Effect of Sopung-tang on Glutamate-Induced Apoptosis in C6 Glial Cells

疎風湯이 Glutamate에 의한 C6 Glial Cell의 Apoptosis에 미치는 영향

정승원¹․최철원²․김봉상¹․문병순^1,2*

1 : 원광대학교 한의학전문대학원 제3의학과, 2 : 원광대학교 한의과대학 내과학교실

Effect of Sopung-tang on Glutamate-Induced Apoptosis in C6 Glial Cells

Seung Won Jeong¹, Chul Won Choi², Bong Sang Kim¹, Byung Soon Moon^1,2*

1 : Department of Third Medicine, Professional Graduate School of Oriental Medicine, Wonkwang University, 2 : Department of Internal Medicine, School of Oriental Medicine, Wonkwang University

The water extract of Sopung-tang(SPT) has been traditionally used for treatment of psycologic disease and brain damage in oriental medicine. However, little is known about the mechanism by which the water extract of SPT rescues cells from these disease. Therefore, this study was designed to investigate the effect of SPT on the glutamate-induced toxicity of rat C6 glial cells. SPT have protective effects in glutamate-induced toxicity, which was revealed as apoptosis characterized by chromatic condensation and fragmentation and the loss of mitochondrial membrane potential in C6 glial cells. Also, SPT have inhibited the active form of caspase-3 and PARP and significantly protected the apoptotic phenomena by glutamate toxicity in C6 glial cells. However, SPT significantly recovered the depletion of GSH and inhibited the generation of ROS by glutamate in C6 glial cells. In addition, both SPT and antioxidants such as GSH and NAC protected the glutamate-induced cytotoxicity in C6 glial cells, indicating that SPT possibly have antioxidative effect. Specially, SPT were showed transcriptional factor significantly increased the activation of NF-κB using the analysis of NF-κB luciferase reporter system in C6 glial cells. These NF-κB activation protected cells from glutamate-induced toxicity to generate the heme oxygenase-1(HO-1). Taken together, we suggest that SPT have protective effects in glutamate-induced toxicity via a antioxidative mechanism.

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Key words : glutamate, apoptosis, glial cell, Sopung-tang(SPT)

* 교신저자 : 문병순, 전북 익산시 신용동 344-2 원광대학교 익산한방병원

․E-mail : [email protected], ․Tel : 063-859-2802

․접수 : 2008/08/29 ․수정 : 2008/10/10 ․채택 : 2008/10/21

서 론

疎風湯은 明代 龔廷賢의 《萬病回春》에 “治風中府 手足不 仁 先宜解表 後用愈風湯 調理” ¹⁾ 로 최초로 수록된 이후 《濟衆新 編》에 “治風中府, 手足不仁 先宜解表” ²⁾ , 《診療要鑑》에 “마땅 히 痰을 疏割시키고, 火를 寫해야 되는 것인데, 割痰에는 疎風湯 을 쓴다” ³⁾ , 《東醫寶鑑》에 “中腑 手足不仁” ⁴⁾ 등 여러 醫書에 인 용되고 中風 初期의 中腑證에 활용되어온 처방으로, “治風中在 腑 惡風寒 拘急不仁 先用此解表”라 하여 中風 初期 中腑證에 활

용되어 왔다 ⁵⁾ . 최근에는 疎風湯이 혈관이완효과와 혈관확장에 의한 혈류량증가 및 혈압강하효과가 있으므로 심혈관계의 혈액 순환장애를 개선시키고 혈전증을 예방하는데 사용할 수 있으며

6) , 고지혈증으로 인한 동맥경화증에 유효하고 ⁷⁾ , 또한 초기 뇌혈 전증 환자의 반신불수, 언어장애, 의식장애 등 신경학적 증상의 악화를 방지하는 효과 ⁸⁾ , 신경세포 보호작용의 효과 ⁹⁾ , 허혈성 뇌 손상 흰쥐의 운동기능회복 효과 ¹⁰⁾ 등 주로 심혈관계 질환 및 뇌 신경계 질환에 효과가 있는 것으로 밝혀지고 있다.

한편 중추신경세포 손상은 세포막의 파괴, 세포의 팽창, 용

해를 동반하는 괴사와 glutamate에 의한 흥분독성, 이온통로를

통한 칼슘의 세포 내 유입, 산소자유기에 의한 산화적 손상,

acidosis 등의 다양한 생체 내의 생화학적 기전이 단독 또는 복합

적으로 작용하는 apoptosis에 의하는 것으로 보고되고 있다 ¹¹⁾ .

특히, glutamate는 중추신경계의 흥분성 신경전달물질로서 신경세포 사이에서 정보를 전달하는 역할을 담당하지만 신경독 소로서도 작용한다. 즉 신경세포가 허혈성 손상을 받게 되면 신 경말단에서 glutamate를 포함한 신경전달물질이 과다하게 유리 되고 신경아교세포에 의한 재흡수가 감소하여 glutamate가 신경 연접부위에 축적되어 신경세포의 손상을 초래하게 된다 ^12,13) . 이에 저자는 疎風湯이 중추신경세포에서 glutamate에 의한 세포손상에 미치는 방어효과를 실험적으로 규명하고자 과량의 glutamate에 의해 유도된 생쥐의 배양 신경아교세포인 C6 glial 세포의 손상에서 MTT assay, 유식세포 분석, 형광현미경적 조사, DAPI 및 Hoechst staining, Western blotting 등의 방법으로 疎 風湯이 세포생존율, 염색사의 응축과 핵 분절, 미토콘드리아 막 전위변화, caspase-3 활성, GSH 함량, ROS의 생성, 전사조절인자 인 NF-κB의 활성에 미치는 영향을 관찰하여 유의한 결과를 얻었 기에 보고하는 바이다.

재료 및 방법

1. 재료 1) 세포주

C6 glial 세포는 흰쥐 신경아교세포로서 한국 세포주은행 (KNCC, 서울대학교)에서 분양받아 계대배양하면서 실험을 실시 하였다.

2) 약재

실험에 사용한 疎風湯의 처방내용은 《東醫寶鑑》 ⁴⁾ 에 의거 하였으며, 약재는 원광대학교 익산한방병원에서 구입한 후 정선 하여 사용하였고, 1 貼의 내용과 분량은 다음과 같다(Table 1).

Table 1. Prescription of Sopung-tang(SPT)

韓藥名 生 藥 名 重量(g)

羌 活

Radix Osterici Koreani

2.6

防 風

Radix Ledebouriellae

2.6

當 歸

Radix Angenlicae gigantis

2.6

川 芎

Rhizoma Cnidii

2.6

赤茯苓

Poria

2.6

陳 皮

Pericarpium Citri Nobilis

2.6

半 夏

Tuber Pinelliae

2.6

烏 藥

Radix Linderae

2.6

白 芷

Radix Angelicae Dahuricae

2.6

香附子

Rhizoma Cyperi

2.6

生 薑

Rhizoma Zingiberis

2.6

桂 枝

Ramulus Cinnamomi

1.1

細 辛

Radix Asari

1.1

甘 草

Radix Glycyrrhizae

1.1

Total amount 31.9

3) 시약 및 기기

DMEM, glucose-free DMEM, FBS, 항생제 및 trypsin 등의 세포배양에 필요한 성분은 GIBCO BRL Co.(Grand Island, NY, USA)로 부터 구입하였으며, 배양용기(24 well plate와 10 cm dish)는 Falcon社(Becton Cickinson, San Jose, CA, USA)에서 구 입하여 사용하였다. 세포 및 핵 염색과 관찰에 이용한 slide

chamber는 Nunc Co.(Germany)로 부터 구입하여 사용하였다.

MTT, Hoechst 33258, NAC, SDS, DAPI, glutamate, GSH, DMSO, HRP는 Sigma(St. Louis, Missouri, USA)로 부터 구입하 였고, JC-1, Rhodamine, Mito tracker은 Molecular probes(Oregon, USA)로 부터 구입하였다. 단백질 정량을 위한 Bradford assay kit는 Bio-Rad에서 구입하였고, HO-1, PARP, caspase-3, β-actin, IκB-α에 대한 항체는 Santa Cruz社(Santa Cruz, CA, USA)로 부터 구입하였다.

2. 방법 1) 검액조제

검액은 疎風湯 4 貼 분량인 127.6 g을 3,000 ml 환저 플라스 크에 증류수 1,500 ml와 함께 넣은 다음, 120 분간 가열하여 얻은 전탕액을 여과지에 여과한 후 5,000 rpm으로 30 분간 원심분리 하고, rotary vaccum evaporator에 넣어 減壓 농축한 다음 동결 건조기에 완전히 건조하여 25 g을 얻었다. 시료는 eppendorf tube에 100 mg/ml를 DMSO로 녹여 냉장 보관하면서 사용 시에 는 DMEM에 희석하여 사용하였다.

2) C6 glial 세포의 배양

흰쥐 신경아교세포인 C6 glial 세포는 한국 세포주은행 (KNCC, 서울대학교)에서 분양받아 10% FBS가 포함된 DMEM 세포배양액으로 5% CO 2 , 95% 대기공기 및 37℃ 세포배양기에서 10 cm 세포배양판에 배양하였다. 24 시간 간격으로 trypsin/EDTA를 사용하여 계대배양 하였으며, 배양액을 교체한 후 log phase에 있는 세포를 사용하였다.

3) 세포생존율 측정

세포생존율은 MTT assay ¹⁴⁾ 를 이용하였다. C6 glial 세포를 24 wells 세포배양액에 1×10 ⁵ cells/ml씩 분주하여 24 시간 배양 판에 부착시키고, glutamate와 검액 및 항산화제 등을 전처리한 후 MTT(0.5 mg/ml)와 3 시간 반응시켰다. 살아있는 세포에 의 해 MTT로 부터 생성된 보라색 불용성 formazan은 DMSO로 용 해하여 540 nm 파장에서 분광광도계(THERMO max, USA)로 흡 광도를 측정하였다. 측정한 formazan 생성 정도는 정상적인 세 포의 값과 비교하여 백분율(%)로 표시하였다.

4) 핵 염색 (DAPI 및 Hoechst staining)

세포핵의 형태를 형광 현미경을 이용하여 관찰하였다. 먼저 4% formaldehyde 용액으로 세포를 고정시킨 다음, PBS로 2 번 세척하고, Hoechst 33258 또는 DAPI를 10 μΜ로 희석하여 10 분 간 염색한 후 다시 PBS로 세척하여 관찰하였으며, 역상 광학 현 미경(Nikon Eclipse TE 300, Japan)을 이용하여 10×10의 배율로 사진을 촬영하였다.

5) 미토콘드리아 막전위 및 분포양상

미토콘드리아 막전위의 변화를 관찰하고자 JC-1 (1 μM/㎖)

과 Rhodamine을 이용하였고, 세포질 내의 분포양상을 관찰하고

자 MitoTracker를 사용하여 세포를 염색하였다. 검액과

glutamate를 처리한 세포의 배양액을 버린 후 차가운 PBS로 세

척하였으며, C6 glial 세포에 각각의 염색시약을 처리하고, 세포

배양기에서 10 분간 반응시킨 다음, PBS로 3 번 세척한 후 역상

형광 현미경으로 10×40의 배율로 사진을 촬영하였다. 또한 Rhodamine에 의한 미토콘드리아 막전위의 정량적인 분석을 위 해 유식세포 분석기를 이용하여 분석하였다.

6) GSH 생성 측정

Glutamate가 세포 내 항산화제인 GSH 생성에 미치는 영향 과 이에 대한 疎風湯의 효과를 알아보기 위하여 C6 glial 세포에 glutamate를 처리하고 세포 내 GSH 함량을 측정하였다. C6 glial 세포를 6 cm 세포배양판에 2×10 ⁶ cells/ml씩 분주하여 세포배양 기에서 24 시간 배양하여 안정화시킨 후 검액과 glutamate를 처 리하였다. 세포배양액을 제거한 후 차가운 10% TCA를 400 ㎕씩 분주하여 10 분 동안 반응시켰다. TCA에 의해 용출된 분획을 모 아 원심분리한 후 상등액은 3 M NaOH를 사용하여 중성 pH로 조정하였다. 상등액 50 ㎕에 250 ㎕의 5,5′-dithionitrobenzoic acid(0.1 M phosphate buffer, pH 7.4 및 5 mM EDTA 0.96 mg/ml)와 250 ㎕의 NAPDH(0.59 mg/ml)와 450 ㎕의 glutathione reductase(5 U/ml)를 첨가하고, 실온에서 10~15 분 동안 반응시킨 다음, 분광광도계를 이용하여 412 nm에서 GSH 함량을 측정하였다.

7) 세포 내 ROS 생성 측정

C6 glial 세포에서 glutamate에 의한 세포 내 ROS 생성을 검 출하기 위하여 C6 glial 세포를 6 cm 세포배양판에 1×10 ⁵ cells/

㎖ 씩 분주한 다음 24 시간 안정화시킨 후 실험에 사용하였다.

안정화된 C6 glial 세포배양판에 glutamate와 疎風湯 단독 및 혼 합 처리 후 세포의 배양액을 제거하고, DCF-DA(10 μM/㎖)가 첨 가된 새로운 배지로 교환하여 1 시간 배양한 다음, trypsin을 처 리하고 PBS 용액에 현탁시켜 유식세포 분석에 사용하는 tube에 모아서 원심분리하여 세포를 침전시킨 후 상등액을 제거하고, PBS 용액에 0.2% FBS, 0.1% BSA와 0.02% Sodium azide가 첨가 된 분석용액에 현탁시켜 유식세포 분석기(FACSCalibur, BD Bioscience)를 이용하여 측정하였다. 이를 CellQuestTM software (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 이용하여 분석하였다.

8) 유식세포 분석 (Flow cytometric analysis)

실험에 사용한 C6 glial 세포는 시험관에 원심분리하여 모은 후 propidium iodide (PI) (Propidium iodide 50 μg/ml, 0.1%

sodium citrate, 0.03% Nonidet P-40)용액으로 1 분간 염색하여 유식세포 분석기(FACSCalibur, BD Bioscience)를 이용하여 형광 의 세기를 측정하였다. 이를 CellQuestTM software (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 이용하여 분석하였고, 세포자 멸사를 동반한 세포생존율을 측정하여 백분율(%)로 나타내었다.

9) Western blotting analysis

Glutamate가 caspase family cysteine protease의 효소 활성 에 미치는 영향과 이에 대한 疎風湯의 효과를 알아보기 위하여 C6 glial 세포에 glutamate를 처리하고 caspase-3의 활성에 따른 발현을 Western blotting으로 확인하였다. 배양된 C6 glial 세포 에 시료를 처리한 후 세포를 포집한 다음, 파쇄용액(50 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% deoxycholate, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 ㎍/ml aprotinin, 2 mM Na3VO4, 100 μΜ phenylarsine oxide)으로 4℃에서 파쇄하여 마찬가지로 BCA 용

액에 의하여 동량으로 정량하여 2 배의 sample buffer(5 mM EDTA, 4% SDS, 20% glycerol, 200 mM Tris, pH 6.8, 0.06%

bromophenol blue)를 섞어 100℃에서 3 분 동안 끓여 단백질 변성 을 유도하고, 10% SDS-PAGE를 시행하였다. 전기영동이 끝난 gel 의 단백질을 nitrocellulose membrane으로 0.8 mA/cm ² 의 전기를 부하시키면서 이동시킨 후 blocking buffer(5% skim milk)로 상온 에서 1시간 반응시켜 비특이적인 항체반응을 억제시켰다. IκB-α에 대한 항체를 TBS에 1:1,000으로 희석하여 nitrocellulose membrane 과 상온에서 2 시간 반응시켰다. 이후 이차항체인 anti-rabbit IgG conjugated HRP(TBS로 1:3,000으로 희석, Amersham, England)와 상온에서 1 시간 반응시키고, ECL kit (Amersham, England)를 사 용하여 ECL film에 감광시켜 현상하였다.

10) 전사인자의 활성 측정

疎風湯이 glutamate에 의한 C6 glial 세포자멸사에서 전사인 자인 NF-κB의 활성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 NF-κB luciferase reporter gene system을 이용하여 NF-κB의 활성을 측 정하였다. C6 glial 세포에 reporter vector인 pNF-κB luciferase 를 transfection하였다. 이를 위해 C6 glial 세포를 2x10 ⁴ cells/well을 배양판에 하루 전에 배양하고 luciferase 200 ng과 표준보정을 위한 50 ng의 pcDNA3-β-gal을 TfxTM-50 시약 (Promega, Madison, WI)에 잘 혼합하여 transfection하였다. 형 질전환 후 24 시간에 glutamate와 疎風湯을 실험조건에 따라 처 리하였고 24 시간 후에 세포를 PBS로 2 번 세척하고, reporter lysis 용액 100 ㎕를 첨가하여 충분히 lysis한 후 1.5 ㎖ eppendorf tube에 옮겨 원심분리한 다음, 상등액을 모아서 luciferase 활성을 Promega에서 제공하는 방법에 따라 분석을 수 행하였다. 각 sample은 triplicate로 평균을 취하고 β -galactosidase 활성을 측정하여 보정하였다.

11) 통계처리

표시된 결과는 3회 이상의 독립적인 실험결과로서 통계처리 는 Student's t-test에 준하여 처리하였으며, p-value가 최대치 0.005 이하의 경우를 유의한 것으로 판정하였다.

결 과

1. 疎風湯이 세포자멸사에 미치는 영향

Glutamate에 의해 47.05±2%로 감소되었던 세포생존율이 疎

風湯을 농도별로 전처리한 경우에는 점차 유의성있게 증가하기

시작하여 200 ㎍/㎖, 400 ㎍/㎖의 농도에서는 각각 82.36±0.57%,

91.92±1.75%를 나타내어 농도 의존적으로 세포생존율이 증가되

었으며, 800 ㎍/㎖의 농도에서는 다시 감소하는 것으로 나타났

다. 疎風湯 단독의 독성을 확인하기 위하여 농도별로 C6 glial 세

포에 처리한 결과 800 ㎍/㎖의 농도에서 유의한 독성을 보이는

것으로 나타났다. 따라서 이후 모든 실험은 400 ㎍/㎖의 농도에

서 수행하였다. Glutamate 15 mM의 농도에서 24 시간 배양한

세포군과 400 ㎍/㎖의 疎風湯 1 시간 전처리군과 단독처리군의

형태학적 변화에서 핵의 응축 및 DNA 분절을 확인한 결과에 의

거하여 세포자멸사의 전형적인 특성인 DNA ladder를 agarose

gel을 이용하여 확인하였다. 그러나 疎風湯 전처리 시 DNA 분절 현상이 억제되어 대조군과 동일하게 나타났다(Fig. 1).

G l u 1 5 m M S P T 4 0 0 ㎍ / ㎖

- -

+ -

+ +

- +

G l u 1 5 m M S P T 4 0 0 ㎍ / ㎖

- -

+ -

+ +

- +

G l u 1 5 m M S P T 4 0 0 ㎍ / ㎖

- -

+ -

+ +

- +

Fig. 1. SPT inhibited the formation of DNA ladder in the glutamate-treated C6 glial cells.

2. 疎風湯이 미토콘드리아 막전위에 미치는 영향

C6 glial cell 정상대조군에서의 미토콘드리아는 핵 및 세포 질에 고르게 분포되어 약한 형광을 나타내고 있으나, 15 mM의 glutamate를 처리한 군에서는 미토콘드리아가 핵 방향으로 많이 이동하였으며, 강한 형광을 보이는 것으로 나타났다. 400 ㎍/ml 의 疎風湯을 1 시간 전처리하고, 15 mM의 glutamate를 처리한 군과 疎風湯 단독처리군에서는 미토콘드리아의 위치가 정상대조 군과 유사하게 나타나면서 정상대조군보다 더욱 약한 형광을 나 타내었다. 유식세포 분석기를 이용하여 정량적인 분석을 한 결과 glutamate 15 mM을 처리한 군의 미토콘드리아 막전위의 변화량 은 疎風湯 전처리군과 단독처리군 및 정상대조군과 비교하여 약 27% 막전위의 변화억제를 나타내었다(Fig. 2).

38.42 M2

61.58 M1

100 All

% Total Marker

38.42 M2

61.58 M1

100 All

% Total Marker

12.46 M2

87.54

M1

100 All

% Total Marker

12.46 M2

87.54

M1

100 All

% Total Marker

34.44 M2

65.56 M1

100 All

% Total Marker

34.44 M2

65.56 M1

100 All

% Total Marker

39.56 M2

60.44 M1

100 All

% Total Marker

39.56 M2

60.44 M1

100 All

% Total Marker

(A) (B)

(C) (D)

Fig. 2. SPT inhibited the mitochondrial membrane potential shift by glutamate-induced toxicity in C6 glial cells.

SPT(400 ㎍/ml) was preincubated in C6 glial cells cultures for 1 hr and followed by the addition of 15 mM glutamate for 24 hrs. A: Control cells, B: Glutamate-treated cells, C: SPT pretreated cells with glutamate, D: SPT treated cells.

3. 疎風湯이 미토콘드리아의 분포에 미치는 영향

Glutamate에 의해 유도된 C6 glial 세포의 미토콘드리아 분

포의 변화와 이에 대한 疎風湯의 효과를 알아보기 위하여 JC-1, MitoTracker 등으로 염색하여 형광현미경으로 관찰하였 다.Glutamate에 의한 미토콘드리아 막전위의 변화와 관련하여 미토콘드리아의 분포를 확인하기 위해 미토콘드리아 특이적인 MitoTracker를 이용하여 염색하였다. 정상대조군의 미토콘드리 아는 핵 주위에 고르게 분포하는(Fig. 3A, B) 반면에 15 mM의 glutamate를 처리한 군에서는 세포의 응축과 함께 핵 주위로 응 축되어 나타났으며(Fig. 3C, D), 疎風湯의 전처리군(Fig. 3E, F) 및 단독처리군(Fig. 3G, H)에서는 정상대조군과 유사한 현상을 나타내었으나 핵 주위에 밀집하여 분포하는 것으로 나타났다.

A ) B )

C ) D )

E ) F )

G ) H )

L i g h t P h a s e F l u o r e s c e n c e P h a s e

A ) B )

C ) D )

E ) F )

G ) H )

L i g h t P h a s e F l u o r e s c e n c e P h a s e

Fig. 3. SPT promoted the accumulation of mitochondria around the nuclear membrane

. SPT(400 ㎍/ml)was preincubated in C6 glial cells cultures for 1 hr and followed by the addition of 15 mM glutamate for 24 hrs and stained with mitochondria specific binding dye MitoTracker. Movement of mitochondria from the cells was observed under fluorescent microscope. A, B: Control cells, C, D: Glutamate-treated cells, E, F: SPT-pretreated cells with glutamate, G, H:

SPT treated cells.

4. 疎風湯이 PARP 및 caspase-3 활성에 미치는 영향

C6 glial 세포에 다양한 농도의 疎風湯을 1 시간 전처리하고 15 mM의 glutamate를 24 시간 처리하여 세포생존율을 측정한 결과 15 mM의 glutamate를 처리한 군에서는 대조군에 비하여 procaspase-3의 발현이 현저하게 감소하였다(Fig. 4). 또한 caspase-3의 세포 내 표적 단백질인 PARP의 분절을 조사한 결과 대조군에 비하여 118kDa의 PARP 단백질이 분해되어 발현이 감 소하였고, 86kDa의 분절된 단백질의 발현은 증가되었다. 그러나 소풍탕 전처리 시 소풍탕의 농도에 의존적으로 procaspase-3 및 PARP 단백질의 분해가 억제 되었다(Fig. 4).

5. 疎風湯이 세포 내 GSH 생성에 미치는 영향

Glutamate에 의한 C6 glial 세포독성에서 세포 내 GSH 함량

의 변화를 조사하였다. 그 결과 15 mM의 glutamate 처리 3시간

후 부터 세포 내 GSH 함량이 감소하기 시작하여 처리 12시간 후

에는 대조군에 비하여 55±2.6%, 18시간 후에는 32±3.1%, 그리고 24시간 후에는 29.51%로 나타나 시간 의존적으로 유의한 감소를 보였다(Fig. 5). 그러나 소풍탕을 전처리 후 15 mM의 glutamate 를 24시간 처리 하였을 경우 100 ㎍/ml 농도의 疎風湯 병용 처 리 시 41±2.2%, 200 ㎍/ml 농도의 疎風湯 처리 시에는 60±3.2%, 그리고 400 ㎍/ml의 疎風湯을 전처리 시에는 83±1.9%로 세포 내 GSH 함량이 회복되었다.

Fig. 4. SPT inhibited the activation of PARP and caspase-3 protease from the glutamate-induced toxicity of C6 glial cells in a dose-dependent manner.

Cells were seeded for 24 hrs, pretreated with a various concentration of SPT for 1 hr and followed by the addition of 15 mM glutamate. Lysate from the cells was used to the activation of PARP and caspase-3 protease using Western blotting.

0 20 40 60 80 100 120

Glu 15 m M - 3 6 9 12 18 24hrs

G S H Co nt ent s (% of Control)

0 20 40 60 80 100 120

G lu 15 m M SPT ㎍ /㎖

- +

- - 100 200 400

+ + +

GSH Cont e n ts (% o f C o n tro l)

* ** ** **

** **

* 0

20 40 60 80 100 120

Glu 15 m M - 3 6 9 12 18 24hrs

G S H Co nt ent s (% of Control)

0 20 40 60 80 100 120

0 20 40 60 80 100 120

Glu 15 m M - 3 6 9 12 18 24hrs

G S H Co nt ent s (% of Control)

0 20 40 60 80 100 120

G lu 15 m M SPT ㎍ /㎖

- +

- - 100 200 400

+ + +

GSH Cont e n ts (% o f C o n tro l)

0 20 40 60 80 100 120

G lu 15 m M SPT ㎍ /㎖

- +

- - 100 200 400

+ + +

GSH Cont e n ts (% o f C o n tro l)

* ** ** **

** **

*

Fig. 5. SPT recovered the glutamate-induced reduction of GSH contents in a dose-dependent manner.

* p<0.05, ** p<0.001 by Student's t-test, compared with control group or glutamate treated group.

6. 疎風湯이 glutamate에 의한 ROS생성에 미치는 영향 400 ㎍/ml의 疎風湯을 1 시간 전처리군 및 단독처리군과 15 mM의 glutamate를 처리한 군에서 생성된 ROS의 양을 분석한 결과 15 mM의 glutamate를 처리한 군에서는 87.54%로 정상대 조군의 44.42%에 비교하여 약 2 배 정도 증가하였다. 반면에 疎 風湯 전처리군 및 단독처리군에서는 정상대조군에 비하여 다소 감소하여 각각 31.32%와 25.82%로 나타났다(Fig. 6).

44.42 M 2

55.58 M 1

100 A ll

% Total M a rker

44.42 M 2

55.58 M 1

100 A ll

% Total M a rker

8 7.54

M 2

1 2.46 M 1

1 00 A ll

% To tal M a rker

8 7.54

M 2

1 2.46 M 1

1 00 A ll

% To tal M a rker

31.32 M 2

68.68 M 1

100 A ll

% Total M arker

31.32 M 2

68.68 M 1

100 A ll

% Total M arker

25 .82 M 2

74 .18 M 1

10 0 A ll

% Total M a rker

25 .82 M 2

74 .18 M 1

10 0 A ll

% Total M a rker

B lu e S P T400 ug

R e d S P T400 u g +

G lu 15 m M

G ree n G lu 1 5m M

B lack C ontrol

C olor M a rke r

B lu e S P T400 ug

R e d S P T400 u g +

G lu 15 m M

G ree n G lu 1 5m M

B lack C ontrol

C olor M a rke r

(A) (B )

(C ) (D )

(E )

Fig. 6. SPT inhibited the production of ROS by glutamate toxicity in C6 glial cells.

A: Control group, B: Glutamate treated group, C: SPT pretreated group, D: SPT treated group, E: Combination of total group.

7. 疎風湯이 전사인자(NF-κB) 활성과 HO-1의 발현에 미치는 영향 Glutamate 처리에 의한 NF-κB의 전사인자 활성을 luciferase assay로 조사하였다. 15 mM의 glutamate를 처리 시 대조군에 비 해 67.47%로 활성이 감소하였으나 疎風湯 전처리군에서는 농도 의존적으로 NF-κB 전사인자 활성이 각각 140%, 182.1%, 201.8%

로 증가되었다. 이 때, 단독처리군에서는 249.17% 활성을 보여 대 조군에 비하여 2.5배 증가되는 양상이 나타났다. 그러나 항산화제 인 GSH와 NAC 각각 처리한 후 15 mM의 glutamate를 처리한 군에서는 glutamate에 의한 C6 glial 세포의 세포생존율의 감소를 억제 하였고, NF-κB 전사인자 활성은 대조군에 비하여 감소된 활 성을 보였으나 통계적 유의성은 없었다(Fig. 7).

Fig. 7. SPT protected the glutamate toxicity through NF-

κ

B activation in the C6 glial cells.

Cells were transfected with NF-κB-luciferase reporter gene vector and were followed by the addition of 15 mM glutamate in the presence of SPT and antioxidant, GSH and NAC. Luciferase activity was measured. * p< 0.05, ** p<0.01 by one-way ANOVA, compared with control group(line) or glutamate treated group (dot line).

또한 疎風湯에 의한 전사인자의 활성과 항산화효과를 확인

하기 위해 세포 내 항산화 단백질인 HO-1의 발현을 Western blotting으로 확인하였다. 疎風湯의 농도(Fig. 8A)와 시간(Fig. 8B) 에 따라 세포 내 항산화 단백질은 HO-1의 발현이 현저하게 증가 되는 것으로 확인되었다(Fig. 8).

β - a c t i n H O - 1

G l u 1 5 m M S P T m M

-

- -

+ + + +

1 0 0 2 0 0 4 0 0

β - a c t i n H O - 1

G l u 1 5 m M S P T 4 0 0 m M

- -

+ -

+ -

+ -

+ -

+ +

+ +

+ +

+ +

2 4 6 1 2 1 8 2 4 6 1 2 1 8 2 4 h r

( A )

( B )

β - a c t i n H O - 1

G l u 1 5 m M S P T m M

-

- -

+ + + +

1 0 0 2 0 0 4 0 0 β - a c t i n

H O - 1 β - a c t i n H O - 1

G l u 1 5 m M S P T m M

-

- -

+ + + +

1 0 0 2 0 0 4 0 0 G l u 1 5 m M

S P T m M

-

- -

+ + + +

1 0 0 2 0 0 4 0 0

β - a c t i n H O - 1

G l u 1 5 m M S P T 4 0 0 m M

- -

+ -

+ -

+ -

+ -

+ +

+ +

+ +

+ +

G l u 1 5 m M S P T 4 0 0 m M

- - - -

+ - + -

+ - + -

+ - + -

+ - + -

+ +

+ +

+ +

+ +

2 4 6 1 2 1 8 2 4 6 1 2 1 8 2 4 h r

( A )

( B )

Fig. 8. SPT inhibited the glutamate toxicity via HO-1 activation in the C6 glial cells by a dose- and time-dependent manner.

Cells were pretreated with a various concentrations of SPT for 1 hr and were followed by the addition of 15 mM glutamate. Lysate from the cells was separated on 10%

SDS-PAGE. HO-1 on the nitrocellulose membrane was probed by anti-HO-1 antibody(Santa Cruz Co.) and the immunoreactive band was visualized by ECL kit.

고 찰

疎風湯은 明代 龔廷賢의 《萬病回春》 ¹⁾ 에 최초로 수록되었으 며, 《東醫寶鑑》에서는 “治風中府, 手足不仁 ... 中血脈而外有六 經之形證, 則從小續命湯加減及疎風湯治之”라고 하여 風이 침범하 여 손발이 마비되어 자유롭지 못한 것을 치료한다고 하였다 ⁴⁾ . 이 처방은 麝香을 제거한 古防風湯에 二陳湯을 합하고 當歸, 川芎, 烏藥, 香附子, 桂枝, 細辛을 가한 방제로 볼 수 있다 ⁵⁾ . 羌 活․防風․白芷․桂枝는 解表發汗․散寒去風藥하는 君藥이고, 當歸․川芎은 活血하는 臣藥이다. 茯苓․半夏는 滲濕利水化痰하 고, 陳皮는 茯笭과 配伍되어 順氣健脾․燥濕化痰하고, 烏藥․香 附子는 行氣止痛하며, 細辛은 散寒止痛하는 佐藥이고, 生薑은 溫 中去痰하는 한편 半夏의 독성을 완화하고, 甘草는 모든 약이 조 화를 이루게 하는 使藥이다 ¹⁵⁾ . 따라서 疎風湯은 疎風․順氣․活 血․祛痰 등의 治法을 가진 方劑로 中風 初期 뇌혈전증 환자의 반신불수․언어장애․의식장애 등 신경학적 증상의 악화를 방지 하는데 활용되고 있다 ⁶⁾ .

허혈성 손상 등의 병리적 외부자극에 의해 신경조직에 산소 및 포도당의 공급이 줄어들면 ATP 관련 이온채널의 기능손실에 의한 Ca ²⁺ 과 같은 양이온의 세포 내 유입으로 신경세포 탈분극이 발생하며, 신경말단에서 glutamate 등을 포함하는 신경전달물질 의 유리가 증가하고 신경교세포에 의한 glutamate 재흡수가 감 소하여 결과적으로 흥분성 신경전달물질인 glutamate가 신경연 접부위에 축적된다 ¹⁶⁾ . Glutamate의 과도한 축적은 이온성 수용 체인 AMPA(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-iso-xazolepropionic acid) 및 NMDA(N-methyl-D-aspartate) 수용체 등의 활성을 유 도하며, 이로 인하여 신경세포의 고사가 초래된다 ^17,18) . 또한 활성 산소종에 의한 산화적 손상이 신경독성 및 특정 유전자의 작용 을 유도하여 세포자멸사를 일으키는 것으로 밝혀지고 있다 ^19,20) .

최근 C6 glial 세포자멸사에 대한 한약재의 보호효과를 실험 적으로 연구한 논문으로는 김 ²¹⁾ 의 Nitric Oxide에 의해 유발된 C6 glial 세포독성에 대한 四物湯의 방어효과, 나 ²²⁾ 의 炙甘草湯이 LPS와 PMA에 의해 損傷된 C6 glial 細胞에 미치는 影響, 김 ²³⁾ 의 攝生散이 C6 glial 세포의 NO생성에 미치는 영향, 이 ²⁴⁾ 의 Zinc에 의한 세포자멸사로부터 대보중탕에 의한 보호효과, 이 ²⁵⁾ 의 右歸 飮이 Zinc에 의한 신경교세포의 고사에 미치는 영향 등이 보고 되고 있으나 疎風湯이 glutamate에 의한 뇌세포손상에 미치는 방어효과에 대한 연구는 아직 보고되지 않았다.

이에 저자는 疎風湯이 중추신경세포 손상에 미치는 방어효 과를 실험적으로 알아보기 위하여 생쥐의 배양 신경아교세포인 C6 glial 세포에 과량의 glutamate에 의해 유도된 신경세포 손상 에서 疎風湯이 세포생존율, 염색사의 응축과 핵 분절, 미토콘드 리아 막전위의 변화와 분포, caspase-3활성, GSH 함량, ROS의 생성, 전사조절인자의 활성에 미치는 영향과 疎風湯의 항산화 효 과를 관찰하였다.

먼저 C6 glial 세포에 대한 glutamate의 직접적인 세포독성 을 알아본 결과 glutamate는 C6 glial 세포생존율을 시간과 농도 의존적으로 감소시킨 반면 疎風湯은 glutamate에 의해 감소된 C6 glial 세포생존율을 농도 의존적으로 증가시켰다.

또한 glutamate는 C6 glial 세포에 세포자멸사의 형태학적 특 징의 하나인 염색사 응축 현상과 핵 분절 현상을 유발시킨 반면 疎風湯은 glutamate에 의해 유발된 C6 glial 세포의 염색사 응축 및 핵 분절 현상을 억제시켰다. 그리고 glutamate의 세포독성은 미토콘드리아 막전위의 손상을 유도하고 미토콘드리아의 핵 부분 응집현상을 나타내었으며, 이러한 독성에 대하여 疎風湯은 방어효 과를 나타내었다. 이는 glutamate는 시간과 농도 의존적으로 C6 glial 세포에 독성을 나타내며, 이러한 세포독성이 세포자멸사에 의한 것이고, 疎風湯은 이에 대한 방어효과가 있음을 의미한다.

세포 내에서 caspase family는 염증반응이나 세포자멸사 기 전에 핵심적인 역할을 수행하는 효소로서 정상적으로는 세포 내 에 불활성 상태로 존재하다가 세포자멸사가 유도되면 활성화되 어 세포자멸사의 집행자로서 역할을 수행한다 ^26,27) .

따라서 본 연구에서 Hoechst 및 DAPI 염색으로 핵의 응축 및 분절을 확인하였고, 미토콘드리아 막전위의 변화를 확인함으 로써 C6 glial 세포에서 glutamate에 의한 세포독성이 세포자멸 사에 의한 것임을 확인하였기에 glutamate에 의한 세포자멸사가 caspase 활성 및 PARP의 활성과 관련이 있음을 확인하기 위하 여 Western blotting을 수행하였다.

그 결과 glutamate 처리군에서는 procaspase-3 활성이 절단 되어 감소된 반면 疎風湯을 처리한 군에서는 이러한 현상이 현 저하게 억제되었다. 또한 핵 분절 및 DNA ladder형성에 관여하 는 PARP의 활성은 glutamate 처리군에서 절단되어 감소된 반면 疎風湯 처리군에서는 이러한 현상이 억제되어 疎風湯이 세포자 멸사 기전을 효율적으로 억제시키고 있음을 확인하였다.

신경세포 자멸사에 있어서 산화적 손상이 hydrogen

peroxide 같은 자유라디칼(free radical)생성에 의한 GSH 함량의

감소에 기인하는 것으로 보여지며, 이러한 자유라디칼에 의한 산

화적 손상은 일반적 세포노화에 관련된다. 따라서 glutamate에 의해 유도된 C6 glial 세포자멸사에서 자멸사를 억제하는 疎風湯 의 작용기전을 연구하고자 glutamate에 의한 세포 내 항산화제 인 GSH 함량의 변화와 이에 대한 疎風湯의 효과를 관찰한 결과 glutamate는 C6 glial 세포 내 GSH 함량를 감소시켰는데 이는 결국 glutamate로 인한 세포독성이 산화적 손상과 관련한 GSH 함량의 감소에 기인하고 있음을 의미한다. 그러나 疎風湯은 glutamate에 의해 유발된 C6 glial 세포 내 GSH 함량의 감소를 회복시켰는데 이러한 결과는 glutamate에 의한 산화적 손상에 대하여 疎風湯의 방어작용은 세포 내 GSH 함량의 감소를 방어 하는데 기인하고 있음을 의미한다.

또한 glutamate에 의한 산화적 손상이 ROS생성에 기인하고 있음을 확인하기 위하여 ROS에 특이적으로 반응하는 DCF-DA 를 유식세포 분석기를 이용하여 분석한 결과 glutamate 처리군 은 정상대조군에 비하여 약 2배의 ROS가 생성됨을 확인하였고, 疎風湯을 처리한 군에서는 정상대조군에서 발현되는 ROS양 보 다 낮은 수준으로 유지하는 것으로 분석되었다. 이것은 또한 glutamate에 의한 산화적 손상에 대하여 疎風湯의 방어작용이 ROS생성 억제에도 기인하고 있음을 의미한다.

疎風湯의 항산화 작용을 통한 세포자멸사 억제작용을 비교 하기 위해 대표적인 항산화제로 알려져 있는 GSH와 NAC에 의 한 세포생존율과 疎風湯에 의한 세포생존율을 비교 관찰한 결과 GSH의 경우 정상세포 수준보다 높은 120~130% 세포생존율을 나타내었으며, 疎風湯으로 전처리하고 15 mM의 glutamate로 처 리한 군에서는 세포생존율이 정상대조군의 97% 수준에 이르는 것으로 관찰되었다. 이를 통해 glutamate로 인한 세포자멸사가 산화적 손상과 관련한 GSH 함량의 감소와 관련되어 있고 이러 한 산화적 손상과정에 疎風湯이 glutamate에 의한 GSH 함량의 감소를 억제하여 항산화제의 역할을 함으로써 산화적 손상을 방 어하고 있음을 알 수 있다.

최근 transcription factor인 NF-κB의 활성화가 각기 다른 자 극에 의해 발생하는 세포자멸사에 저항성을 나타내는 것으로 보 고되고 있으나 ^28,29) , 신경세포나 glial 세포에서는 세포자멸사 유 도에 직접적으로 관련이 있음이 보고되고 있다 ³⁰⁾ .

따라서 본 연구에서도 glutamate의 세포독성으로 인한 C6 glial 세포자멸사 과정이 전사활성인자 NF-κB와 어떤 관련이 있 는지를 알아보기 위하여 NF-κB luciferase reporter system을 이 용하여 NF-κB의 활성을 측정한 결과 疎風湯 처리군에서는 농도 에 따라 NF-κB luciferase 활성이 현저히 증가된 반면 glutamate 처리군에서는 정상 대조군의 67%정도로 luciferase 활성이 감소 되었다. 이는 glutamate의 세포독성으로 인한 C6 glial 세포자멸 사 과정이 전사활성인자 NF-κB의 활성 감소와 관련이 있는 것을 의미하며, 疎風湯은 NF-κB의 활성을 증가시킴으로써 세포자멸 사를 억제시키는 것을 의미한다.

HO는 항산화단백질로서 최소 두가지의 isozyme(HO-1과 HO-2)이 보고되고 있는데 HO-2는 구성형 효소이고, HO-1은 각종 스트레스원에 반응하여 세포 내에서 유도 발현되는 효소로 이 효 소의 반응을 조사하여 항산화 효과를 확인하는데 이용할 수 있다.

전사인자의 활성의 증가와 관련하여 항산화단백질인 HO-1 의 발현을 Western blotting을 이용하여 분석한 결과 HO-1의 발 현이 疎風湯의 처리 농도에 따라 점차 증가하는 현상을 보였으 며, 400 ug/ml의 농도에서 시간 의존적으로 증가함을 보였다. 이 는 疎風湯이 항산화 효과가 있음을 시사하고 있다.

이상의 실험결과를 종합하면 glutamate는 시간, 농도 의존적 으로 C6 glial 세포에 독성을 나타내었으며, 疎風湯은 glutamate 에 의해 감소된 세포생존율을 농도 의존적으로 증가시켰다. 이러 한 疎風湯의 신경세포 자멸사에 대한 방어효과로서 疎風湯은 염 색사의 응축 현상, 미토콘드리아 막전위의 손상, GSH 함량의 감 소, ROS의 생성 등을 억제시키고, 전사인자 활성화 및 세포 내 항산화단백질의 발현을 증가시킴으로써 산화적 손상에 대한 방 어효과를 나타내는 것으로 사료된다.

결 론

본 연구는 중추신경세포에서 신경전달물질인 glutamate가 세포자멸사 기전에 미치는 영향에 대하여 疎風湯의 방어효과를 규 명하고자 신경아교세포인 C6 glial 세포를 이용하여 MTT assay, 유식세포 분석, 형광현미경적 조사, DAPI 및 Hoechst staining, Western blotting, 염색사의 응축과 핵 분절, 미토콘드리아 막전위 변화 및 분포, caspase-3 및 PARP의 활성, 세포 내 GSH 함량, ROS 의 생성 및 전사인자의 활성과 세포 내 항산화단백질의 발현에 미 치는 영향을 관찰하여 다음과 같은 결론을 얻었다.

疎風湯은 glutamate에 의해 감소된 세포생존율을 농도 의존 적으로 증가시켰다. 疎風湯은 glutamate에 의해 유발된 염색사의 응축 및 핵 분절을 억제시켰다. 疎風湯은 glutamate에 의해 유발 된 미토콘드리아 막전위 손상을 억제시켰으며, 미토콘드리아를 세포질 내에서 핵 주위에 고르게 분포시켰다. 疎風湯은 caspase-3 protease 활성 및 PARP의 활성을 억제시켰다. 疎風湯 은 glutamate에 의한 세포 내 GSH 함량의 감소를 억제시켰다.

疎風湯은 glutamate에 의한 ROS의 생성을 억제시켰다. 疎風 湯은 glutamate에 의한 전사인자인 NF-κB의 활성을 농도 의존 적으로 증가시켰다. 疎風湯은 세포 내 항산화단백질로 작용하는 HO-1의 발현을 농도와 시간에 의존적으로 현저하게 증가시켰다.

이상의 결과로 보아 疎風湯은 glutamate로 유발된 중추신경 세포의 세포자멸사에 대하여 활성산소종의 발생을 억제하고, 세 포 내 항산화제의 감소를 억제하며, 세포 내 항산화단백질의 발 현을 증가시킴으로써 glutamate에 의해 유발된 산화적 손상을 방어하는 효과를 나타내었다. 따라서 뇌졸중, 치매 등의 뇌세포 의 산화적 손상으로 인한 질환에 유효하게 활용할 수 있을 것으 로 사료된다.

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