http://dx.doi.org/10.9721/KJFST.2013.45.1.1
1
©The Korean Society of Food Science and Technology
16S rRNA를 이용한 다금바리, 자바리, 능성어 판별법 개발
박용춘*·정용현
1·김미라·신준호·김규헌·이재황·조태용·이화정·이상재·한상배
식품의약품안전청 식품의약품안전평가원 식품위해평가부 식품감시과학팀, 1식품의약품안전청 식품기준과
Development of Detection Method for
Niphon spinosus, Epinephelus bruneus,
and
Epinephelus septemfasciatus using 16S rRNA Gene
Yong-Chjun Park*, Yong-Hyun Jung1, Mi-Ra Kim, Joon-Ho Shin, Kyu-Heon Kim, Jae-Hwang Lee, Tae-Yong Cho, Hwa-Jung Lee, Sang-Jae Lee, and Sang-Bae Han
Scientific Food Investigation Team, Food Safety Evaluation Department, National Institute of Food & Drug Safety Evaluation, Food & Drug Administration
1Food Standardization Division, Food & Drug Administration
Abstract Niphon spinosus, Epinephelus bruneus, and Epinephelus septemfasciatus are involved in the Perciformes Order and Serranidae Family. When E. bruneus and E. septemfasciatus are fully grown, the striped pattern on the body gradually disappears. Therefore, morphological classification of adult fishes is quite difficult to identify the differences to N. spinosus. In this study, we investigate the method to differentiate those using PCR. To design the primers, 16S rRNA region of N. spinosus, E. bruneus, and E. septemfasciatus registered in the GeneBank (www.ncbi.nlm.nih.gov) have been used and for the analysis, Bio Edit ver. 7.0.9.0 was used. As a result, it was design NS-003-F/NS-005-R (136 bp), EB-001-F/EB-002-R (181 bp), and ES-001-F/ES-001-EB-001-F/EB-002-R (123 bp) primers for the differentiation of each 3 different fishes. Therefore, the species-specific primer sets would be a useful tool for scientific and speedy differentiation against the illegal distribution for consumer protection.
Keywords: Niphon spinosus, Epinephelus bruneus, Epinephelus septemfasciatus, PCR (Polymerase Chain Reaction), species-specific primer, 16S rRNA
서
론
값싼 식품원료를 사용하거나 표시사항을 허위로 기재하여 소 비자를 기만하는 경우가 많아 소비자는 식품에 대한 막연한 불 안감이 높아지고 있다. 가짜식품(EMA, economically motivated adulteration)이란 경제적 이득을 취하기 위하여 제조된 식품을 일 반적으로 말한다. 가짜식품은 경우에 따라 우리의 건강을 위협할 뿐 아니라 건전한 식품유통 질서를 어지럽히는 주범으로 우리나 라에서도 외국처럼 이들 식품에 대한 관리, 감독을 강화해 나가 야 할 시점이다. 미국 식품의약품청(FDA, Food and Drug Admin-istration), 영국 식품기준청(FSA, Food Standards Agency), 캐나다 국경관리청(CBSA, Canada Border Services Agency)에서도 최근에 늘어나는 가짜식품, 가짜 의약품, 가짜 화장품 등에 대한 관리를 강화하고 있다(1-3). 국내·외의 주요 사례로는 돼지고기에 소고 기 향을 첨가한 소고기 장조림, 메기내장을 사용한 창난젓, 무게
를 늘리기 위하여 양파 또는 무를 혼합한 다진마늘, 틸라피아를 이용한 도미초밥, 옥수수기름을 혼합한 참기름 등이 대표적이다. 다금바리(Niphon spinosus), 자바리(Epinephelus bruneus) 및 능성 어(Epinephelus septemfasciatus)는 농어목(Perciformes order) 바리 과(Serranidae family)에 속하며 다금바리의 경우 제주도 남방해 역에서 주로 서식하며 제주도에서는 매우 인기가 높고 고가로 판 매되고 있는 어종이다(4). 다금바리와 자바리의 경우 미성숙어일 경우 주둥아리, 꼬리지느러미, 몸통의 무늬 등에서 차이점이 있 지만 성어로 되면서 이러한 특징들이 서서히 희미해져서 육안으 로 관찰이 어려울 수도 있다. 그리고 자바리의 경우 제주도에서 는 방언으로 다금바리로 부르고 있으며(5,6), 능성어와 함께 종종 다금바리로 유통되고 있어 사회적인 문제가 되기도 하였다. 또한 일반인들은 상기 어종에 대하여 육안으로 관찰한 경험이 부족하 고 횟감으로 제공할 경우에는 더더욱 감별하기 어려운 점이 있 어 유사어종을 다금바리로 제공하여 부당이득을 취하는 유통업 자가 있다. 가짜식품의 경우 식품위생법 제 42조 품질관리 및 보 고(7)에 의한 “품목제조보고관리대장”을 확인하는 서류검토, 관능 및 육안 분석 등에 의하여 사용원료의 진위여부를 확인할 수 있 으나 과학적이고 객관적인 시험법의 개발이 요구된다. 따라서 육 안으로 원재료를 확인할 수 없거나 의도적으로 소량의 원료를 혼 입하여 제조된 식품에 대하여 사용원료를 확인하는 방법에는 이 화학적 분석법, 단백질분석법, 유전자를 대상으로 하는 분석법 등 이 있다. 이화학적인 분석법으로는 광합성의 대사경로에 따른 탄 소동위원소비율 분석법을 활용한 벌꿀의 진위판별(8,9), 분자량이 *Corresponding author: Yong-Chjun Park, Scientific Food
Investi-gation Team, Food Safety Evaluation Department, National Institute of Food & Drug Safety Evaluation, Food and Drug Administration, Cheongwon, Chungbuk 363-700, Korea
Tel: 82-43-719-4454 Fax: 82-43-719-4450 E-mail: [email protected]
Received July 3, 2012; revised November 16, 2012; accepted December 17, 2012
2 한국식품과학회지 제 45 권 제 1 호 (2013) 적은 ion-fragment의 패턴차이를 이용하여 비교분석하는 MS-전자 코 분석법(10,11) 등이 있으며, 단백질분석법은 면역학적 방법(12) 이 주로 이용되고 있다. 유전자는 모든 동물 및 식물의 조직 내 에 존재하며 식품 제조 공정 중 처리되는 압력, 고열 등에 대하 여 단백질 보다 안정성이 높은 장점이 있다. 또한 PCR에 의하여 일부 유전자를 특이적으로 증폭시키는 방법은 신속성, 간편성, 민 감도, 특이도 등이 우수하여 최근에는 식품원료 동정을 위하여 많은 연구가 진행되고 있다(13-16). 종 판별을 위한 유전자 분석 법에는 일반프라이머(universal primer)를 이용하여 증폭 후 염기 서열을 결정하고 유전자은행(www.ncbi.nlm.nih.gov 등)에 등록되 어있는 염기서열과 비교하여 종을 판별하는 방법(17,18)과 종 특 이 프라이머(species-specific primer)를 개발하여 유전자 증폭 유 무로 종을 판별하는 방법(14)이 있다. 일반프라이머를 이용하는 경우에는 대부분 PCR 산물의 크기가 650 bp 이상으로 되어 있 어 가공식품에 적용하기에는 한계가 있는 단점이 있어 종 특이 프라이머를 이용하는 방법을 개발하였다. 따라서 본 연구에서는 종 특이 프라이머를 이용한 다금바리, 자바리, 능성어를 판별하기 위한 최적의 프라이머와 PCR 조건을 확립하였으며, 확립된 시험법은 자바리, 능성어로부터 다금바리 를 판별하여 건전한 식품유통 질서를 확립하고 소비자를 보호하 는 식품안전관리에 활용할 수 있을 것으로 기대된다.
재료 및 방법
시약 및 검체 구입유전자증폭(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 위한 프라이머 및 Taq DNA polymerase는 바이오니아(Bioneer, Daejeon, Korea) 에 의뢰하여 합성 또는 구매하였다. PCR 장비는 GeneAmpTM
PCR System 9700(Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA)을 사용하였으며, 유전자 추출은 DNeasy Blood & Tissue kit(Qiagen GmbH, Hilden, Germany)를 사용하였다. 표준시료인 다금바리(N. spinosus) 및 자바리(E. bruneus)는 제주대학교(해양의생명과학부) 로부터 분양받았으며, 능성어(E. septemfasciatus), 참돔(Pagrus major) 및 우럭(Sebastes hubbsi)은 수산시장에서 직접 구입하였다. 유전자 추출
DNeasy Blood & Tissue kit를 사용하여 유전자를 추출하였으 며 추출방법은 제조사에서 제공하는 방법에 따랐으며 최종 용출 단계에서는 AE 완충용액 대신 멸균증류수를 사용하여 용출하였다 종 특이 프라이머 설계
미국 국립보건원에서 운영하는 유전자은행(www.ncbi.nlm.nih.gov) 에 등록되어있는 다금바리(Accession No. AY947575), 자바리 (Accession No. JN603832), 능성어(Accession No. AY947559), 우 럭(Accession No. DQ678295) 등의 16S ribosomal RNA부위에 대한 염기서열을 대상으로 하였으며 비교 및 분석에는 소프트웨 어인 BioEdit ver. 7.0.9.0 프로그램을 사용하였다.
Polymerase Chain Reaction(PCR) 반응액 조성 및 반응조건 PCR을 위한 반응액의 조성은 주형 DNA 50 ng, dNTPs 200 µM, MgCl2 2.5 mM, 프라이머 각 0.5 µM이 되게 혼합하였으며 최종 용량은 20 µL로 하였다. 다금바리 판별을 위한 PCR 반응조 건은 95oC에서 5분 예비가열 후, 95oC 30초 변성, 57oC 30초 재 결합, 72oC 30초 중합반응 등의 과정을 35회 반복하고 마지막에 72oC에서 7분간 처리하였으며, 자바리 및 능성어 판별 조건은 95oC에서 5분 예비가열 후, 95oC 30초 변성, 60oC 30초 재결합, 72oC 30초 중합반응 등의 과정을 35회 반복하고 마지막에 72oC 에서 7분간 처리하였다. 결과확인 최종산물의 확인은 반응액 3 µL를 취하여 아가로즈 젤로 100 V, 30분간 전기영동하고 EtBr로 염색(1 µg/mL)한 후 UV투영기를 이 용하여 확인하였다.
결과 및 고찰
종 특이 프라이머 설계 다금바리 등의 종 특이 프라이머를 설계하기 위하여 유전자은행 에 등록되어 있는 다금바리(N. spinosus, Accession No. AY947575), 자바리(E. bruneus, Accession No. JN603832), 능성어(E. septem-fasciatus, Accession No. AY947559), 우럭(S. hubbsi, Accession No. DQ678295)의 16S DNA 염기서열을 이용하였다. 다금바리에 대한 특이 프라이머를 설계하기 위하여 정방향 3종(001-F, NS-002-F 및 003-F)과 역방향 3종(003-R, 004-R 및 NS-005-R)을 설계하여 총 8종류(003-R, NS-001-F/NS-004-R, NS-001-F/NS-005-R, 003-R, NS-002-F/NS-004-R, NS-002-F/NS-005-R, NS-002-F/NS-004-R, NS-003-F/NS-005-R)의 조합이 이루어지도록 하였다(Fig. 1). 자바리의 경우에 도 다금바리와 유사한 방법을 통하여 정방향 2종(EB-001-F 및 EB-002-F)과 역방향 2종(EB-002-R 및 EB-003-R)을 설계하여 총 3종류(EB-001-F/EB-002-R, EB-001-F/EB-003-R 및 EB-002-F/EB-003-R)의 조합이 이루어지도록 하였다(Fig. 2). 능성어에 대하여 는 1종류(ES-001-F/ES-001-R)의 프라이머를 설계 하였으며(Fig. 3), 설계된 프라이머에 대한 정보는 Table 1에 기술하였다. 그리고 가 공식품에 대하여 적용이 가능하도록 하기 위하여 PCR 산물의 크 기는 가급적으로 200 bp 이내가 되도록 설계하였다. 다금바리 판별법 다금바리는 제주도에서 매우 고가로 판매되는 어종의 일종이 며 자바리와 능성어도 비교적 고가로 판매되고 있으나, 일부 유 통 또는 판매업자는 자바리와 능성어를 다금바리로 유통시키고 있다. 형태적으로 보면 자바리와 능성어는 몸체부분에 선명한 무 늬가 있어 일반적으로 육안으로 종을 판별할 수 있다. 또한, 다 금바리와 자바리는 꼬리지느러미의 형태(다금바리는 꼬리지느러 미가 움푹 들어가 있으며, 자바리는 부채꼴 모양) 및 머리부분의 주상악골의 차이점(다금바리의 경우 좁은 삼각형 모양이며 입이 뾰족하지만 자바리는 둥글며 입도 둥근 모양임)이 있어 육안 감 별이 어렵지 않다(4-6). 그러나 자바리 및 능성어의 경우 성어가 되면 몸체부분의 무늬가 점차적으로 없어져 구별이 용이하지 않 으며(4), 횟감으로 제공되는 경우에는 육안감별이 매우 어렵다. 또한 자바리는 제주도에서는 다금바리라는 명칭을 사용하고 있 고 자바리는 양식이 가능하지만 다금바리의 경우 양식이 어렵고 심해성 어류라 고기잡이가 어려워 실질적으로 제주도 지역에서 횟감으로 제공되는 다금바리는 대부분이 자바리라는 의견도 있 다. 따라서 본 연구에서는 다금바리로 유통가능성이 높은 어종인 자바리와 능성어를 판별하는 시험법을 개발하게 되었다. 다금바리에 대한 종 특이 프라이머를 개발하기 위하여 1차적 으로 다금바리, 자바리 및 능성어의 16S 유전자를 대상으로 프 라이머를 설계하였으며 설계된 프라이머를 이용하여 다금바리, 자바리, 능성어를 대상으로 PCR을 수행하였다. 그 결과 모든 프라이머에서 다금바리는 명확하게 PCR 산물이 생성되었으나 자 바리와 능성어에서는 미약한 비 특이적 밴드가 형성되는 경우도 있었다. 그리고 일반적으로 횟감으로 많이 섭취하는 우럭과 참돔 을 대상으로 동일한 실험을 실시한 결과 우럭에서 비슷한 위치 에서 지속적으로 밴드가 형성되었다. 그래서 우럭의 16S 유전자 를 분석한 결과 다금바리는 자바리와 능성어에 비하여 오히려 우 럭과의 상동성이 비교적 높은 것을 확인하였다(Fig. 1). 따라서 다 금바리, 자바리, 능성어 및 우럭의 16S 유전자를 대상으로 비교· 분석하여 총 8종류의 프라이머를 재설계하였다. 설계된 프라이머 를 이용하여 다금바리 등 5종을 대상으로 PCR을 수행한 결과 비 특이적 밴드가 형성되지 않고 우럭에서도 동일위치에서 밴드가 형성되지 않는 프라이머인 NS-003-F/NS-005-R(136 bp)을 최종 선 정하였으며 PCR 조건을 확립하였다(Fig. 4).
Fig. 1. Nucleotide alignment and primer information designed from 16S gene of N. spinosus (Accession No. AY947575), E. bruneus (Accession No. JN603832), E. septemfasciatus(Accession No. AY947559), S. hubbsi (Accession No. DQ678295) for detection of N. spinosus. The underline and italic sequence indicate designed primer site. For more detailed contents of primer see the Table 1.
4 한국식품과학회지 제 45 권 제 1 호 (2013) 자바리 및 능성어 판별법 자바리 판별을 위한 프라이머는 총 2종을 설계하였으며, 자바 리 등 5종의 어종을 대상으로 적용성을 검토하였다. 그 결과 EB-002-F/EB-003-R(149 bp) 보다는 EB-001-F/EB-002-R(181 bp) 프라 이머가 비 특이적 밴드가 없이 자바리만 검출할 수 있는 프라이 머로 최종 선정하였다(Fig. 4). 능성어의 경우 염기서열의 비교분 석을 통하여 프라이머를 설계하는 위치가 매우 제한적이었다. 즉 상동성이 비교적 높고 설계를 위한 부위는 2곳으로 압축되어 1 Fig. 2. Nucleotide alignment and primer information designed from 16S gene of E. bruneus (Accession No. JN603832), N. spinosus (Accession No. AY947575), and E. septemfasciatus (Accession No. AY947559) for detection of E. bruneus. The underline and italic sequence indicate designed primer site. For more detailed contents of primer see the Table 1.
종류의 프라이머(ES-001-F/ES-001-R) 만을 설계하였다. 그러나 비 교종과의 적용성을 검토한 결과 다금바리, 자바리, 우럭, 참돔에 서는 비 특이적 밴드가 전혀 형성되지 않고 능성어에서만 123 bp 의 PCR 산물이 생성되는 것을 확인하였다(Fig. 4).
요
약
다금바리, 자바리 및 능성어는 농어목(Perciformes Order) 바리 과(Serranidae Family)에 속하며, 고급횟감으로 인기가 높은 어종 Fig. 3. Nucleotide alignment and primer information designed from 16S gene of E. septemfasciatus (Accession No. AY947559), N. spinosus (Accession No. AY947575), and E. bruneus (Accession No. JN603832) for detection of E. septemfasciatus. The underline and italic sequence indicate designed primer site. For more detailed contents of primer see the Table 1.6 한국식품과학회지 제 45 권 제 1 호 (2013) 이다. 자바리 및 능성어의 경우 몸통부분에 줄무늬가 선명하게 있으나 성어가 되면서 점차 불분명해지는 특징이 있어 무늬의 유 무로 인하여 다금바리와 구별하기는 쉽지 않다. 또한 자바리는 제주도에서 다금바리라는 명칭으로 불리고 있으며, 일부 유통업 자들이 자바리 및 능성어를 다금바리로 유통시키는 사례가 있어 종 특이 프라이머를 이용한 판별법을 마련하게 되었다. 종 특이 프라이머를 설계하기 위하여 유전자은행(www.ncbi.nlm.nih.gov)에 등록되어있는 다금바리(Accession No. AY947575), 자바리(Acces-sion No. JN603832), 능성어(Accession No. AY947559), 우럭 (Accession No. DQ678295) 등의 16S DNA부위의 염기서열을 대 상으로 하였으며 비교 및 분석에는 소프트웨어인 BioEdit ver. 7.0.9.0 프로그램을 사용하였다. 그 결과 다금바리, 자바리, 능성 어를 판별할 수 있는 각각의 NS-003-F/NS-005-R(136 bp), EB-001-F/EB-002-R(181 bp), ES-001-F/ES-001-R(123 bp) 프라이머를 개발하였으며, PCR 조건을 확립하였다. 또한 적용성 검토를 위 하여 우럭, 참돔을 대상으로 실시한 결과 비 특이적 밴드가 형성 되지 않는 것을 확인하였다. 따라서 본 연구에서 개발된 다금바 리 등에 대한 판별법은 시중에 불법적으로 유통 가능성이 있는 제품을 신속하고 과학적으로 판별할 수 있어 식품안전관리에 활 용도가 매우 클 것으로 기대된다.
감사의 글
본 연구는 식품의약품안전평가원 2012년도 연구개발사업지원비 (12161소비연114)에 의해 수행되었으며, 다금바리 및 자바리의 표 준시료를 제공하여주신 송춘복 교수님(제주대학교)에게 감사드립니다.문
헌
1. Food and Drug Administration. Food Safety. Available from: http://www.fda.gov/Food/FoodSafety/default.htm. Accessed July 3, 2002.
2. Food Standards Agency. Food Fraud. Available from: http:// www.food.gov.uk. Accessed July 3, 2002.
3. Canada Border Services Agency. CBSA lays charges in immigra-tion fraud case. Available from: http://cbsa-asfc.gc.ca. Accessed July 3, 2002.
4. National Fisheries Research and Development Institute. Ocean life. Available from: http://portal.nfrid.re.kr. Accessed July 3, 2002.
5. Myoung JG, Kim BI, Lee SM, Jeon GB. The Sea Fishes of Korea. Yejowon Press, Seoul, Korea. pp. 114-115 (2010)
6. Kim IS, Choi Y, Lee CL, Lee YJ, Kim BJ, Kim JH. Illustrated Book of Korean Fishes. Kyohaksa Press, Seoul, Korea. pp. 280-284 (2005)
7. Ministry of Health and Welfare. Food Sanitation Act, Imoon Giup Press, Seoul, Korea. pp. 162-163 (2012)
8. Padovan GJ, Jong D, Rodrigues LP, Marchini JS. Detection of adulteration of commercial honey samples by the 13C/12C iso-tope ratio. Food Chem. 82: 633-636 (2003)
9. Schellenberg A, Chmielus S, Schlicht C, Camin F, Perini M, Bontempo L, Heinrich K, Kelly SD, Rossmann A, Thomas F, Jamin E, Horacek M. Multielement stable isotope ratio (H, C, N, S) of honey from different european regions. Food Chem. 121: 770-777 (2010)
10. Hong EJ, Kim KH, Park SJ, Kang JW, Kim DS, Lee HJ, Kim EJ, Lee JW, Kim SH, Lee KH, Noh BS. Discrimination of the salted cuttle fish and the salted mitra squid in economically moti-vated authentication food using electronic nose based on mass spectrometer. Food Eng. Prog. 15: 122-129 (2011)
Fig. 4. PCR results from various fishes by PCR using N. spinosus-specific (A), E. bruneus-specific (B), and E. septemfasciatus-specific primer (C). Lane 1; N. spinosus, 2; E. bruneus, 3; E. septemfasciatus, 4; P. major, 5; S. hubbsi
Table 1. Species-specific primer for detection of N. spinosus, E. bruneus, and E. septemfasciatus
Target region Primer Primer Sequence (5'→ 3') Length (bp) Remarks
16S DNA NS-001-F gcctg ccctg tgact atta 1F/3R : 272 1F/4R : 325 1F/5R : 375 2F/3R : 123 2F/4R : 176 2F/5R : 226 3F/4R : 860 3F/5R : 136 for N. spinosus NS-002-F gtgca gaagc gggaa tataa c
NS-003-F ggacc aaacc aaatg agt NS-003-R aagac attag ggcag ga
ggtgt tccca ttcca c NS-004-R
ggtca gaaat tctgt tgac NS-005-R
EB-001-F gcgcaatcac ttgtc tttta aata
1F/2R : 181
2F/3R : 149 for E. bruneus EB-002-R atgtt caggg tatta atgc
EB-002-F gcatt aatac cctga acat EB-003-R gttct gttaa ttaga gctgt ca ES-001-F catcc ccaac aacag gacat
1F/1R : 123 for E. septemfasciatus ES-001-R tcgct cttgg ttgtg aatgt t
11. Hong EJ, Kim KW, Park SJ, Kim JE, Kim DS, Lee HJ, Kim EJ, Lee JH, Lee KH, Noh BS. Discrimination of shreds of frozen and dried alaska pollack, dried pollack and cod using electronic nose. Food Eng. Prog. 15: 162-168 (2011)
12. Anguita G, Martin R, Garci T, Morales P, Haza AI. Immunostick ELISA for detection of cow’s milk in Ewe’s milk and cheese using a monoclonal antibody against β-casein. J. Food Protect. 59: 436-437 (1996)
13. Fabrice T, Celia M, Catherine H. Food and forensic molecular identification: update and challenges. Trends in Biotechnol. 23: 359-366 (2005)
14. Folmer O, Black M, Hoeh W, Lutz R, Vrijenhoek R. DNA prim-ers for amplification of mitochondrial cytochrome C oxidase sub-unit I from diverse metazoan invertebrates. Mol. Mar. Biol.
Biotech. 3: 294-299 (1994)
15. Wang HY, Tsai MP, Tu MC, Lee SC. Universal primers for amplification of the complete mitochondrial 12S rRNA gene in vertebrates. Zool. Stud. 39: 61-66 (2000)
16. Park YC, Ahn CY, Jin SO, Kim KH, Lee JH, Cho TY, Lee HJ, Park KS, Yoon HS. Identification of raw materials in processed meat products by PCR using species-specific primer. J. Fd. Hyg. Safety 27: 68-73 (2012)
17. Hebert PDN, Cywinska A, Ball SL, deWaard JR. Biological iden-tifications through DNA barcodes. Proc. R. Soc. Lond. B. 270: 313-321 (2003)
18. Michael TM, Michael B, Gregory TR, Vogler AP. DNA-based species delineation in tropical beetles using mitochondrial and nuclear markers. Phil. Trans R. Soc. B. 360: 1925-1933 (2005)
