Protective Effect of Jinmu-tang on $H_2O_2$-induced Cell Death in C6 Glial Cells

․교신저자: 신선호 전북 전주시 덕진구 덕진동2가 142-1번지 원광대학교 전주한방병원 심계내과학교실 TEL: 063-270-1013 FAX: 063-270-1594 E-mail: [email protected]

眞武湯이 H

2

2

최정훈¹, 신용진², 하예진², 조문영², 유주연², 이숭인³, 신선호²

1함소아한의원,²원광대학교 한의과대학 내과학교실, ³생생한의원

Protective Effect of Jinmu-tang on H

O

-induced Cell Death in C6 Glial Cells

Jung-hoon Choi¹, Yong-jeen Shin², Ye-jin Ha², Mun-young Cho², Ju-yeon You², Soong-in Lee³, Sun-ho Shin²

1Hamsoa Oriental Medical Clinic

2Dept. of Internal Medicine, College of Oriental Medicine, Won-Kwang University

3Sangsang Oriental Medical Clinic

ABSTRACT

Objectives :The purpose of this study was to investigate the mechanism of protective effect ofJinmu-tang (JMT, Zhenwu-tang) extract on H2O2-induced cell death in C6 glial cells.

Methods :Cultured C6 glial cells of white mice were pretreated withJMT extract and exposed to H2O2for inducing cell death. We measure the cell viability by 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay and investigate the cell morphology using a light microscope after crystal violet (CV) staining. Reactive oxygen species (ROS) formation was analyzed using a flow cytometer and a fluorescent microscope after staining with 2'7'-dichlorofluorescein diacetate (DCF-DA).

DNA fragmentation was analyzed using a flow cytometer after propidium iodide (PI) staining and nuclei morphology was investigated using a fluorescent microscope after 2-[4-amidinophenyl]-6-indo-lecarbamidine dihydrochloride (DAPI) staining.

We analyzed expression of Bax, processing of procaspase-3 and poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), and activation of nuclear factor-kB (NF-κB) by western blot method. Tumor necrosis factor-α (TNF-α) secretion was analyzed using Quantikine kit.

Results :We determined the elevated cell viability byJMT extract on H2O2-induced C6 glial cell death. ROS formation, DNA fragmentation, IκBα phosphorylation, NF-κB activation, and secretion of TNF-α induced by H2O2are inhibited byJMT extract pre-treatment. JMT extract inhibits Bax expression, processing of caspase-3 and PARP that are critical biochemical markers of apoptotic cell death.

Conclusions : These results suggest that JMT extract has a protective effect on H2O2-induced C6 glial cell death in various pathways.

Key words :

Ⅰ. 서 론

노령 인구가 늘어남에 따라 알츠하이머 증후군, 파킨슨 증후군, 뇌졸중 등 신경계 관련 퇴행성 질

환 및 뇌혈관 질환이 증가하고 있으며, 이로 인해 사회적 문제 및 부담이 더욱 대두되고 있는 실정 이다

.

대표적 노인 질환의 하나인 허혈성 뇌졸중은 뇌

혈관이 막힌 것으로, 뇌허혈이 발생하면 일차적으

로 세포 에너지 부족에 의한 세포괴사가, 이차적인

반응으로 세포자멸사가 일어난다

. 활성산소종의

생성은 뇌신경 세포괴사 및 자멸사를 유발하는 중

요한 경로로 활성산소종의 하나인 H

O

는 직접적 으로 산화적 스트레스를 가중시킬 뿐만 아니라 hydroxyl radical 등 다른 종류의 활성산소를 증가 시켜 세포 손상을 가속화시키는 요인이 된다

. 그 밖에도 glutamate 분비로 인한 세포독성, 이온의 불균형, 염증반응 등의 기전과 관련하여 허혈성 세 포사가 발생하며

, 초기에 신경세포를 보호하여 이러한 손상을 줄이는 것이 허혈성 뇌졸중의 중요 한 치료목표가 된다.

眞武湯은 漢代 張仲景의 ≪傷寒論≫

에 처음으 로 기록된 처방으로 腎陽이 쇠약해져 氣化작용이 되지 않아 水飮이 저류된 證인 腎虛水泛證을 치료 하는 처방이다

. 眞武湯은 溫陽利水의 효능으로 주 로 全身浮腫, 尿少에 활용되고 있으며

, 그 밖에 筋惕身瞤

, 虛冷으로 인한 泄瀉, 軟便

등에 응용 된다.

眞武湯에 관한 실험적인 연구로는 眞武湯을 이 용하여 갑상선기능저하증

, 급성 신부전증의 사구 체여과율 감소 및 신세뇨관 기능손상

, 만성 진행 성 사구체 질환의 메산지움 세포증식과 기질침착

을 개선시킨다는 연구가 있다. 이와 같이 眞武湯의 신경세포의 보호효과에 관한 연구는 부족한 상태 이며, 근래 소뇌동맥 경색증 등을 진단받은 중추성 어지러움에 眞武湯을 응용하여 유효한 결과를 얻 은 증례들이 보고되어

이를 실험적으로 확인하고 자 본 연구를 진행하였다.

따라서 본 연구에서는 H

O

에 의한 C6 glial 세 포의 세포사를 확인하고, 眞武湯 추출물을 전처리 한 후 활성산소종, 염증성 사이토카인 및 분자생물 학적인 변화를 통해 眞武湯의 C6 glial 세포 보호 효과에 관한 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바 이다.

Ⅱ. 재료 및 방법

1. 재 료

본 실험에 사용된 眞武湯의 처방 내용은 ≪方藥

合編≫

에 의거하였다. 약재는 원광대학교 전주한 방병원에서 구입하여 정선한 것으로 사용하였으며, 1 貼의 내용과 분량은 다음과 같다(Table 1).

Herbal

name Scientific name Dosage (g)

白茯苓 Poria cocos Wolf 6

白芍藥 Paeonia lactiflora Pall. 6 附子(炮) Aconitum carmichaeli Debeaux 6 白 朮 Atractylodes macrocephala Koidz. 4 生 薑 Zingiber officinale Roscoe 6 Total amount 28 Table 1. Prescription of Jinmu-tang .

2. 방 법 1) 시료 제조

眞武湯 5貼(총 140 g)을 증류수 1,000 ml와 함께 3,000 ml 환저 플라스크에 넣은 다음, 2시간 가열하 여 얻은 전탕액 322. 0 g을 여과지로 여과한 뒤 5,000 rpm으로 30분 원심분리하고, 감압 농축기(rotary vacuum evaporator)에 넣어 감압 농축한 후 동결 건조기로 완전히 건조하여 시료 9 g을 얻었으며, 튜브에 100 mg/ml 농도로 증류수에 녹여서 12,000 rpm에서 20분간 원심분리하였다. 원심분리한 시료 의 상층액을 0.2 μm filter에 통과시켜 멸균한 후 냉장보관하면서, 사용 시에는 진공 건조된 眞武湯 시 료를 세포배양용 DMSO(dimethyl sulfoxide, Sigma 社)에 용해한 후 100 mg/mL의 저장용액을 조제하 여 사용하였다.

2) 세포 배양

백서 C6 glial 세포주는 ATCC(American Type

Cell Culture, Korambiotech, USA)에서 구입하여

5% CO

/95% air 세포배양기에서 열에 의해서 비

활성된 10% FBS(fetal bovine serum, Gibco 社,

USA)와 항생제가 포함된 DMEM /HG(dubellco's

minimum essential medium - high glucose, Sigma

社, USA) 배양액으로 배양하여 실험 목적에 따라

사용하였다.

3) 세포 생존율 측정

C6 glial 세포를 24 well plate에 0.05×106 cells/well 이 되도록 계대배양하고 H

O

및 眞武湯을 농도별 로 24시간 동안 처리한 다음, CV(crystal violet, Sigma 社, USA) 염색을 수행하여 세포형태학적 분석을 수행하였고, 세포 생존율은 MTT(3-[4,5- dimethylthiazol -2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma社, USA) 분석방법을 이용하여 ELISA(enzyme -linked immunosorbent assay) 분석기로 흡광도 570 nm에서 측정하였다. 50 μL의 MTT 반응용액 (5 mg/mL MTT/PBS)을 각 실험군에 250 μg/mL 이 되도록 처리한 다음, 4시간 동안 배양하여 반응 하지 않은 MTT 용액을 버리고, 생존세포에 의한 MTT 반응결과 로 생성된 formazan을 DMSO로 용해하여 세포 생존율을 간접적으로 계산하였다.

H

O

에 의해 유도된 C6 glial 세포사에 대해 眞武 湯의 효과를 알아보기 위하여 C6 glial 세포에 眞 武湯을 1시간 동안 전처리한 다음, 100 μM H

O

로 24시간 동안 자극하고, 세포 생존율을 MTT 방법 으로 조사하였다.

4) 활성산소종 측정

활성산소종은 DCF-DA(2'7'-dichlorofluorescein diacetate, Sigma 社, USA)를 이용하여 정량적 및 정성적 분석이 가능하므로 6 well plate에 C6 glial 세포를 계대배양하고, 24시간 동안 H

O

및 眞武湯 을 처리한 후, 세포를 serum free 배지로 세척한 다 음, 10 μM DCF-DA로 30분 동안 염색하고, 유세 포분석기(Flow cytometer, BD FACSCaliber, USA) 로 관찰하였다. 또한 C6 glial 세포를 cover glass에 배양한 후, 眞武湯 및 H

O

를 처리한 다음, DCF-DA 로 염색하고, 형광현미경으로 분석하였다.

5) DNA 절편 분석

DNA의 분절현상을 PI(propidium iodide, Sigma 社, USA) 염색을 통하여 분석하였다. C6 glial 세 포를 6 well plate에 계대배양한 후 H

O

및 眞武 湯 24시간 동안 처리 후 serum free 배지로 세포를 세척하고, PI/NP40(50 μg/mL PI, 0.03% tergitol,

type NP-40)으로 세포핵을 염색하여 형광현미경 혹은 유세포분석기를 이용하여 정량적 및 정성적 으로 분석하였다.

H

O

로 유도된 C6 glial 세포 손상을 세포핵의 형태 를 통하여 분석하기 위하여 DAPI(2-[4-amidinophenyl]

-6-indolecarbamidine dihydrochloride) 염색을 사용 하였다. C6 glial 세포를 cover glass에 배양한 후 眞武湯과 H

O

를 24시간 동안 처리하여 0.05%

PBS-T(phosphate-buffered saline-tween 20)로 세 척한 후 1 μg/mL DAPI로 염색하고, 형광현미경으 로 세포핵을 관찰하였다.

6) Western blot 분석

C6 glial 세포를 6cm 배양용기에 계대배양하고, 24시간 동안 H

O

및 眞武湯을 처리한 다음, 단백질 을 추출하기 위하여 세포를 PBS(phosphate-buffered saline)로 세척하고, RIPA(radioimmunoprecipitation assay) lysis buffer로 용혈하는 방법으로 총 단백질 을 얻었다. SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide gel electrophoresis) 상에서 전기영동 하여 단백질을 분리한 다음, nitrocellulose membrane 에 분리된 단백질을 흡착시키고, 여러 1차 항체(Bax, procaspase-3, PARP(poly(ADP-ribose) polymerase), p-IκBα 및 β-actin(Santa Cruz 社, USA))으로 표 지하였다. 다음으로 2차 항체로 다시 표식한 다음, 목적 단백질의 발현 정도를 ECL 용액(enhanced chemiluminescene kit, Roche 社, USA)을 처리하여 분석하였다.

7) NF-κB Luciferase reporter 분석

C6 glial 세포에서 IκBα의 인산화에 대해 H

O

및 眞武湯이 미치는 영향을 알아보기 위하여 western blot 방법으로 분석하였다.

NF-κB p65/p50이 활성화되어 핵으로 이동 후

target prometer gene에 결합하는 과정을 확인하기

위하여 luciferase reporter 분석을 수행하였다. C6

glial 세포를 6 well plate에 계대배양 후 170 ng의

플라스미드(85 ng NF-κB luciferase reporter와 85

ng pcDNA3-β-gal), 1 μL Tfx

-50 reagent 및 200

μ L serum free DMEM/HG를 처리하여 1시간 동 안 배양한 다음, 정상 배지를 넣고 24시간 동안 배 양하였다. H

O

및 眞武湯을 처리하고, 24시간 후 세포를 PBS로 세척하고 reporter lysis buffer로 용 혈한 다음, Luciferase assay system(Promega 社, USA)으로 luciferase activity를 분석하였다. 모든 과정은 시약 제조사에서 제공한 표준 protocol을 사용하였으며, 3회 이상 반복한 결과를 통계처리하 였다.

8) 염증성 사이토카인 분석

세포 밖으로 분비된 사이토카인을 분석하기 위 하여 C6 glial 세포를 24 well plate에 계대배양 후 H

O

및 眞武湯을 처리하고 24 시간이 경과한 다 음, 배양 배지에서 사이토카인을 분석하였다. 사이 토카인 분석은 Quantikine kit(R&D Systems, USA) 을 이용하여 분석하였으며, 모든 분석과정은 R&D 社에서 제공한 매뉴얼을 바탕으로 수행하였다.

9) 통계처리

표시된 실험 결과는 3회 이상의 독립적인 실험 의 결과이며, 통계처리는 One-Way ANOVA analysis 방법으로 처리하였고, p-value가 0.05 미만, 0.01 미 만( p< 0.05, p <0.01)의 경우를 유의한 것으로 판정하 였다.

Ⅲ. 결 과

1. H

O

농도에 따른 C6 glial 세포의 생존율 변화 H

O

에 의한 C6 glial 세포의 생존율을 조사한 결과 H

O

25 μM에서 세포 생존율은 약 80% 이 었고, 100 μM에서는 약 50%의 세포 생존율을 나 타내었으며, H

O

농도에 의존적으로 세포 생존율 이 감소되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 1).

Fig. 1. H

O

-induced C6 glial cell death.

C6 glial cells were incubated for 24 hr with H2O2at indicated concentrations. The cell viability was measured by MTT assay. Data represent the mean±S.E.M. of three individual experiments (*

p

2. H

O

로 유도된 C6 glial 세포사에 대한 眞武湯의 영향

眞武湯 자체의 독성을 조사하기 위하여 세포 생 존율을 조사한 결과 眞武湯은 400 μg/mL의 농도 까지 C6 glial 세포의 생존율에 영향을 주지 않았 으며, 600 및 800 μg/mL에서 약간의 독성을 나타 내는 것으로 확인되었다(Fig. 2). 본 연구에서이후 모든 실험을 400 μg/mL 농도의 眞武湯을 처리하 여 진행하였다.

H

O

에 의해 유도된 C6 glial 세포사에 대해 眞 武湯의 효과를 알아보기 위하여 MTT 방법으로 조 사한 결과 H

O

를 처리하여 약 50%의 세포 생존 율을 나타내었으며, 이러한 조건에서 眞武湯을 전 처리한 경우 50 μg/mL에서 60%, 100 μg/mL에서 70%, 200 μg/mL에서 85% 및 400 μg/mL에서 95%

이상의 세포 생존율을 나타내어 농도 의존적으로 H

O

에 의한 세포사를 억제하는 것으로 확인되었 다(Fig. 3).

H

O

에 의해 유도된 C6 glial 세포사에 대해 眞

武湯의 효과를 CV 염색 후 현미경을 통해 조사한

결과 H

O

처리군은 어떠한 처리도 하지 않은 대

조군에 비해 C6 glial 세포의 세포사가 현저하게

증가되었음을 확인할 수 있었으며, H

O

와 眞武湯 을 같이 처리한 실험군에서는 대조군이나 眞武湯 단독 처리군과 유사한 세포형태를 나타내는 것을 알 수 있었다(Fig. 4).

Fig. 2. Effect of JMT on C6 glial cell growth in a dose dependent manner.

JMT

of three individual experiments.

Fig. 3. Protective effect of JMT on H

O

-induced C6 glial cell death.

C6 glial cells were incubated with

JMT

Data represent the mean±S.E.M. of three individual experiments (*

p

p

Fig. 4. Protective effect of JMT on C6 glial cell death.

JMT

3. H

O

로 유도된 C6 glial 세포의 활성산소종 생성 에 대한 眞武湯의 영향

C6 glial 세포에서 H

O

에 의한 활성산소종 생성 과 이에 대한 眞武湯의 영향을 조사하기 위하여 DCF-DA 염색하여 유세포분석기로 분석한 결과 H

O

처리군에서는 대조군에 비하여 38.1% 정도의 활성산소종 증가를 나타내었으며, 眞武湯 및 H

O

를 같이 처리한 군에서는 활성산소종이 10.3%로 감소되었음을 확인할 수 있었다. 眞武湯 단독 처리 군에서는 활성산소종이 대조군과 유사한 정도로 나타남을 확인하였다(Fig. 5).

DCF-DA는 세포 내 활성산소종과 반응하여 녹

색 형광을 나타내므로 C6 glial 세포를 DCF-DA로

염색하고 형광현미경으로 분석한 결과 H

O

처리

군에서는 DCF-DA green fluorescence이 확인되어

다량의 활성산소종이 발견되었으며, 주로 핵 보다

는 세포기질(cytosol) 부분에서 강하게 발현되는

것을 알 수 있었다. 眞武湯을 H

O

와 같이 처리한

실험군에서는 H

O

처리군에 비해 활성산소종이

적게 발현되었으며, 대조군과 眞武湯 단독 처리군

에서는 basal level의 발현을 나타내었다(Fig. 6).

Fig. 5. Effect of JMT on H

O

-induced ROS formation in C6 glial cells.

JMT

Fig. 6. Effect of JMT on H

O

-induced ROS formation in C6 glial cell.

JMT and H2O2 were treated for 24 hr at the indicated concentrations. The cell fluorescent images were analyzed by fluorescent microscope after DCF-DA staining.

4. H

O

로 유도된 C6 glial 세포의 DNA 절편 생성 에 대한 眞武湯의 영향

H

O

로 유도된 C6 glial 세포의 DNA 분절현상 을 확인하기 위하여 PI 염색을 통하여 유세포분석 기로 분석한 결과 대조군에서는 PI로 염색된 전형 적인 DNA peak를 확인할 수 있었으며, DNA content 10

영역에서 특징적인 cell cycle인 G0/G1 phase 및 G2/M phase가 나타났다. 절편형성된 DNA는 Sub-G0 phase에서 확인할 수 있으므로 H

O

가 처리된 실험군에서는 세포주기에 특이적인 영향은 없었으나 Sub-G0 영역에서 DNA 절편 생 성이 23.3%로 증가되었음을 확인할 수 있었다. 이 러한 DNA 절편의 증가는 眞武湯처리에 의하여 대 조군이나 眞武湯 단독 처리군과 유사한 정도로 억 제됨을 확인할 수 있었다(Fig. 7).

H

O

로 유도된 C6 glial 세포 손상을 세포핵의

형태를 통하여 분석하기 위하여 DAPI 염색후 형

광현미경으로 세포핵을 관찰한 결과 대조군과 眞

武湯 단독 처리군에서는 정상적인 핵만을 관찰할

수 있었던 반면, H

O

가 처리된 군에서는 정상 세

포핵 뿐만 아니라 전형적 세포사 현상의 하나인

핵 응축(nuclei condensation)현상이 나타남을 확인

할 수 있었고, H

O

와 眞武湯을 함께 처리한 군에서

는 대조군이나 眞武湯 단독 처리군과 유사한 정도

로 응축현상이 억제됨을 확인할 수 있었다(Fig. 8).

Fig. 7. Effect of JMT on H

O

-induced formation of DNA fragmentation in C6 glial cells.

C6 glial cells were treated with

JMT

DNA contents were assessed by flow cytometer after PI staining.

Fig. 8. Effect of JMT on H

O

-induced DNA damage in C6 glial cells.

C6 glial cells were treated with

JMT

at indicated concentrations for 24 hr. Morphology of nuclei was analysed under fluorescent microscope after DAPI staining. White arrows indicate condensed nuclei.

5. H

O

에 의해 변화된 Bax, procaspase-3 및 PARP 단백질에 대한 眞武湯의 영향

H

O

에 의해 유도된 Bax, procaspase-3 및 PARP의 변화를 확인하기 위하여 western blot 방 법으로 분석한 결과 Bax는 H

O

에 의해 유도되는 세포자멸사와 관련하여 현저하게 발현이 증가됨을 확인할 수 있었으며, 이러한 발현 증가가 眞武湯에 의해 억제됨을 확인할 수 있었다. H

O

처리 시 procaspase-3가 진행(processing)되어 감소하는 것 을 확인할 수 있었고 이러한 감소가 眞武湯에 의 해 진행이 억제되어 증가함을 확인할 수 있었다.

동일한 패턴으로 H

O

에 의해 나타나는 PARP 단 백질의 분할(cleavage)이 眞武湯에 의해 억제됨을 확인할 수 있었다(Fig. 9).

procaspase-3가 진행되어 생성된 caspase-3의 활 성에 眞武湯이 어떤 영향을 미치는 지를 조사한 결과 H

O

가 처리된 C6 glial 세포에서는 caspase-3 활성이 증가되는 반면, 眞武湯이 처리된 C6 glial 세포에서는 caspase-3 활성이 감소되는 것을 알 수 있었으며, 이러한 결과는 Fig. 9에서 확인되었던 眞 武湯에 의한 procaspase-3 진행 억제와 상호 연관 성 있게 caspase-3 활성을 감소시키는 것을 알 수 있다(Fig. 10).

Fig. 9. Effect of JMT on H

O

-induced expression of Bax, procaspase-3 and PARP in C6 glial cells.

C6 glial cells were treated with

JMT

Fig. 10. Effect of JMT on H

O

-induced caspase-3 enzyme activity in C6 glial cells.

C6 glial cells were treated with

JMT

p

p

6. H

O

에 의한 IκBα의 인산화, NF-κB의 활성화 및 TNF-α 생성에 대한 眞武湯의 영향

NF-κB의 억제 단백질인 IκBα의 인산화 (phosphorylation)는 NF-κB를 핵 내로 이동시켜 염증성 사이토카인의 유전자 발현을 유도한다

. H

O

는 IκBα의 인산화를 증가시켰으며, 이러한 증 가에 대해 眞武湯은 억제효과를 나타내는 것으로 확인되었다(Fig. 11A).

핵 내로 이동한 NF-κB의 활성화에 대한 H

O

및 眞武湯의 영향을 알아보기 위하여 NF-κB luciferase reporter 분석을 수행한 결과 H

O

처리군에서는 대조군에 비해 NF-κB의 활성이 증가되었으며, 이 러한 증가가 眞武湯에 의해 현저하게 억제됨을 확 인할 수 있었다. 眞武湯 단독 처리군은 대조군과 유사한 정도의 활성을 나타내었다(Fig. 11B).

NF-κB에 의해 활성화되는 대표적 염증성 사이 토카인인 TNF-α 생성을 분석하였으며, 그 결과, H

O

는 TNF-α 분비를 촉진시켰으며, 眞武湯은 이 러한 TNF-α의 분비를 억제하는 효과를 나타내었 다(Fig. 12).

Fig. 11. Effect of JMT on H

O

-induced activation of IκBα and NF-κB in C6 glial cells.

(A) C6 glial cells were treated with

JMT

JMT

p

p

Fig. 12. Effect of JMT on H

O

-induced TNF-α secretion in C6 glial cells.

C6 glial cells were treated with

JMT

p

p

Ⅳ. 고 찰

뇌혈류가 16~18 mL/100g 조직/분 이하로 감소 하는 허혈성 상태가 지속되면 1시간 이내에 뇌경 색이 발생한다

. 허혈성 뇌졸중 발생 시 세포 에너 지 부족에 의해 Ca2+, Na+ 세포내 유입(influx)이 발생하여 세포괴사가 일어나며, 이러한 변화는 직 접적으로 세포자멸사 기전 활성화하거나 NOS 증 가 및 활성산소종 생성 유도를 통해 세포괴사 및 세포자멸사를 유도한다. 그 밖에도 허혈성 뇌졸중 의 경로는 염증반응의 활성화 및 재관류에 의한 활성산소종 증가와 관련성이 있다

.

활성산소종은 다양한 경로를 통해 세포괴사 및 세포자멸사를 유발한다. 과량의 활성산소종은 지질, 단백질 및 DNA의 산화 반응을 통해 세포 손상을 야기한다. 활성산소종의 종류로는 H

O

, superoxide radical, hydroxyl radical, singlet oxygen 등이 있으 며, 이 중 H

O

는 산화적 스트레스를 가중시키고, hydroxyl radical 등과 같은 다른 종류의 활성산소 를 증가시켜 세포 손상을 초래한다

.

신경계 관련 퇴행성 질환 및 뇌혈관 질환이 증 가함에 따라 glial 세포와 관련하여 관심이 증가하 였으며 다양한 연구가 진행되고 있다. 중추신경계 의 신경세포의 하나인 glial 세포는 산화적 스트레 스로부터 뉴런을 보호하는 기능을 하며, 치매, 허 혈성 뇌졸중과 관련하여 중요한 역할을 한다

. glial 세포와 관련한 연구로 趙

는 흰 쥐의 뇌세포 에서 유래한 C6 glial 세포에 paraquat, H

O

등으 로 세포사를 유도한 후 排風湯 처리를 통해 세포 보호효과가 있음을 보고하였다. 姜

은 흰 쥐의 C6 glial 세포를 배양하여 glutamate로 유도된 세포사 에 대한 歸脾湯의 보호효과를 보고하였으며, 高

는 glutamate로 유도된 흰 쥐의 C6 glial 세포 자멸사 에 대한 淸心蓮子飮의 보호효과를 보고하였다. 이 상과 같이 glial 세포 보호효과에 대한 다양한 연구 가 보고되고 있으며, 보고된 약물들은 보호효과를 통해 신경계의 퇴행성 변화를 예방할 것으로 생각

된다.

이에 본 연구에서는 활성산소종인 H

O

을 이용 하여 뇌세포에서 유래한 C6 glial 세포의 세포사를 유도한 후 眞武湯을 전처치하여 관찰할 결과, 眞武 湯이 허혈성 뇌졸중의 다양한 세포사 경로를 억제 하는 데에 효과가 있는 것을 알 수 있었다.

眞武湯은 溫陽利水의 효능으로 全身浮腫, 尿少, 心悸, 腹脹滿하고 舌苔白滑, 脈沈弦 등의 증상을 특징으로 하는 腎虛水泛證을 치료한다

. ≪傷寒論≫

에서는 太陽病 發汗 汗出不解 其人仍發熱 心下悸 頭眩 身瞤動 振振欲擗地者 眞武湯主之라 하여 어 지러움에 眞武湯을 응용하였고

, 그 밖에 筋惕身瞤

11,24

, 虛冷으로 인한 泄瀉, 軟便, 浮腫, 全身困倦, 食

慾不振

에 응용하였다. 문헌 고찰을 통하여 眞

武湯이 浮腫, 小便不利를 동반한 眩暈을 치료함을 알 수 있으며, 이를 근거로 임상에서 중추성 어지 러움에 眞武湯을 응용하여 유효한 효과를 거둔 사 례를 다수 확인할 수 있었다.

眞武湯은 白茯苓, 白芍藥, 炮附子, 白朮, 生薑 다

섯 가지 약재로 구성되어 있다. 眞武湯 구성 약물

의 심뇌혈관계에 대한 약리 작용 및 연구를 살펴

보면 白朮은 prothrombin 시간을 연장시켜 항응고

작용이 있으며

, 芍藥, 附子는 하지 말초 혈관, 관

상 혈관 등 일부 혈관에 대해 혈관확장 작용이 있는

것으로 알려져 있고

, 附子는 LPS(lipopolysaccharide)

로 유발된 생쥐의 혈중 IL-6(interleukin-6), TNF-

α 에 대하여 억제효과가 있는 것으로 알려져 있다

.

芍藥은 프리라디칼 소거 능력 및 H

O

로 유도된

DNA손상을 억제하는 것으로 알려져 있다

. 生薑

은 활성산소종 제거능 및 NF-κB 활성 억제 작용

이 있는 것으로 보고되었으며

, 白茯苓은 항산화

작용

및 백서의 국소 뇌혈류량을 증가시킨다는

보고가 있다

. 이를 통해 H

O

로 유도된 C6 glial

세포사에 대해 眞武湯이 보호효과가 있을 것으로

예상할 수 있으며 항응고 및 혈관확장, 혈류량을

증가를 통해 허혈성 뇌졸중을 치료하는데 유효할

것으로 생각된다.

이에 C6 glial 세포사에 대한 眞武湯의 보호효과 를 확인하기 위하여 본 연구를 설계하였으며, H

O

를 처리한 C6 glial 세포에 眞武湯을 전처리하여 세포 생존율을 조사하였고, 세포사의 표지가 되는 활성산소종, DNA 절편, Bax 단백질의 발현, procaspase-3의 진행, PARP 단백질의 분할, NF-κ B의 활성화, 염증성 사이토카인을 관찰하였다.

H

O

가 C6 glial 세포에 미치는 영향을 알아보기 위하여 H

O

를 농도별로 C6 glial 세포에 24시간 동안 처리한 후 MTT 분석 방법을 통하여 세포 생 존율을 조사한 결과, 농도 의존적으로 C6 glial 세 포의 세포사가 증가하는 것을 확인하였다(Fig. 1).

眞武湯에 의한 세포 보호효과를 확인하기 위하 여 眞武湯을 농도별로 1시간 전처리한 후 100 μM H

O

로 24시간 동안 배양한 결과, 眞武湯이 농도 의존적으로 H

O

에 의한 세포사를 억제하는 것을 확인할 수 있었으며, 400 μg/mL 농도에서 대조군 과 유사한 세포 생존율을 나타내었다(Fig. 3, 4).

C6 glial 세포에서 H

O

와 眞武湯이 활성산소종 에 어떤 영향을 미치는지 알아보기 위하여 실험을 설계하였다. 그 결과, H

O

에 의하여 세포 내 활성 산소종이 증가되었으며, 이러한 증가는 眞武湯에 의하여 감소됨을 확인하였다. 활성산소종이 생성되 는 주요 세포 내 기관은 미토콘드리아와 원형질막 (plasma membrane)으로 DCF-DA 염색을 통해 세포 내 활성산소종을 형태학적으로 관찰할 수 있 었으며, 眞武湯에 의해 발현이 억제됨을 알 수 있 었다(Fig. 5, 6).

세포자멸사의 전형적 특징은 DNA의 분절현상 으로

H

O

에 의한 발생한 DNA의 절편과 이에 대한 眞武湯의 영향을 PI 염색을 이용하여 분석하 였다. 그 결과, H

O

농도에 따라 DNA 절편이 증 가되는 것을 확인하였으며, 眞武湯에 의해 DNA 절편이 감소하여 DNA 분절현상이 억제됨을 확인 하였다. DAPI 염색을 이용하여 H

O

및 眞武湯을 처리한 후 세포핵 형태 변화를 관찰한 결과, H

O

가 처리된 C6 glial 세포는 세포사가 유도되어 핵

이 응축되고 나아가 세포자멸 소체(apoptotic body) 를 형성하였으며, 이러한 현상이 眞武湯에 의해 억 제되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 7, 8).

세포자멸사의 대표적인 단백질로 Bax, procaspase-3, PARP를 고려할 수 있다

. H

O

는 C6 glial 세포에 작용하여 Bax 단백질의 발현, procsapase-3와 PARP 단백질의 진행을 유도하였으며, 이러한 현상은 眞 武湯에 의해 억제되는 것을 확인하였다. H

O

에 의 해 활성화된 caspase-3 단백질의 효소 역시 眞武湯 에 의해 활성이 감소되는 것을 확인하였다(Fig. 9, 10). 이러한 연구결과를 통해 眞武湯이 지연성 세 포사의 주된 경로인 세포자멸사를 억제함을 알 수 있었으며, 眞武湯이 허혈성 뇌졸중의 치료에 응용 될 수 있을 것으로 생각된다.

NF-κB는 세포질에 국한되어 존재하며, 억제 단

백으로 알려진 IκB(IκBα, IκBβ, IκBγ, IκBε 등)

와 결합하여 비활성화 되어 있다. IκB kinase에 의

해 IκBα가 인산화 됨에 따라 NF-κB p65/p50가 핵

내로 이동하여 TNF-α, IL-1β(interleukin-1β), IL-6

등 염증성 사이토카인의 유전자 발현을 유도하게

된다17. 이러한 염증성 사이토카인의 활성화는 산

화적 스트레스를 가중시켜 세포를 손상시키는 경

로가 된다

. C6 glial 세포에서 IκBα의 인산화를

조사한 결과, H

O

에 의해 인산화가 증가됨을 확인

하였고, 眞武湯이 이를 억제하는 것으로 확인하였

다. NF-κB luciferase reporter 분석을 수행하여

NF-κB의 활성화를 확인한 결과, H

O

처리군은

대조군에 비해 NF-κB의 활성이 증가되는 것을 보

였으며, 이러한 증가가 眞武湯에 의해서 현저하게

억제됨을 확인할 수 있었다. 또한 H

O

에 의해 증

가된 TNF-α의 생성이 眞武湯에 의해 억제되는 것

을 확인하였다(Fig. 11A, 11B, 12). NF-κB의 활성

화 및 IκB의 인산화를 관찰하여 眞武湯이 전염증

단계에서 광범위하게 염증반응을 억제한다는 사실

을 확인하였으나, TNF-α 외에 다른 종류의 염증성

사이토카인에의 영향에 대한 실험이 추가적으로

시행되어야 할 것으로 생각된다.

이상의 결과로 부터 眞武湯은 활성산소종 생성 억제, DNA 분절현상 억제, Bax의 발현 억제, procaspase-3의 진행 억제, PARP 단백질의 분할 억제 및 NF-κB 활성화 억제의 경로를 통하여 C6 glial 세포의 보호효과가 있음을 알 수 있었다.

Ⅴ. 결 론

본 연구는 眞武湯의 뇌신경 세포 보호효과를 알 아보기 위하여 H

O

에 의해 유도된 C6 glial 세포 에 眞武湯을 전처리한 후 세포 생존율, 활성산소종 생성, DNA 절편 생성, 세포자멸사 관련 단백질의 변화, NF-κB 및 TNF-α의 변화를 관찰하여 다음 과 같은 결론을 얻었다.

1. H

O

는 C6 glial 세포의 생존율을 농도 의존적으 로 감소시켰다.

2. 眞武湯은 H

O

에 의해 감소된 C6 glial 세포의 생존율을 유의하게 증가시켰다.

3. 眞武湯은 C6 glial 세포에서 H

O

로 유도된 활성 산소종의 생성을 감소시켰다.

4. 眞武湯은 H

O

로 유도된 C6 glial 세포의 DNA 분절현상을 억제시켰다.

5. 眞武湯은 H

O

로 유도된 C6 glial 세포의 Bax 발현, procaspase-3 진행 및 PARP 단백질 분할을 억제시켰으며, caspase-3 효소 활성을 억제시켰다.

6. 眞武湯은 C6 glial 세포에서 H

O

로 유도된 IκBα의 인산화를 억제하여 NF-κ의 활성화를 억제시켰으 며, H

O

로 유도된 TNF-α 분비를 억제시켰다.

이상의 결과에서 眞武湯 추출물의 C6 glial 세포 보호효과는 활성산소종 생성 억제, DNA 분절현상 억제, Bax의 발현 억제, procaspase-3의 진행 억제, PARP 단백질의 분할 억제 및 NF-κB 활성화 억 제의 경로를 통하는 것으로 나타났다. 따라서 眞武 湯은 허혈성 뇌질환의 예방 및 치료에 활용될 수 있을 것으로 사료된다.

감사의 글

본 연구는 2012년도 원광대학교 교내학술연구비 지원을 받아 수행하였음.

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