, Sung-Mo Kang

미세조류 Chlamydomonas reinhardtii dZL 균주의 100 L 평판형광생물 반응기를 이용한 대량 배양에서의 접종 농도에 따른 바이오매스 생산 성 향상 연구

박한울^1,2, 강성모², 민지호¹, 김준호², 조용희², 김기현², 진언선³, 홍성주^1,2,이철균^1,2*

A Study on the Effect of Initial Cell Density on Biomass Productivity of a Microalga Chlamydomonas reinhardtii dZL in Large-scale Cultiva- tion Using 100 L Flat-Panel Photobioreactors

Hanwool Park

, Sung-Mo Kang

, Ji-Ho Min

, Jun-Ho Kim

, Yonghee Cho

, Ki-Hyun Kim

, Eonseon Jin

, Seong-Joo Hong

, and Choul-Gyun Lee

*

Received: 29 January 2020 / Revised: 18 March 2020 / Accepted: 20 March 2020

© 2020 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering

Abstract: Beside the commercialized pigments from microal- gae, such as astaxanthin, beta-carotene, and c-phycocyanin, zeaxanthin is another pigment with great potential for com- mercialization as it can be used to prevent or cure age-related macular degeneration. However, low zeaxanthin productivity due to its low content in microalgal biomass has been the major obstacle to commercialization. With recent advances in genome editing technology, a green microalga Chlamydomo- nas reinhardtii dZL was engineered to accumulate zeaxanthin with growth by knocking out enzymes that convert zeaxan- thin into other carotenoids. In the present study, C. reinhardtii dZL was cultivated using TAP medium in 100 L flat-panel photobioreactors (PBRs), and the effect of initial cell density (ICD) on biomass productivity in batch operation was investi-

gated. ICD of 0.1 g/L was predicted to yield highest biomass productivity from experiments using 2 L bubble column PBRs.

In 100 L flat-panel PBRs, as ICD increased from 0.005 g/L to 0.08 g/L, biomass productivity was increased from 0.03 g/L/

day to 0.16 g/L/day. However, further increasing ICD from 0.08 g/L to 0.16 g/L reduced to 0.14 g/L/day as the maxi- mum biomass concentration was limited by the light intensity.

The results showed that ICD could affect biomass productiv- ity in positive and negative ways, and thus ICD should care- fully be determined with regards to the culture conditions.

Such strategy could be applied to improve productivity for other compounds of interests in other microalgae as well.

Keywords: air-lift photobioreactor, inoculum cell density (ICD), macular pigment, scale-up

1. INTRODUCTION

광합성이 가능하여 유기탄소원 없이 이산화탄소와 무기영 양염 및 물을 이용해 환경친화적으로 대량 생산이 가능한 미 세조류는 건강보조제, 오메가-3 함유 유지, 물고기 사료, 바 이오연료, 색소 등 다양한 제품 생산에 이용되어왔다 [1-3].

이러한 유용물질의 생산성 향상이나 새로운 물질을 생산하

1공과대학 생물공학과, 인하대학교, 인천광역시 22212, 대한민국

1Department of Biological Engineering, Inha University, Incheon 22212, Korea

Tel: +82-32-872-7518, Fax: +82-32-873-7518, e-mail: [email protected]

2생물산업기술연구소, 인하대학교, 인천광역시 22212, 대한민국

2Institute of Industrial Biotechnology, Inha University, Incheon 22212, Korea

3생명과학과, 한양대학교, 서울특별시 04763, 대한민국

3Department of Life Science, Hanyang University, Seoul 04763, Korea

Note

기 위해 지질 생산성이 뛰어나거나, 저온 생장성이 뛰어난 종 등 미세조류를 대상으로 한 생물탐색(bioprospecting)이 광범위하게 이루어져 왔다 [4,5].

최근에는 미세조류를 위한 분자생물학적 기술이 발달하여 기존 종의 대사공학을 통한 균주 개발로 특정 대사산물을 더 많이 생산하게 하는 것이 가능케 되었다. 원핵 광합성 미생 물인 시아노박테리아 Synechocystis sp. PCC 6803에서는 대 사공학을 통해 바이오연료로 사용할 수 있는 탄화수소 및 바 이오플라스틱의 원료가 되는 polyhydroxybutyrate의 생산성 을 향상시킨 바 있다 [6,7]. 진핵 미세조류인 Nannochloropsis salina에서는 전사 인자(transcription factor)를 과발현시켜 바이 오매스와 지질 생산성을 향상시켰고, Nannochloropsis oceanica 에서는 diacylglycerol acyltransferase를 과발현시켜 지질 생 산성을 늘렸다 [8,9].

색소는 미세조류에서 생산되는 대표적인 고부가가치 물질 로 Haematococcus pluvialis 유래의 astaxanthin과 Dunaliella salina 유래의 β-carotene, Arthrospira platensis 유래의 c- phycocyanin이 가장 크게 상업화되어 판매되고 있다 [10-12].

이러한 대표적인 색소 외에 zeaxanthin도 미세조류에서 생산 될 수 있는데, zeaxanthin은 lutein과 함께 인체 망막의 황반에 집중적으로 분포하고 있으며, 노인성 황반변성을 예방하는 데 중요한 작용을 하는 것으로 밝혀져 의약품 원료로 사용될 수 있다 [13,14]. 메리골드, 케일 및 많은 미세조류 종 들에서 축적되어 대량 생산이 용이한 lutein과는 달리 zeaxanthin은 astaxanthin, violaxanthin 등 다른 색소 물질을 합성하기 위한 중간 단계의 물질로 바이오매스 내에 축적이 되지 않아 대량 생산이 어려웠었다 [15,16]. 하지만, 최근 Chlamydomonas reinhardtii 종을 DNA-free CRISPR-Cas9 RNP유전자 편집 기 술로 zeaxanthin이 다른 색소로 전 환되는 대사경로를 차단 하여 zeaxanthin 함량을 야생종의 0.04 mg/g에서 2.4 mg/g으 로 현저히 증가시킨 균주를 개발하여 zeaxanthin 대량 생산 의 길을 열었다 [17]. 미세조류를 이용한 지질 생산 공정은 통상적으로 바이오매스를 증가시키는 단계와 지질을 축적 하는 단계로 나누어지는데 반해 유전자 편집된 C. reinhardtii 균주는 세포 농도와 배양액 내 zeaxanthin 농도가 비례하게 증가하는 것으로 나타났다. 즉 본 균주의 경우 바이오매스와 zeaxanthin 축적 단계가 구분되지 않기 때문에 바이오매스 생산성을 향상시키는 것이 곧 zeaxanthin 생산성 향상으로 이어질 수 있는 것이다. 본 연구에서는 상술한 zeaxanthin을 축적할 수 있는 C. reinhardtii dZL 균주를 100 L 평판형 광생 물반응기(flat-panel photobioreactor, FP-PBR)를 사용해 대량 으로 배양하고, 바이오매스 생산성을 높이기 위해 미세조류 접종 농도를 조절하는 실험을 수행하였다.

미세조류 바이오매스 생산성은 배양기의 종류, 배지 조성, 빛 공급 조건, 배양액 교반 등 다양한 인자의 영향을 받는다 [18-21]. 본 연구에서는 C. reinhardtii dZL 균주 생산을 통해 황반변성 치료제의 원료로 zeaxanthin을 생산하는 것을 목적 으로 하였기 때문에, 오염 가능성이 낮고 연중 일정한 생산 이 가능한 실내에서 FP-PBR을 이용한 대량 배양기술을 개

발하고자 하였다. 이런 배양 조건에서는 일반적으로 배지에 공급되는 영양분 내지 광도에 의해 최고 바이오매스 농도가 결정되기 때문에, 미생물 공정에 널리 사용되는 배치 배양 공정에서 배지 내 영양분을 모두 사용하고 바이오매스 생산 성을 최대화할 수 있는 접종 농도 연구를 수행하였다.

2. MATERIALS AND METHODS

CRISPR-Cas9 RNP 유전자 편집기술로 zeaxanthin epoxidase 유전자가 knock-out된 Chlamydomonas reinhardtii dZL 균주 를 진언선 교수 (한양대학교 생명과학과)로부터 제공받아 본 연구에 사용하였다 [17]. 종균은 250 mL 삼각 플라스크에 100 mL를 넣어 진탕 배양기 (VS-8480SF, Vision Scientific Co., Ltd., Daejeon, Korea)에서 120 rpm으로 교반 시키며 형광등 을 이용해 50 μmol/m²/s의 광도로 24시간 빛 공급과 20^oC의 온 도에서 배양하였다. 배양 배지는 TAP (Tris-Acetate Phosphate) 배지를 사용하였으며 조성은 tris base 2.42 g/L, MgSO4·7H₂O 100 mg/L, CaCl₂·2H₂O 50 mg/L, NH₄Cl 400 mg/L, K₂HPO₄ 108 mg/L, KH₂PO₄ 56 mg/L, ZnSO₄ ·7H₂O 22 mg/L, H₃BO₃ 11.4 mg/L, MnCl₂·4H₂O 5.1 mg/L, CoCl₂·6H₂O 1.6 mg/L, CuSO₄· 5H₂O 1.16 mg/L, (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 1.1 mg/L, FeSO₄·7H₂O 5 mg/L, Na₂EDTA 50 mg/L, CH₃COOH 1 mL/L로 구성되었다.

2.2. 미세조류 배양

미세조류 배양 실험은 2-L 기포탑 광생물반응기 (bubble column photobioreactor, BC-PBR)와 100-L FP-PBR을 이용하 여 수행하였다 (Fig. 1). BC-PBR에는 2 L의 배양액을, FP- PBR에는 100 L의 배양을 채워 미세조류를 배양하였다. 배양 실의 온도는 20^oC로 유지하였고, 이산화탄소가 2% 섞여 있 는 공기 (2% CO2 enriched air)를 0.1 vvm의 속도로 폭기하여

Fig. 1. Photobioreactors Used for Algal Cultivation, (A) 2 L BC- PBRs with white fluorescence light bulbs, (B) 100 L FP-PBR with red and blue (4:1) LEDs.

미세조류의 광합성에 따른 pH 상승을 억제하고 배양액 혼합 을 하였다. 빛은 24시간 공급하였고 광원으로는 BC-PBR에 서는 3파장 형광등을 이용해 200 μmol/m²/sec의 광도로, FP- PBR에서는 적색 파장과 청색 파장이 4:1 비율로 혼합된 LED 패널을 사용해 185 μmol/m²/sec의 광도로 공급하였다 (Sunjin Lighting Co. Ltd., Namyangjoo, Gyunggi-do, Korea).

BC-PBR 실험에서는 실험군 당 두 개의 배양기를 사용해 미 세조류를 배양하였으며, 실험 결과는 평균값과 실험값의 범 위를 오차범위로 표기하였다. FP-PBR 실험에서는 실험군 당 한 대의 배양기를 사용해 실험을 진행하였다. 접종 농도 에 따른 바이오매스 생산성을 평가하기 위하여 BC-PBR 실 험의 종균은 400 mL BC-PBR에서 미세조류를 배양한 뒤 사 용하였다. FP-PBR 실험은 1차적으로 2 L BC-PBR 3개에서 종균을 준비하여 FP-PBR에 0.005, 0.02 g/L의 농도로 접종하 여 실험을 진행한 뒤, 생산된 바이오매스를 이용하여 0.04, 0.08, 0.16 g/L의 농도로 접종하여 고농도 접종 실험을 진행 하였다.

2.3. 미세조류 바이오매스 농도 분석

Coulter Counter (Multisizer 4e, Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA)를 사용해 미세조류 세포의 농도와 부피를 측정한 후, 실험적으로 젖은 세포 중량과 건조 중량의 비율을 이용 해 계산하여 미세조류 배양액의 바이오매스 농도를 결정하 였다. 평균적으로 미세조류 바이오매스의 젖은 세포 중량의 30%가 건조 세포 중량으로 확인되었다. 미세조류 바이오매 스 생산성은 다음 식을 사용해 계산하였다:

BP는 바이오매스 생산성(g/L/day), C2 – C1은 t2와 t1의 바이 오매스 농도 차이(g/L), t1은 배양 시작점, t2는 배양기간(day) 이다.

3. RESULTS AND DISCUSSION

C. reinhardtii 종을 2 L BC-PBR에 0.004, 0.02 g/L의 접종농 도 (initial cell density, ICD)로 시작하여 9일간 배양하였다.

배양 후 바이오매스 농도는 ICD가 0.004, 0.02 g/L일 때 각각 148배, 30배 증가하였으나 농도 상으로는 0.61, 0.64 g/L로 큰 차이를 보이지 않았다 (Fig. 2). 최고 농도에 도달하는데 소요 된 기간은 ICD가 0.004 g/L였을 때 9일, ICD가 0.02 g/L였을 때 8일로 상대적으로 고농도로 접종하였을 때 더 빨리 최고 농도에 도달하였다. 이에따라 바이오매스 생산성은 ICD가 0.004, 0.02 g/L였을 때 각각 0.068, 0.077 g/L/day로 상대적으 로 고농도로 접종하였을 때 더 높았다. 즉, 저농도로 접종하 였을 때에는 대수증식 기간이 길어져 더 높은 비율로 미세조 류 바이오매스가 증가하지만, 실질적으로 생산되는 질량은 고농도로 접종하였을 때 더 높았다.

상기 배양 데이터를 기반으로 접종 농도에 따른 바이오매 스 생산성을 예측하기 위한 분석을 실시하였다. Fig. 2의 배 양 0 ~ 7일차에 해당하는 바이오매스 농도로 접종하였을 때 해당 실험군에서 도달했던 최고 바이오매스 농도까지 증가 할 것이라 가정하여 접종 농도에 따른 배치 바이오매스 생산 성을 분석하였다 (Fig. 3). 예를 들어 ICD가 0.004 g/L인 실험 군의 2일차 도달 바이오매스 농도인 0.028 g/L로 접종하였을 때에는 7일뒤 0.614 g/L에 도달하여 0.084 g/L/d의 바이오매 스 생산성을 달성할 것으로 예측하였다. 그 결과, 0.1 g/L로 접종하였을 때 바이오매스 생산성이 가장 높을 것으로 파악 되었다. 배양이 진행되어 미세조류 바이오매스 농도가 증가 할수록 세포 당 공급받는 빛에너지의 양이 줄어들고 배지 내 영양분이 소비되기 때문에, 광도를 상승시켜주지 않는 경우 세포가 최대 속도로 생장하기 어려워진다 [22]. 바이오매스 농도가 0.2 g/L에 도달할 때 까지는 미세조류 세포들이 대수 증식을 하였기 때문에 상대적으로 높은 농도에서 바이오매 스 생산성이 증가하였는데, 그보다 높은 농도에서는 세포 당 빛에너지의 양이 감소하여 세포 생장 속도가 느려진 상태로 배양이 진행되어 바이오매스 생산성이 점점 낮아지는 것으 로 판단된다. 결론적으로, 0.1 g/L의 농도로 접종하는 것이 바 이오매스 생산성을 극대화시킬 수 있을 것으로 분석되었다.

미세조류 대량 배양에는 해양배양기, 개방 수로형 연못 (raceway pond), 광생물반응기 등 다양한 종류의 배양기를 사용할 수 있다 [19,23,24]. 개방형 배양기는 가치는 낮으나 BP C₂–C₁

t₂–t₁ ---

=

Fig. 2. Changes in Biomass Concentration in 2 L BC-PBRs with different ICDs.

Fig. 3. Estimated Biomass Productivity as a function of ICD.

시장 규모가 거대한 바이오연료, 사료와 같은 제품 생산에 적합하고, 폐쇄형 광생물반응기는 오메가-3 지방산, 색소와 같은 고부가가치 제품 생산에 적합하다 [25,26]. 본 연구에서 는 C. reinhardtii 바이오매스 생산을 통해 최종적으로 황반변 성 치료제의 원료로 zeaxanthin을 생산하는 것이 목표였기 때문에 연중 일정하게 생산이 가능하고 오염 가능성이 낮은 100 L FP-PBR을 이용해 대량배양을 진행하였다.

2 L BC-PBR를 이용한 실험에서와 같은 온도, 광도, 기체 폭기 조건에서 100 L FP-PBR을 이용한 미세조류 배양 실험 을 진행하였다. 형광등을 사용할 시 높은 발열량으로 인해 배양액 온도를 유지하는 것이 어려워 LED 패널을 이용해 같 은 광도로 빛을 공급하였다. BC-PBR 실험에서 바이오매스 생산성이 가장 높을 것으로 예측된 0.1 g/L로 접종하기 위해 서는 10 g의 바이오매스가 요구되는데 FP-PBR 1대를 해당 농도로 접종하려면 0.65 g/L의 바이오매스 농도에 도달한 2 L BC-PBR 16대가 필요하여 규모확대가 용이하지 않았다.

따라서, ICD를 0.005, 0.02 g/L로 상대적으로 저농도에서 배 양을 먼저 진행한 뒤, 생산된 바이오매스를 활용해 ICD를 높 여 실험을 진행하였다. 배양 실험 결과 낮은 0.004 g/L에서도 최고 농도가 차이가 나지 않았던 2 L BC-PBR에서의 결과와 는 달리 0.005 g/L로 낮은 농도로 접종하였을 때에는 최고 농 도가 0.56 g/L에서 0.21 g/L로 낮아졌다 (Fig. 4). 현미경으로 세포를 관찰한 결과, 저농도 접종 실험군에서는 세포가 파열 되어 잔해가 다수 부유하고 있는 것을 관찰할 수 있었으며, 최종적으로 바이오매스를 수확하였을 때에도 cell debris로 판단되는 흰색의 paste가 온전한 세포로 판단되는 초록색 paste와 함께 수확되어 상당비율의 바이오매스가 손실된 것 으로 판단되었다. BC-PBR에서는 한 구멍을 통해 가스가 주 입되는 반면 FP-PBR에서는 배양기 밑면에 설치된 타공 파 이프를 통해 20곳 이상의 구멍에서 가스가 주입되어 더 높은 전단 응력이 세포에 가해진다. 세포 농도가 높을 때에는 생 장 및 분열을 하는 세포의 비율이 높아 이런 현상에 의한 문 제가 발생하지 않았지만, 초기 세포 농도가 낮을 때에는 손 상을 입은 세포의 비율이 상대적으로 높아 최종 농도에까지 큰 영향을 미친 것으로 보인다. 접종 농도가 더 높았던 후속 실험에서는 해당 문제가 발생하지 않는 것으로 확인되었다.

대량배양시 고농도 접종에 따른 미세조류 바이오매스 생 산성을 평가하기 위해 0.04, 0.08, 0.16 g/L로 C. reinhardtii dZL 균주를 접종하여 배양하였다. 5일간 배양 결과, ICD가 0.08, 0.16 g/L일 때 최고 농도 0.59 g/L를 기록하였고, ICD가 0.04 g/L일 때에는 5일차에 0.47 g/L에 도달하였다 (Fig. 5).

바이오매스 생산성은 ICD가 0.04 g/L일 때 5일기준 0.086 g/

L/day, ICD가 0.08, 0.16 g/L일 때 3일기준 각각 0.157, 0.139 g/L/day로 고농도로 접종할 때 현저히 증대되었다. ICD를 0.08 g/L에서 0.16 g/L로 증가시켰을 때에는 최고 농도가 0.59 g/

L 이상 높아지지 않았다. 광합성을 하는 미세조류의 광독립 배양에서는 광도와 세포농도에 따라 광합성과 호흡이 평형 을 이루는 보상점에 도달하면 더 이상 바이오매스 합성이 이 루어지지 않는데, 본 실험의 배양환경에서는 0.59 g/L의 바 이오매스 농도에서 보상점에 다다른 것으로 판단된다 [27].

따라서 0.16 g/L로 접종하였을 때에는 공급한 영양염의 농도 가 아니라 광도가 농도 제한 인자로 작용하여 공급된 영양염 을 전부 사용하지 않는 단점이 있는 것으로 나타났다.

100 L FP-PBR에서의 배양 실험 결과를 이용해 접종농도와 바이오매스 생산성을 비교하였다 (Fig. 6). 2 L BC-PBR의 배 양 결과를 이용해 예측한 것과 유사하게 C. reinhardtii dZL의 접종 농도가 약 0.1 g/L일 때 바이오매스 생산성이 가장 높은 것을 확인할 수 있었다. 특히, FP-PBR을 이용한 대량 배양에 서는 접종 농도가 0.1 g/L 미만일 때 바이오매스 생산성의 감 소 폭이 2 L BC-PBR 배양시보다 컸는데 이는 두 배양기의 규모와 상술한 폭기 방식의 차이 때문일 것으로 생각된다.

Fig. 4. Changes in Biomass Concentration in 100 L FP-PBRs with

0.005 g/L and 0.02 g/L ICDs. Fig. 6. Biomass Productivity in 100 L FP-PBRs by ICD.

Fig. 5. Growth Profiles in 100 L FP-PBRs with different ICDs.

본 연구에서 소규모 배양기에서의 결과로 대규모 배양기의 바이오매스 생산성을 정확히 추산하지는 못하였으나, ICD 가 약 0.1 g/L때 바이오매스 생산성이 최대치 일 것이라는 패 턴은 동일하게 나타났다. 동일한 배지와 유사한 광도 조건을 사용했던 본 연구 결과를 바탕으로 C. reinhardtii dZL의 바이 오매스 내지 zeaxanthin 생산성 증대를 위한 연구, 특히 파장, 광도의 영향을 연구할 때 소규모 배양기에서 해당 인자에 대 한 실험을 먼저 진행하여 대략적인 조건을 도출한 후 대량 배양기에 적용하여 생산성을 증대시키는 전략으로 사용할 수 있을 것으로 사료된다.

4. CONCLUSION

본 연구에서는 황반변성 치료제의 원료로 사용하기 위한 고 순도 zeaxanthin의 대량생산을 위한 Chlamydomonas reinhardtii dZL 균주 대량배양의 바이오매스 생산성을 향상시키기 위 한 접종농도를 연구하였다. 소규모 2 L BC-PBR에서의 배양 실험 결과를 토대로 TAP배지 사용시 약 0.1 g/L의 농도로 접 종하는 것이 가장 높은 바이오매스 생산성을 얻을 수 있을 것으로 예측하였고, 대규모 100 L FP-PBR을 사용한 배양 실 험을 통해 이를 검증하였다. 대량배양에서 0.04 g/L의 농도 로 접종하였을 때의 바이오매스 생산성 (0.086 g/L/day) 대비 0.08 g/L의 농도로 접종하였을 때 바이오매스 생산성이 83%

증가 (0.157 g/L/day) 하여 접종농도를 높여 바이오매스 생산 성을 향상시킬 수 있음을 보였다. 접종농도를 0.16 g/L로 더 높였을 때에는 광도에 의해 바이오매스 농도가 제한되어 배 지내 영양분을 전부 사용하지 않는 단점이 있었다. 본 실험 결과를 통해 TAP배지를 이용한 C. reinhardtii 대량배양시 0.1 g/L로 접종하여 72시간 뒤 0.58 g/L에 바이오매스를 수확 하는 것이 배치 배양에서의 바이오매스 생산성을 극대화시 킬 수 있는 것으로 나타났다. 본 연구에서 보인 접종농도 조 절을 통한 바이오매스 생산성 향상 전략은 다른 미세조류의 바이오매스 및 유용물질 생산성 향상에도 기여할 수 있을 것 으로 판단된다.

Acknowledgements

본 논문은 해양수산부의 재원으로 해양바이오 전략소재 개 발 및 상용화 사업(20190066, 미세조류로부터 AMD 치료용 zeaxanthin의 대량생산기술) 및 과학기술정보통신부의 재원 으로 한국연구재단의 해양·극지기초원천기술개발사업 (NRF- 2016M1A5A 1027462)의 지원을 받아 수행하였습니다.

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