건강보험공단 일산병원 내과 서정훈)
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