LG 항-HBs 효소면역검사 시약의 성능 검사성흥섭

LG 항-HBs 효소면역검사 시약의 성능 검사

성흥섭․오흥범․김봉철․손미진*

울산의대 서울중앙병원 임상병리과, (주) LG화학 기술원 바이오텍Ⅱ 연구소*

Performance Evaluation of LG Anti-HBs Enzyme lmmunoassay Kit

Heungsup Sung, Heung Bum Oh, Bong Chul Kim, and Mi-Jin Sohn

Department of Clinical Pathlogy, University of Ulasn College of Medicine and Asan Medical Center, Seoul; Biotech Research Institute _Ⅱ , LG Chemical*, Taejon, Korea

Background：HBV infection is highly endemic in Korea. Precise evaluation of the prevalence of anti-HBs immunity can contribute to cutting of public health costs by reducing unnecessary HBV vaccination or booster doses. Moreover, some investigators have insisted that inclusion of anti-HBs in donor screening test might improve the safety of donated bloods. This study was intended to evaluate LG Anti-HBs EIA (LG Chemicals, Korea) kit by comparing with COBAS CORE Anti-HBs Quant EIA II (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland).

Methods：Prevalence of anti-HBs was estimated in 2,014 blood donors using LG Anti-HBs EIA. With another 261 samples from blood donors and 62 FANA-positive samples, the reactivities to LG Anti-HBs EIA were compared with those of COBAS CORE. The precision and the detection limit of LG Anti-HBs EIA kit were also evaluated.

Results：Of 2,014 blood donors, 1,639 (81.4%) were positive for anti-HBs. The concordance rate of LG Anti-HBs EIA and COBAS CORE was 98.5% (318/323). The sensitivity and specificity were 99.6% and 94.7%, respectively. The range of intra-run and inter-run coefficient of variation was 2.1-3.8% and 2.9-4.5%, respectively. The detection limit of the assay was 5 mIU/mL.

Conclusions：Our study shows that the LG Anti-HBs kit is a reproducible, sensitive, specific and rapid EIA kit for the detection of anti-HBs. Therefore LG anti-HBs would be helpful in Korean Blood Donation program and HBV vaccination program as a anti-HBs screening test.

Key Words：HBV, anti-HBs, LG Anti-HBs EIA, COBAS CORE Anti-HBs Quant II EIA, Korean Blood Donation program, HBV vaccination program

교신저자：오흥범 우) 138-736

전화：02-2224-4505, FAX：02-478-0884 E-mail：[email protected]

서 론

우리 나라는 B형 간염 바이러스(Hepatitis B Virus：

HBV) 감염의 만연지역이다. 1983년 HBV 백신사업이 도 입되기 이전에는 전 인구의 약 7.3%가 HBsAg 만성보유 자, 36%는 감염 후 자연면역된 상태, 약 15%는 항-HBc 에서만 양성을 보이는 상태로서 전 인구의 60%가 현재 혹 은 과거에 감염이 있었던 것으로 보고된 바 있다[1].

HBV 감염을 퇴치하려면 감염되지 않은 신생아, 소아 및

성인을 대상으로 HBV 백신을 주사하는 능동면역이 시행되

어야 한다. 능동면역을 위해 초기에는 HBV가 포함된 혈장

을 10배 희석한 후 1분간의 가열처리 과정으로 비활성화한

백신을 사용했으며[2], 최근에는 유전자 재조합 백신이 시

판되고 있다[3, 4]. 백신에 의해 생성된 항-HBs 역가는

접종 후 보통 1개월에 최고치를 보인 후 12개월까지 급속

히 감소하다가 그 이후는 서서히 감소하는 양상을 보이며

추가접종을 시행하면 4일 안에 다시 급속한 상승을 보이는

것으로 알려져 있다[5]. 감염방지를 위한 최소 항체역가는

통일된 의견은 아니지만 10 mIU/mL로 여겨지고 있으며

[3, 5], 항체역가가 저하된 경우는 추가접종이 고려될 수

있다[3, 6]. 최근에는 한 번 10 mIU/mL 이상의 역가를

보였던 사람은 항체역가가 그 이하로 떨어져도 추가접종을

할 필요가 없다는 보고들이 있다[7, 8]. 따라서 백신사업에 있어 항-HBs 검사는 추가접종 여부를 결정하는 점에서 그 중요성이 있다. 특히 면역억제 환자의 경우에는 매년 항체 역가를 측정하여 10 mIU/mL로 떨어질 경우 추가접종이 권고된다. 그러므로 백신사업에 검출 민감도가 좋지 않은 수동적혈구응집 (Passive hemagglutination：PHA) 방 법을 사용한다면 국가 보건의료비의 낭비가 초래될 수 있다 [9].

오 등[10]은 국내 혈액사업에서도 항-HBs 검사가 필요 하다고 제안한 바 있다. 항체 음성인 경우 백신 접종을 장 려하여 국민 보건향상에 기여함은 물론, 항-HBs 음성/항 -HBc 양성인 혈액만을 폐기하여 혈액안전성을 제고하자는 의견이다. 저자들도 헌혈혈액 중 HBsAg 음성이면서 항 -HBs 음성/항-HBc 양성 혈액은 HBsAg 음성혈액의 1.7%로 그 비율이 작은 반면 해당 혈액의 20%에서 HBV DNA가 발견되는 점을 들어 오 등[10]의 제안을 지지한 바 있다[11].

검출 민감도가 낮은 PHA의 단점 때문에 항-HBs 검사 는 효소면역검사(Enzyme immunoassay：EIA)로의 대치 가 바람직하며, 본 연구에서는 EIA 시약 중 국산 개발된 LG 항-HBs EIA 시약이 일단계 샌드위치(one-step sandwich) 기법을 사용하여 2시간 이내에 검사결과를 낼 수 있는 특징이 있어 외국산 시약과 일치율, 민감도, 특이 도 및 정밀도 등의 측면에서 비교하여 국내 백신사업과 혈 액사업에서의 유용성에 대하여 검토하고자 하였다.

재료 및 방법 1. 검 체

헌혈자 검체 2,014개(대한적십자사 산하 혈액원 검체 1,750개, 서울중앙병원 혈액원 검체 264개)를 대상으로 하여 항-HBs 양성율을 분석하였다. 별도의 261개 헌혈자 검체와 잠재적인 위양성 검체[12, 13]인 62개의 항핵항체 (Fluorescent antinuclear antibody：FANA) 양성 검 체를 이용하여 EIA 검사간의 성능을 비교하였다.

2. LG 항-HBs EIA 시약의 성능 평가 1) LG 항-HBs EIA 검사방법

마이크로웰에 음성표준검체, 양성표준검체 및 환자검체를 100 μL 씩 분주한 후 효소표지 항원용액을 25 μL 씩 넣 고 37℃에서 1시간 항온하였다. 5회 세척 후 기질용액 100 μL를 분주하고 실온에서 30분간 항온하고 반응정지 액 100 μL를 넣고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시 약내 포함되어 있는 음성표준검체(항체값 0 mIU/mL)와 두 개의 양성표준검체(항체값 10mIU/mL, 100mIU/mL) 를 이용하여, 표준검체의 signal to cut-off(S/C)를 기준 으로 회귀방정식을 MedCalc

통계프로그램(MedCalc

Software, Mariakerke, Belgium)으로 구한 후 개별 검 체의 S/C 값을 mIU/mL로 환산하였다. 동일한 일단계 샌 드위치 EIA 기법을 사용하는 COBAS CORE Anti-HBs Quant EIA II(Roche Diagnostics, Basel, Switzer- land：Roche COBAS CORE 항-HBs EIA)와 결과값을 비교하였다. Roche COBAS CORE 항-HBs EIA의 양성 기준이 10 mIU/mL로 되어 있어 LG 항-HBs EIA의 결 과값도 10 mIU/mL 이상을 양성으로 판정하였다.

2) 정밀도 분석

시약 내 포함되어 있는 100 mIU/mL 양성표준검체, 음 성표준검체(0 mIU/mL)와 100 mIU/mL 양성표준검체를 1:1 혼합한 검체(50 mIU/mL), 10 mIU/mL 양성표준검 체, 10 mIU/mL 양성표준검체와 음성표준검체를 1:1 혼 합한 검체(5 mIU/mL)에 대하여 정밀도를 분석하였다. 매 검사마다 각 물질을 4번씩 측정하고(intra-run) 6회 반복 검사(inter-run)를 실시하는 one-stage nested model [14]을 이용하여 검사내(intra-run) 및 검사간( inter-run) 의 변이계수(Coefficient of Variance：C.V.)를 구하였 다.

3) 검출민감도 분석

10mIU/mL의 양성표준검체를 음성표준검체로 2배 희석 하여 1:32까지 분석용 표준검체를 만들고 LG 항-HBs EIA에서의 반응도를 S/C 값과 mIU/mL로 분석하였다.

3. Roche COBAS CORE 항-HBs EIA 시약과의 성 능 비교

261개 헌혈자 검체와 62개의 FANA 양성검체를 이용하 여 LG 항-HBs EIA와 Roche COBAS CORE 항-HBs EIA 간의 일치율 및 Roche COBAS CORE 항-HBs EIA를 기준으로 한 경우 LG 항-HBs EIA의 민감도 및 특이도를 분석하였다.

결 과 1. 건강헌혈자에서의 항-HBs 양성율

헌혈자 2,014개 검체 중 1,639개 검체 (81.4%)가 양 성을 보였다. 대한 적십자사 산하 혈액원 검체 중에서는 81.1% (1,420/1,750), 서울중앙병원 혈액원 검체 중에서 는 83.0% (219/264)의 양성율을 보였다.

2. LG 항-HBs EIA 시약의 성능

1) Roche COBAS CORE 항-HBs EIA 시약간의 일치율, 민감도 및 특이도

헌혈자 261개 검체 중 258개 (98.9%)에서 두 시약간

에 일치된 결과를 보였는데 양성 207 검체 (79.3%)와 음

Table 1. Intra- and inter-run precision of LG Anti-HBsAb EIA

Sample Total

n Mean O.D.* Intra-assay Inter-assay

SD %CV SD %CV

5 mIU/mL 24 0.116 0.003 2.7 0.005 4.5

10 mIU/mL 24 0.237 0.009 3.8 0.007 2.9

50 mIU/mL 24 1.119 0.024 2.1 0.050 4.5

100 mIU/mL 24 1.810 0.041 2.2 0.080 4.4

*O.D.：Optical density

Fig. 1. Detection limit of LG Anti-HBsAb EIA Kit. After the two-fold serial dilution of 10 mIU/mL standard control, diluted controls were analyzed with scales of signal-to-cutoff (A) and mIU/mL (B). A. shows that all the controls containg more than 5 mIU/mL of anti-HBs give S/C values more than 1.0. B. also shows that the standard control which is estimated to be 5 mIU/mL of anti-HBs could give results in the range between 4 and 6 mIU/mL.

성 51검체 (19.5%)였다. 반면 불일치를 보인 검체는 3개 (1.2%)로써 LG 양성/ Roche 음성 2개 (0.8%), LG 음 성/ Roche 양성은 1개 (0.4%)였다. 불일치를 보인 3개 검체는 LG 항-HBs EIA에서 4-18mIU/mL이었고 Roche COBAS CORE 항-HBs EIA에서는 1-10mIU/mL이었 다. FANA 양성인 62개 검체에서는 60개 (96.8%)에서 일치된 결과를 보였는데 양성 39개(62.9%), 음성 1개 (33.9%)였다. 반면 불일치를 보인 검체는 2개 검체로 모 두 LG 항-HBs EIA에서만 양성이었으며, 각각 31 mIU/mL, 39 mIU/mL의 값을 보였다. 따라서 헌혈자 및 FANA 양성검체를 모두 합칠 경우 전체적인 일치율은 98.5% (318/323)이었다. 그리고 Roche COBAS CORE 시약을 기준으로 LG 항-HBs EIA의 민감도와 특이도는 각각 99.6% (246/247), 94.7% (72/76)이었다.

2) 정밀도 분석

4개의 서로 다른 농도의 표준검체에 대한 검사내 정밀도 (intra-run C.V.)는 2.1%에서 3.8%의 범위였고, 검사간 정밀도 (inter-run C.V.)는 2.9%에서 4.5% 범위였다 (Table 1).

3) 검출민감도

검출민감도에 대한 분석결과는 Fig. 1과 같다. S/C 1.0 이상을 양성으로 판정하였을 경우 1:2 희석검체(5 mIU/

mL)에서 분명한 양성을 보였고 1:4 희석검체부터는 음성 을 보였다. 또한 mIU/mL로 분석하였을 경우에는 1:2 희 석에서 4-6 mIU/mL의 분포를 보여 주었다.

고 찰

본 연구를 통하여 헌혈자에서 81.4%의 항-HBs 양성율 을 보여, 주 등[15]이 건강검진수검자 70,347명을 대상으 로 방사면역측정법(radioimmunoassay, RIA)으로 시행한 항-HBs 양성율 77.8%와 유사한 결과를 보였다. 주 등은 그 외에도 국내 백신사업과 혈액사업에서 고려해야 할 HBV 감염표지자의 분포에 관한 몇 가지 중요한 특징들을 보고하였다. 첫째는 HBV 감염표지자 (HBsAg, 항-HBs, 항-HBc)가 모두 음성인 군은 연령에 관계없이 10.7-24.1%

로 유사한 분포를 보인다는 것이며, 둘째는 항-HBs 단독양

성군은 10대, 20대에서 매우 높고 30대 이후부터는 서서

히 감소하는 양상을 보이는 반면 항-HBc 단독양성군은 10

대, 20대에서 매우 낮고 30대 이후에 서서히 증가하는 양 상을 보인다는 점이다. 첫째 특징 즉 모든 감염표지자가 음 성인 군은 예방접종을 받지 않았거나 혹은 예방접종 무반응 군으로 여겨지는데 이들을 찾아내어 예방접종 사업을 적극 적으로 시행하면 국민보건을 향상시킬 수 있을 것이다. 둘 째 특징을 국내 혈액사업과 관련지어 생각해 보면, 10대 및 20대가 많은 국내의 헌혈자 현황을 고려할 때 백신사업의 효과로 인해 헌혈혈액의 안전성이 제고되어가고 있음을 추 측할 수 있다. 또한 모든 B형 간염 표지자가 음성인 군이 10-24%이며, 항-HBc 단독양성군이 10대 및 20대에서 매우 낮은 점은 국내 혈액사업에 항-HBc 및 항-HBs의 도 입을 고려하는데 긍정적인 단서를 제공하는 것이라 할 수 있다.

장 등은 1997년부터 1999년까지 강원도내 초․중․고 등학생을 대상으로 HBV 감염표지자 양상을 분석한 연구에 서 백신사업이 시작된 이후에 출생한 초등학생 군에서 HBsAg 양성율(1.4%)이 중학생(3.2%) 및 고등학생 (3.4%) 보다 유의하게 낮았다고 하였다[16]. 그러나 항 -HBs 양성율은 전체적으로 47.4%였다고 보고하여, 주 [15] 등이 10대에서 82.7%의 양성율을 보고한 것과는 상 당한 차이가 있었다. 이러한 차이는 장 등의 연구가 보건기 관 접근이 용이하지 않은 강원도의 지역적 특징도 있겠지 만, 그보다 항-HBs 검사를 PHA법으로 시행한 것에 더 큰 원인이 있었다고 사료된다[9]. 장 등은 EIA 법이 PHA법 보다 민감도에서 우월하지만 가격이 비싸고 검사에 소요되 는 시간이 길어 집단검진시에 PHA법을 사용했다고 하였 다. 그러나 본 연구에 사용된 LG 항-HBs 시약은 검체 및 기질의 항온과정을 각각 60분과 30분으로 줄인 일단계 샌 드위치 (one step sandwich) 효소면역검사 기법을 사용 하고 있기 때문에 검체분리 및 분주를 고려하더라도 2시간 이내에 검사결과를 낼 수 있어 PHA법보다 오히려 더 빠른 보고가 가능하다. 그리고 국내에서 개발된 제품이기 때문에 외국산 PHA 제품을 대체할 수 있다는 잇점도 있다. 또한 항-HBs 결과를 토대로 추가백신을 시행하게 된다면 PHA 의 낮은 민감도는 궁극적으로 더 큰 국가 보건의료비의 손 실을 초래할 수도 있을 것이다[9].

본 연구에서는 LG 항-HBs 시약의 성능을 평가하기 위 하여 동일 일단계 샌드위치 EIA 제품인 Roche COBAS CORE 시약을 이용하였다. 두 시약간의 일치율은 98.5%

로 매우 높아 국산 LG 항-HBs 시약의 성능이 Roche COBAS CORE 시약의 성능과 동등함을 알 수 있었다. 특 히 헌혈자 검체에서는 98.9%의 일치율을 보였는데 불일치 를 보인 3개 검체도 모두 10 mIU/mL 경계역 부근의 역 가를 보였다. FANA 양성 검체 중 불일치를 보였던 2개 검체는 Roche COBAS CORE 시약에서 10 mIU/mL 미 만이었던 반면 LG 항-HBs 시약에서는 각각 31 mIU/

mL, 39 mIU/mL로 다소 높은 값을 보였다. 차 등[17]은

이러한 불일치 검체에 대하여 항원중화시험으로 추가확인 검사를 시행하기도 하였으나, 본 연구에서는 LG사가 사용 하는 항원을 그대로 이용할 경우 단순한 항체흡착과 항원중 화를 구분할 수 없다고 판단하여 추가검사를 시행하지 않았 다. 국내 항-HBs 양성율이 80% 가량인 본 연구결과를 고 려해 볼 때 FANA 양성검체에 대한 LG 항-HBs 시약의 반응을 모두 위양성으로 해석할 수는 없을 것으로 사료된 다. 전체적으로 FANA 양성검체를 포함하더라도 두 시약간 의 일치율이 98.5%인 점은 국산 LG 항-HBs 시약과 외국 산 Roche COBAS CORE 시약간에 성능의 차이가 없음을 보여주는 것이라 할 수 있다.

일반적으로 최소 방어항체 역가를 10 mIU/mL로 정하 는 경우에도 10 mIU/mL라는 수치보다는 개개인의 면역 반응의 차이, 항-HBs 역가의 감소, 검사의 재현성을 고려 하여 10 mIU/mL 이상 100 mIU/mL 이하의 넓은 역가 범위에서 백신에 대한 추가 접종군을 정하도록 권고하고 있 다[5]. LG 항-HBs 시약은 5-100 mIU/mL 전 구간에서 검사내 혹은 검사간 정밀도가 모두 5% 이내였다. 따라서 LG 항-HBs 시약을 사용하여 추가접종 여부를 판정하여도 문제가 없을 것으로 판단된다. LG 항-HBs 시약의 검출민 감도는 5 mIU/mL로 대략 4-6 mIU/mL의 범위에서 안 정된 값을 보였다. 수동면역된 항-HBs를 통하여 구해진 17.7-22.4일 (정맥내 주사), 23.8일 (근육내 주사)의 반 감기를 고려할 때, 한 번이라도 10 mIU/mL 이상의 역가 를 보였던 과거 백신 반응군은 항체 역가의 소실이 일어난 다 하더라도, 초기 역가에 비례하여 적어도 수개월간은 LG 항-HBs 시약에 양성을 보이게 될 것이다[18, 19]. 따라서 LG 항-HBs 시약은 낮은 역가의 백신 반응군을 민감하게 검색할 수 있어 백신 사업에 매우 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

결론적으로 국산 LG 항-HBs EIA 시약은 Roche COBAS CORE 시약과의 일치율이 98.5%이었으며, 5-100 mIU/mL 범위의 표준검체에 대해 2.1-3.8%의 검 사내 정밀도, 2.9-4.5%의 검사간 정밀도를 보였으며, 검출 민감도가 5 mIU/mL이면서 2시간 이내에 결과를 낼 수 있는 우수한 성능의 제품으로 평가되었다. 따라서 향후 백 신사업이나 혈액사업에 활용되는데 있어 손색이 없을 것으 로 사료된다.

요 약

배경：우리 나라는 HBV 감염의 만연지역이다. 정확한

항-HBs 검사는 불필요한 HBV 백신이나 추가 접종으로 인

한 국가 보건의료비의 낭비를 막을 수 있다. 무엇보다도 국

내 혈액사업에서도 항-HBs 검사를 시행하여 헌혈혈액의

안전성을 제고할 수 있다는 주장들이 있다. 이에 본 연구에

서는 LG(주)에서 국산 개발한 LG 항-HBs 효소면역검사

시약의 성능을 Roche사의 COBAS CORE 항-HBs 효소 면역검사와 비교하여 평가 고찰하였다.

방법：헌혈자 검체 2,014개를 대상으로 항-HBs 양성율 을 분석하였으며 별도의 261개 헌혈자 검체와 62개의 FANA 양성인 검체를 이용하여 LG 항-HBs EIA (LG Inc., Seoul, Korea)와 COBAS CORE Anti-HBs Quant EIA II (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland)간의 일치율 및 Roche COBAS CORE를 기준으로 한 경우 LG 항-HBs EIA의 민감도 및 특이도를 분석하였다. 시약 내 표준검체를 이용하여 one-stage nested model에 따라 정밀도 분석을 시행하였고 10 mIU/mL의 양성표준검체를 음성표준검체로 2배수 희석하여 검출민감도를 분석하였다.

결과：헌혈자 2,014개 검체 중 81.4%가 항-HBs 양성 을 보였다. Roche COBAS CORE 시약과는 98.5%의 일 치율을 보였는데 헌혈자 검체의 경우 98.9%, FANA 양성 검체의 경우 96.8%이었다. Roche COBAS CORE 시약 을 기준으로 할 경우 LG 항-HBs 시약의 민감도와 특이도 는 각각 99.6%, 94.7%이었다. 5-100 mIU/mL 범위의 표준검체에 대해 검사내 정밀도는 2.1-3.8%이었으며, 검 사간 정밀도는 2.9-4.5%의 범위이었다. 검출민감도는 5 mIU/mL이었다.

결론：국산 LG 항-HBs EIA 시약은 Roche COBAS CORE 시약과의 일치율, 정밀도 및 검출민감도가 우수하고 2시간 이내로 비교적 신속하게 검사가 가능한 우수한 제품 으로 평가되어 향후 국내 백신사업이나 혈액사업에 활용하 는데 유용할 것으로 사료된다.

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