Original Article
원고 접수일 2012년 7월 2일, 원고 수정일 2012년 7월 29일, 게재 확정일 2012년 11월 5일
책임저자 김민근
(210-702) 강릉시 죽헌길 7, 강릉원주대학교 치과대학 구강악안면외과학교실 Tel: 033-640-2753, Fax: 033-640-3113, E-mail: [email protected]
RECEIVED July 2, 2012, REVISED July 29, 2012, ACCEPTED November 5, 2012
Correspondence to Min Keun Kim
Department of Oral and Maxillofacial Surgery, College of Dentistry, Gangneung-Wonju National University
7, Jukheon-gil, Gangneung 210-702, Korea
Tel: 82-33-640-2753, Fax: 82-33-640-3113, E-mail: [email protected]
CC This is an open access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/
by-nc/3.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
가토의 두정골 결손부 모델에서 수산화인회석에
4-hexylresorcinol을 혼합하여 만든 인공합성골이식재의 골형성효과에 대한 연구
김민근ㆍ박용태ㆍ김성곤ㆍ박영욱ㆍ이석근1ㆍ채원식2
강릉원주대학교 치과대학 구강악안면외과학교실, 1구강병리학교실, 2한국기초과학지원연구원 강릉센터
Abstract
The Effect of a Hydroxyapatite and 4-hexylresorcinol Combination Graft on Bone Regeneration in the Rabbit Calvarial Defect Model
Min Keun Kim, Yong Tae Park, Seong-Gon Kim, Young-Wook Park, Suk-Keun Lee
1, Weon-Sik Choi
2Departments of Oral and Maxillofacial Surgery,
1Oral Pathology, College of Dentistry,
Gangneung-Wonju National University,
2Gangneung Center, Korea Basic Science Institute
Purpose: The aim of this study was to evaluate the effect of 4-hexylresorcinol and hydroxyapatite combination graft on bone regeneration in the rabbit calvarial defect model.
Methods: Ten New Zealand white rabbits were used for this study. Bilateral round shaped defects (diameter: 8.0 mm) were created on the parietal bone. 4-hexylresorcinol and hydroxyapatite combination graft material was grafted into the right parietal bone defect area (experimental). The left bone defect area was not filled with anything (control). The animals were sacrificed at 4 weeks and 8 weeks after grafting. A micro-computerized tomography of each specimen was taken, and the specimens were stained for histological analysis.
Results: The average value of bone mineral density (BMD) and Bone volume (BV) was higher in the experimental group than in the control group at 4 weeks and 8 weeks after surgery. However, the difference was not statistically significant (P>0.05) at 8 weeks after grafting. The BMD and BV in the experimental group at 4 weeks after surgery was significantly higher than those in the control group (
P
＜0.05).Conclusion: 4-hexylresorcinol and hydroxyapatite combination graft material showed higher initial bone formation than the control, however, there was no difference at 8weeks after operation.
Key words: 4-hexylresorcinol, Hydroxyapatite, Bone regeneration
서 론
구강악안면 영역에서의 골 결손은 외상이나, 감염, 선천적 기 형, 또는 발치 후 흡수와 같은 생리적 과정 등 여러 가지 원인에 의해 발생한다. 이러한 골 결손부에 새로운 골 형성을 유도하기 위하여 골이식을 시행하는 것은 일반적인 방법이며 자가골, 이종 골, 합성골 등이 골 결손부를 재생시키기 위하여 흔히 사용되는 재료들이다. 자가골이 순수한 골성장의 면에서 볼 때 가장 이상적 인 이식재료로 알려져 있지만 이식재를 얻기 위해 공여부에 추가 적인 수술을 시행해야 하기 때문에 공여부에서 여러 합병증들이 발생할 수 있으며, 수술시간이 길어지고, 얻을 수 있는 이식재의 양에도 제한이 따르며, 흡수가 많이 일어난다는 단점도 가지기 때문에 상황에 따라서는 이종골이나 합성골의 적용이 필요하다 [1,2]. 이에 조직공학에서는 인공적인 재료를 활용하여 이상적인 뼈이식재를 개발하고자 다양한 시도가 이루어져 왔다[3,4].
본 연구에 사용된 수산화인회석(Ca
10(PO4)6(OH)2, HA)은 인간 골조직의 주요 무기질 성분이며 그 조성이 뼈조직의 apatite 와 매우 유사하여 뛰어난 생체친화성이 있는 것으로 잘 알려져 있다. 또한 수산화인회석은 골전도 성질 및 생체적합성, 생활성이 우수하며 숙주골로 대체되는 성질이 있다. 수산화인회석이 나노 미터 크기의 섬유구조로 사용될 경우 마이크로미터 크기의 동일 성분 재료에 비해 단백질 흡수와 세포부착이 증가되는 경향이 있다. 또한 세포활성도(bioactivity)가 증가하며[5,6], 골모세포 모양의 세포(osteoblast-like cell)의 성장을 촉진한다. 이와 같은 여러 가지 장점들로 인해 수산화인회석은 골이식재의 구성 성분으 로 많이 사용되고 있다[7,8]. 4-heylresorinol (4-HR)은 천연 페 놀 합성물로서 예로부터 피부나 점막의 소독제 또는 새우나 사과 등의 갈변을 막는 재료로 널리 사용되어 왔으며 큰 독성은 보고된 바 없어 그 안전성이 입증되어 있다[9-11]. 또한 최근 연구 결과에 서 4-HR은 강력한 tyrosine kinase 억제제로서 nuclear factor (NF)-κB 경로를 차단하여 파골세포의 분화를 억제하며[12], transglutaminase-2를 억제하여[13] 소염효과를 보인다고 보고 되었다.
이에 본 교실에서는 4-HR과 수산화인회석이 새로운 화합물을 형성하여 골이식에 사용될 경우 감염에 저항이 우수하며 양호한 골 형성을 얻을 수 있는 물질을 형성할 것이라는 가설을 세우고 수산화인회석과 4-HR의 화합물을 가토의 두개골에 이식하여 그 효과에 대하여 평가하여 보고자 하였다.
연구방법
1. 실험 재료
실험에 사용된 수산화인회석과 4-HR은 Sigma-Aldrich (St.
Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였으며, 수산화인회석과 4-HR을 증류수에 녹여 침전물은 버리고 상층액을 동결건조시켜 분말 형태의 복합물을 만들었다.
2. 적외선 흡수 스펙트럼 측정(Fourier-transform infrared (FT-IR) absorption measurements)
실험에 사용된 재료들의 화학적 조성의 정성적 분석을 위하여 적외선 흡수 분광 분석을 실시하였다. 600∼4,000 cm
1영역에 대한 적외선 흡수 스펙트럼은 Vertex 80 분광기(Bruker Optics, Ettlingen, Germany)에 연결된 Hyperion 3000 현미경을 이용 하여 측정하였다. 모든 스펙트럼은 ATR 대물렌즈(×20 ob- jective, 100 μm Ge crystal)를 이용하여 측정되었으며, 4 cm
1의 분해능으로 32회 반복 스캔을 통하여 얻었다.
3. 전자주사현미경검사(scanning electron microscopy [SEM])
수산화인회석, 4-HR, 수산화인회석과 4-HR의 화합물 각각의 전자현미경검사를 시행하였으며 형태학적 분석을 시행하였다.
표본을 Plate에 고정한 후 각각의 표본을 금으로 얇게 코팅한 후 SEM (H-800, Hitachi, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.
4. 동물 실험
본 연구는 강릉원주대학교 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)의 승인(GWNU- 2011-18)을 얻은 후, 위원회의 지침에 따라 수행하였다. 실험동물 은 충분한 크기의 골 결손부를 형성할 수 있고, 골 형성 능력이 뛰어나며 관리 및 처치가 용이한 생후 10∼11주의 체중 2.0∼2.5 kg New Zealand산 백색 가토(Samtako, Osan, Korea) 10마리 를 강릉원주대학교 창업보육센터 내에 설치되어 있는 동물 사육시 설에서 실험동물용 고형사료와 물을 충분히 공급하며 일정기간 사육한 뒤 실험에 사용하였다. 전신마취를 유도하기 위하여 0.5 mL의 tiletamine과 zolazepam (125 mg/mL; Zoletil; Bayer Korea, Seoul, Korea)과 0.5 mL of xylazine hydrochloride (10 mg/kg body weight; Rompun; Bayer Korea)를 사용하였 다. 실험동물의 두정골 상부 피부를 제모하고 10% Povidine-io- dine 용액으로 소독한 다음 수술 중 지혈 목적으로 2% lidocaine (epinephrine 1:100,000)을 주사하였다. 두피의 정중부에 시상 방향으로 절개를 시행한 후 피부 및 골막을 거상하여 두정골을 노출시켰다. 정중봉합부에 대칭이 되도록 두정골상에 trephine bur를 이용하여 지름 8 mm의 두 개의 골 결손부를 형성하였다.
4-HR과 수산화인회석 화합물(4-HR+HA)을 우측 결손부에 이식
하고 좌측 결손부는 아무것도 이식하지 않은(unfilled control)
상태로 두었다. 골 결손부 상방에 골막을 위치시킨 후 골막과
근육을 3-0 silk로 봉합하였다. 술 후 감염 방지를 위해 gentami-
Fig. 1. Fourier-transform infrared result of HA, 4-HR, 4-HR+HA.
4-HR, 4-heylresorinol; HA, Ca10(PO4)6(OH)2.
cin 1 mg/kg (Kukje Pharm, Seongnam, Korea) 및 Pyrin 0.5 mL/kg (Green Cross Veterinary Products, Yongin, Korea)을 1일 3회 3일간 근육주사하였다. 수술 4주 후 5마리의 토끼를 희생시킨 후 bur를 이용해 실험군과 대조군을 포함한 두개골 부위 표본을 채취하였다. 표본은 10% 중성 formalin 용액 에 담가 보관하였으며 미세 전산화단층 촬영을 시행하였다. 수술 8주 후 나머지 5마리의 토끼에 대해 4주 때와 같은 과정을 시행하 였다. 그 후 그 조직 표본은 조직학적 조직 형태학적 평가를 시행하였다.
5. 미세 전산화 단층 촬영(micro-computerized tomography, μ CT)
4주, 8주에 미세 전산화단층 촬영을 Skyscan 1076 (Skyscan, Kontich, Belgium)을 이용하여 0.035 mm 두께로 촬영하였으 며, 촬영된 이미지는 CT-AN. 1.10 program을 이용하여 3차원적 으로 재구성되었다. 실험에 사용된 골 결손 부위의 직경이 약 8 mm이고 깊이가 약 2 mm 정도의 원통형이므로 관심영역(the region of interest)은 결손부 크기와 형태에 맞게 100.4 mm
3(8×8×3.14×2)로 설정하였다. 각 표본 결손부의 bone vol- ume (BV, mm
3), bone mineral density (BMD)를 분석하여 골 형성 능력을 평가하였다.
6. 조직학적 분석
미세 전산화단층 촬영 분석 후 조직표본들은 5% nitric acid를 이용하여 약 1주간 탈회시키고 ethanol 및 xylene을 이용하여 탈수시킨 후 파라핀 블록에 포매하여 0.6 μm 두께의 박절편을 만들어 Masson's Trichrome 염색을 시행하였다. 얻어진 조직표 본은 광학현미경으로 조직학적 소견을 관찰하였고 디지털 현미경 카메라(DP-20; Olympus, Tokyo, Japan)를 사용하여 광학 현미 경상 소견을 디지털 이미지로 취득하였다.
7. 통계 분석
동일 동물에서의 샘플간의 결과 비교를 위하여 SPSS for win- dow ver. 19 (IBM Co., Armonk, NY, USA)를 이용해 paired t test를 시행하였으며, 통계학적 유의성 수준은 P ＜0.05로 설정 하였다.
결 과
1. 적외선 흡수 스펙트럼 측정(FT-IR absorption meas- urements) 분석 결과
실험에 사용된 수산화인회석은 적외선 흡수 분광 분석으로부터 특징적인 진동 흡수 스펙트럼을 보여주었다(Fig. 1). 1,036과
1,092 cm
1에서 관찰되는 주요 흡수 피크는 수산화인회석의 PO
43-ν3 비대칭 진동모드에 해당한다. 3,570 cm
1의 약한 흡수 는 수산화인회석의 수산화기(-OH)의 진동에 기인하며, 3,000에 서 3,700 cm
1영역에서 관찰되는 넓은 흡수는 수산화인회석에 흡착된 물 분자에 기인한 것이다. 4-HR 분자는 알킬 사슬과 두 개의 수산화기를 포함하는 방향족 고리로 구성되는데, 흡수 스펙 트럼은 이를 반영하는 전형적인 흡수 피크들을 각각 보여주고 있다. 2,854, 2,919, 2,958 cm
1의 흡수 피크는 알킬 사슬 C-H의 신축 진동(stretching vibration)에 의한 것이며, 3,037 cm
1흡 수는 방향족(aromatic) 고리의 C-H 진동에 해당한다. 또한 3,343 과 3,427 cm
1피크를 포함하는 넓은 영역에서의 흡수는 방향족 에 결합된 수산화기의 수소결합(hydrogen bond)에 의한 것이 다. 수산화인회석과 4-HR을 조합 시 4-HR의 전형적인 흡수 피크 들은 그대로 유지되었다. 반면에 수산화인회석은 4-HR의 가리움 (screening) 효과로 흡수 스펙트럼의 세기가 크게 감소하였으나, HA의 ν3 비대칭 진동으로부터 기인하는 기여도가 큰 1,066 cm
1흡수 피크(화살표로 표시) 관찰로부터 수산화인회석을 확인 할 수 있었다.
2. 전자주사검사(SEM) 결과
수산화인회석은 둥근 형태(Fig. 2A)를 보였으며 4-HR은 바늘 모양으로 관찰되었다(Fig. 2B). 이 두 물질로 복합물을 형성하였 을 때 서로 엉켜서 성게모양으로 융합되어 새로운 화합물을 이루 는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 2C).
3. 미세 전산화단층 촬영(μ CT) 결과 분석
미세 전산화단층 촬영 결과 이식 후 4주에서는 복합물을 이식한
실험군에서 BV, BMD 모두에서 통계적으로 유의할 만한 골 형성
을 보였으며, 이식 후 8주 결과에서도 실험군에서 다소 많은 골
형성이 있었던 것으로 나타났으나 통계적으로 유의하지는 않았다
Fig. 2. Scanning electron microscopic image of (A) HA, (B) 4-HR, (C) 4-HR+HA. HA, Ca10(PO4)6(OH)2; 4-HR, 4-heylresorinol.
(Fig. 3, Table 1).
4. 조직학적 분석 결과
4주 대조군에서는 커다란 골 결손부가 대부분 섬유성 조직으로 대체되고 있는 양상이 관찰되며(Fig. 4A1, 4A2) 고배율에서는 신생골 형성이 거의 관찰되지 않고 섬유조직 주위로 약간의 신생 혈관만이 관찰되었다(Fig. 4A2). 골 결손부의 가장자리를 고배율 로 관찰해 보았을 때 골증식체(Osteophyte)의 형성은 관찰할 수 없었다. 4주 실험군 소견에서는 골결손부의 일부에서 부분적인 신생골 형성이 관찰되며 아직 서로 이어지지 않은 소견을 보였다.
(Fig. 4B1). 고배율 소견에서 신생골은 활발한 골 형성을 보이며 두꺼운 trabecular bone의 형성이 관찰된다(Fig. 4B2, 4B3, 4B4). 8주 소견에서 대조군과 실험군 모두에서 유사한 정도의 신생혈관 형성 및 골 형성이 관찰되었고, 이식골이 아직 흡수되지 않고 일부분 남아 있는 소견이 관찰되었다. 대조군(Fig. 4C)에서 섬유성 조직이 콜라겐 조직으로 변하여 파랑색으로 염색된 것이 관찰되었으며, 실험군의 8주까지의 조직 소견에서 이식재 주위에 특이할 만한 염증 소견은 관찰되지 않았다(Fig. 4B, 4D).
고 찰
구강악안면 영역에서는 외상이나 종양 등 다양한 원인으로 골 결손부가 생기게 되며 골이식이 필요한 경우가 많이 발생한다.
자가골이 결손부를 재건하기에 가장 이상적이라 일반적으로 받아 들여지고 있지만 공여부의 합병증 및 채취량의 제한, 흡수 등[1,2]
의 문제가 있어 보다 사용이 간편하고 양에 제한 없이 사용할 수 있고 그 흡수 속도 조절이 가능하여 심미적 기능적으로 환자의 상태를 복원해 주기 용이한 이상적인 골이식재를 개발하고자 하는 연구들은 다양한 방법으로 시도되어지고 있다[14,15]. 본 연구도 이러한 시도 중 하나로 현재까지 골이식재로 가장 선호되어 사용 되고 있는 수산화인회석에 4-HR을 첨가하여 좀 더 이상적인 골이 식재를 만들어보고자 하였으며 이 새로운 복합물의 골 재생 능력 을 가토에서 평가해 보고자 하였다.
이번 실험에서는 두 가지 물질, 즉 수산화인회석과 4-HR을
사용하였다. HA는 전통적으로 자가골이식재의 대체물로서 가장
선호되어 왔으며 장기간 비교적 안정적인 결과를 보여주고 있으므
로 그 특징을 변화시키지 않고 새로운 화합물을 이루어 낸다면
Table 1. Microscopic computerized tomography analysis
Variable
4 weeks 8 weeks
Control (unfilled)
Experimental
(4-HR+HA) P -value Control
(unfilled)
Experimental
(4-HR+HA) P -value BV (mm3)
BMD (mg/mm3) 10.81±7.28
0.384±0.06 18.31±3.76
0.489±0.13 0.017*
0.043* 12.85±7.15
0.391±0.176 23.77±4.11
0.443±0.660 0.61 0.153 Values are presented as mean±standard deviation.
4-HR, 4-heylresorinol; HA, Ca10(PO4)6(OH)2; BV, bone volume; BMD, bone mineral density.
*Statistically significant P ＜0.05.
Fig. 3. Micro-computerized tomog- raphy analysis. (A) Control group at 4 weeks after grafting. (B) Experi- mental group at 4 weeks from grafting. (C) Control group at 8 weeks after grafting. (D) Experi- mental group at 8 weeks after grafting.
매우 생체적합성이 좋으며, 인접된 경조직이나 연조직에 잘 부착 한다는 기존의 수산화인회석의 장점들에 4-HR의 장점이 더해져 서 더 좋은 성질을 가진 새로운 골이식재가 개발될 수 있을 것으로 기대하였다. 본 실험에서는 4-HR의 성질 중 소독제로의 성질 [11-13]이 감염에의 저항성을 좋게 하여줄 것으로, 파골세포의 기능을 억제[14]하는 성질이 골 형성에 도움이 될 것으로, 소염효 과[15]를 가진다는 성질이 이식재의 숙주에서의 염증반응을 줄이 는 데 도움이 될 것으로 생각하여 실험을 진행하였다.
수산화인회석에 4-HR을 섞은 화합물의 주사전자현미경(SEM) 소견에서 서로 자연스럽게 융합하여 성게모양의 새로운 화합물을
형성함(Fig. 2)을 관찰할 수 있었으며, 이렇게 형성된 화합물의 성질을 분자수준에서 간접적으로 평가해 보기 위하여 적외선흡수 스펙트럼 분석(FT-IR absorption measurements)을 시행해 본 결과 4-HR의 전형적인 흡수 피크들은 그대로 유지되며, 수산화인 회석의 고유 피크도 유지됨을 확인하였고, 이를 통하여 이 화합물 이 각각의 고유의 특징들을 유지하며 새로운 화합물을 형성하였다 고 생각하였다.
새로운 화합물의 생체내 골 결손부에 대한 골 형성 효과를
확인하기 위하여 시행된 본 실험에서 새로운 물질을 이식한 그룹
에서 이식하지 않은 그룹에 비하여 초기 4주까지 골 형성은 미세
Fig. 4. Histologic views at 4 weeks and 8 weeks after grafting (Masson’s trihrome staining). (A) Control group at 4 weeks after grafting.
(B) Experimental group at 4 weeks from grafting. (C) Control group at 8 weeks after grafting. (D) Experimental group at 8 weeks after grafting.
전산화단층 촬영 분석결과(Table 1)와 조직학적 분석결과(Fig.
4)를 토대로 볼 때 우수하다고 생각한다. 이러한 소견을 보인 원인은 다음과 같이 설명해 볼 수 있다. 먼저 기존의 연구에서 밝혀진 대로 4-HR이 세포의 부착을 증가시켜서[16] 초기의 골 형성에 도움을 주었을 것이라고 생각해 볼 수 있으며, 또 다른 원인으로 4-HR이 파골세포의 기능장애를 일으켜서 골 형성을 촉진시켰을 것이라고 생각해 볼 수 있다. 4-HR이 NF-κB 기능의 조절에 영향을 주어 receptor activator of nuclear factor-kappa B에 의해 매개되는 NF-κB signaling pathway에 손상을 일으켜 파골세포의 기능에 장애을 가져온다는 것은 이전의 연구결과에서 보고된 바 있다[12].
이번 실험에서 8주 결과에서는 실험군과 대조군의 골 형성에 있어서 통계학적으로 유의할만한 차이가 없는 것으로 나타났다 (Table 1). 이를 통해 4-HR의 골 형성에의 효과가 골 재생 초기에 주로 작용한 것으로 생각할 수 있으며, 8주까지 골 형성능력이 지속되지 못한 원인을 규명하기 위하여 4-HR의 생체 내에서의
작용시간에 대한 연구 등의 추가적인 연구가 시행되어야 할 것이 라 생각한다.
본 연구 결과에서 보여준 이식 초기의 골 재생능력에 근거하여
이 새로운 이식재를 임상화하기에는 많은 제약이 따른다. 우선
골 재생이 초기에서만 효과가 있었는데 그 이유에 대한 확인
및 골 재생 효과를 지속시키기 위한 연구도 필요할 것이라 생각한
다. 또한 파골세포의 기능 장애에 의해 골 형성이 증가된 것이라면
새로 생성된 골의 골질이 장기적으로 어떠할 것인지에 대한 추가
연구도 필요할 것이라 생각한다. 새로운 골이 형성된 기전이 아직
명확하게 밝혀지지 않았으며, 이 새로운 이식재가 사람에게 가질
수 있는 잠재적인 독성에 대한 연구도 시행되지 않았기 때문에
향후 이러한 점들에 대한 추가적인 연구가 꼭 시행되어야 할
것이다.
결 론
수산화인회석과 4-HR을 혼합하여 만든 새로운 합성 이식재는 이식 초기에 양호한 골 형성을 유도하며 골 이식재료로서 유리한 감염에의 저항성 및 골 흡수의 억제 등의 성질을 지니므로 추가적 인 연구가 뒷받침된다면 보다 좋은 성질의 새로운 이식재로 개발 될 가능성을 보일 것으로 생각한다.
Acknowledgements
This study was supported by a grant from the Next- Generation BioGreen21 Program (Center for Nutraceutical &
Pharmaceutical Materials no. PJ009051), Rural Development Administration, Republic of Korea.
References
