Silk Fibroin and Substance P Combination Graft for the Reconstruction of a Bone Defect

Original Article

원고 접수일 2011년 3월 9일, 게재 확정일 2011년 4월 10일 책임저자 박영주

(150-950) 서울시 영등포구 대림 1동 948-1, 강남성심병원 구강악안면외과 Tel: 02-1577-5587, Fax: 02-849-4469, E-mail: [email protected]

RECEIVED March 9, 2011, ACCEPTED April 10, 2011 Correspondence to Young-Ju Park

Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Gangnam Sacred Heart Hospital

948-1, Daerim 1-dong, Youngdungpo-gu, Seoul 150-950, Korea Tel: 82-2-1577-5587, Fax: 82-2-849-4469, E-mail: [email protected]

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실크 피브로인 지지체와 Substance P를 이용한 골 이식재

박기유ㆍ최교희ㆍ박영주ㆍ송지영¹ㆍ김성곤¹ㆍ조유영²ㆍ권해용²ㆍ강석우²

한림대학교 의학과 치과학교실, ¹강릉원주대학교 치과대학 구강악안면외과학교실, ²농촌진흥청

Abstract

Silk Fibroin and Substance P Combination Graft for the Reconstruction of a Bone Defect

Ki-Yu Park, Kyo-Hee Choi, Young-Ju Park, Ji-Young Song

, Seong-Gon Kim

, You-Young Jo

, Hae Yong Kweon

, Seok-Woo Kang

Department of Dentistry, College of Medicine, Hallym University,

1

Department of Oral and Maxillofacial Surgery, College of Dentistry, Gangneung-Wonju National University,

2

Sericultural & Apicultural Materials Division, National Academy of Agricultural Science, RDA

Purpose: Substance P is a well known neurotransmitter and has been known to mediate pain. Recently, it has been unveiled that substance P is involved in the recruitment of mesenchymal stem cells to wound sites. The purpose of this study was to exam bone formation when a combination of substance P and silk fibroin was used in a bone defect model.

Methods: Twenty rabbits were used and 40 calvarial defects were formed. They were divided as 4 groups (unfilled control, silk only, silk＋10μg/ml substance P; Sub10, and silk＋100μg/ml substance P; Sub100). All animals were humanely sacrificed 4 or 8 weeks after grafting. The specimens were analyzed by micro-computerized tomography and histological analysis.

Results: When compared to the unfilled control to silk only group, there was significant difference in bone mineral density (BMD) and the attenuation coefficient (AC) at 4 weeks (

P

P

P

Conclusion: The silk fibroin scaffold showed higher BMD and AC than the unfilled control. The combination graft with substance P and silk fibroin scaffold showed a faster graft degradation than with a silk fibroin scaffold only.

Key words: Substance P, Silk fibroin, Bone graft

서 론

골 결손부의 수복을 위하여 다양한 종류의 골이식재가 개발되 어왔다. 가장 이식적인 골이식재는 자가골이기는 하지만 공여부 가 제한되어있고 채취할 수 있는 뼈의 양이 한정되어 있으며 공여부의 수술에 따른 합병증 등이 자가골 이용의 제한점으로 이해되고 있다[1-4]. 이에 조직공학에서는 인공적인 재료를 활용 하여 뼈 이식재로 사용하고자 다양한 시도가 되어왔다[5].

조직공학에서 필요로 하는 뼈 이식재의 구성성분으로는 (1) 줄기세포나 조골세포와 같은 세포들, (2) 지지체(scaffold), (3) 칼슘 공급원, (4) 성장인자를 고려할 수 있다. 이들 구성성분 중에서 일부가 다른 요소를 골 결손부에 유인할 수 있는 능력을 가진다면 이식재의 구성성분은 단순화되며 그러한 이식재가 제조 편의성 등을 고려할 때 더욱 활용 가능성이 높은 이식재라 할 수 있다[6-8].

조직공학의 구성성분 중에서 지지체에 대한 연구는 가장 많이 이루어져 왔고 최근에는 곤충 단백질을 이용한 지지체의 제작이 많은 관심을 끌고 있다. 곤충 단백질은 제조 단가가 싸고 쉽게 이용 가능하기 때문에 다양하게 응용되고 있는데, 그 중에서 누에 에서 생산되는 실크의 경우 의료 분야에서 봉합사로 많이 이용되 어 왔다[9]. 최근에는 실크를 조직공학의 지지체로 사용하려는 시도가 많이 이루어져 왔는데 그 사례로는 인공 혈관이나 인공 고막과 같은 성과물로 나타나고 있다[10-12].

실크 단백질을 지지체로 사용하여 뼈를 만들려고 하는 시도도 많이 이루어져 왔는데, 아직 상품화되어 나와 있는 것은 없다.

그 이유는 혈관이나 고막은 섬유성 조직의 합성을 유도하는 것만 으로도 조직의 재생이 가능하나 뼈의 경우에는 교원섬유가 합성된 곳에 석회화가 진행되어야 하기 때문이다. 석회화의 진행은 염증 반응에 의하여 영향을 받는데, 실크 단백질의 경우 이종 거대 단백질이라서 분해에 시간이 많이 걸리고 이에 따른 염증 반응이 만성적으로 지속되기 때문에 이러한 반응이 완료되기 전에는 활발 한 골조직의 재생이 어렵다고 사료된다.

이에 따라 실크 단백질을 뼈 조직의 재생을 위한 지지체로 사용하기 위하여는 가공 과정을 통하여 염증 반응을 최소화시키고 지지체의 흡수를 기대하기 보다는 지지체상에 바로 석회화가 진행 될 수 있도록 유도하는 방향으로 나아가게 되었다. 이러한 이유에 서 실크 단백질 지지체 상에 줄기세포나 조골세포와 같은 뼈를 만들 수 있는 능력을 가진 세포를 탑재하여 골 결손부에 이식하려 는 시도가 이루어지게 되었다[13,14].

하지만 지지체에 세포를 탑재하기 위하여는 몇 가지 고려 사항 이 있는데 (1) 지지체의 다공성, (2) 지지체에 대한 세포 부착, (3) 지지체의 경도나 탄성이 있고 지지체에 약제가 탑제되어 있다 면 이러한 약제의 방출 곡선 같은 것이 중요한 요소이다. 일반적으 로 확산에 의하여 영양 공급이 가능한 범위는 200μm 이내이므로

그 이하의 깊이로는 세포가 자라들어가기가 어렵다. 그래서 지지 체는 영양 공급이 심부까지 잘될 수 있도록 충분히 다공성을 가져야 하고 이러한 기공은 서로 연결이 되어 세포간에 신호 전달에 아무런 문제가 없어야 한다[15,16].

Substance P는 주로 상처 부위에 발현이 많은 적은 분자량의 단백질로서 동통과 연관된 신호 전달 물질로 널리 알려져 있다.

하지만 최근의 연구에 의하면 substance P는 골수에 존재하는 미분화 간엽세포(mesenchymal stem cell)에 대한 화학 주성에 관여하여 substance P의 농도가 높은 곳으로 미분화 간엽세포를 끌어들이는 역할을 하게 된다[17,18]. 지지체에 줄기세포를 탑재 하여 이식하는 고전적인 방식의 경우 세포 생존의 생존율이 이식 재의 승패를 좌우하기 때문에 기술적인 제한이 많았지만[19] 지지 체에 substance P만을 탑재하는 방식의 경우 줄기세포가 지지체 로 스스로 찾아올 수 있기 때문에[20] 이식재의 관리가 훨씬 용이 해진다. 또한 substance P의 분자량이 적으므로[21] 합성이 용이 하여 성장인자의 탑재에 따른 제조 비용 증가를 최소화할 수 있다고 사료된다.

　따라서 본 연구의 목적은 실크 피브로인 지지체에 substance P를 탑재한 경우 골 결손부의 재생에 도움이 되는 지를 평가하는 데에 있으며 이를 위하여 가토의 두정골 골결손부 모형을 사용하 였고 평가는 미세 전산화 단층 촬영과 조직학적 분석을 통하여 시행하였다.

연구방법

1. 실크 지지체의 준비 및 substance P 처리

　실크 지지체는 실크 피브로인으로 제조된 다공성 구조를 가진 것으로 농촌진흥청에서 공급을 받았다. Substance P는 Sigma사 (Chicago, IL, USA)에서 구입한 것을 사용하였다. Substance P는 증류수에 용해하였으며 그 농도는 각각 10μg/ml과 100μg/

ml이었고 substance P를 실크 지지체에 탑재하는 방법은 용액 내 침적법을 이용하였다. 간략히 설명하면 substance P가 용해된 각각의 용액에 실크 지지체를 담그고 24시간 정도 두게되면 용액 내의 substance P가 실크 지지체의 표면에 침적되게 된다.

2. 동물 실험

본 동물실험은 국립 강릉원주대학교 실험동물 윤리위원회의

심의와 승인을 받아서 진행되었다. 동물 실험은 크게 두 가지로

나누어 시행되었다(IACUC 2010-10). 첫번째 실험에서는 사용된

실크 지지체에 의한 골 형성 촉진 효과를 분석하기 위하여 대조군

으로 골 결손부를 자연 치유시킨 것이 사용되었고 같은 동물의

대칭측에 실크 지지체만을 이식한 군(Silk 군)을 사용하였다. 두번

째 실험에서는 substance P의 사용에 따른 부가적인 골 형성

Fig. 1. Micro-CT view. The specimen from 4 weeks after grafting were A, B, C, and D. The specimen from 8 weeks after grafting

촉진 효과를 분석하기 위하여 substance P 10μg/ml에 침적시킨 재료를 한쪽에 이식하고(Sub10군), 같은 동물의 대칭측에는 sub- stance P 100μg/ml에 침적시킨 재료를 한쪽에 이식하였다 (Sub100군). 실험에 사용된 골 결손부의 크기는 직경이 8 mm인 trephine bur를 사용하여 얻어졌으며 이는 기존에 출간된 논문을 참고하여 설정되었다[22]. 대조군에는 10마리가 배정되었고 3개 의 실험군에도 각각 10마리씩 배정되었다. 각 군에서 5마리는 4주에 희생하였고 나머지 5마리는 8주에 희생하였다.

실험 방법은 기존의 논문에 잘 기술되어 있다[23]. 간략하게 설명하면 가토를 약물을 이용하여 전신마취한 다음에 두피에 리도 카인을 이용하여 국소마취를 시행하였다. 두개골 정중부에 시상 면에 평행하게 절개한 다음에 직경 8 mm의 trephine bur를 이용하여 골 결손부를 형성하였다. 골 결손부의 형성 시에 골막을 제거되는 골에 붙여서 같이 제거하여 자가 치유가 지나치게 빨리 일어나는 것을 억제하였다. 이후 앞에서 설명한 것과 같이 사전에 준비된 이식재를 각각의 결손부에 이식한 다음에 3-0 black silk 를 이용하여 전층을 한번에 봉합하였다. 이후 술 후 1주일까지 창상 부분을 iodine 제재로 소독하였고 술 후 3일까지는 소염진통 제와 항생제를 근육주사하였다. 술 후 3일 이후에 실험동물에서 사료 섭취 저하나 이상 행동과 같은 통증 등과 같은 술 후 합병증에 서 기인한 것으로 해석될 수 있는 증상이 관찰되는 경우에는 추가적인 진통제를 투여를 고려하였다. 하지만 본 실험에서는 이와 같은 현상은 관찰되지 않았다.

　실험 동물은 각각 4주 및 8주에 희생되었고 희생 방법은 진정제 의 과다 투여법을 이용하여 고통을 최소화하는 방법으로 시행되었 다. 각각의 실험 동물에서 얻어진 시편은 포르말린에 고정한 채로 추후 분석을 위하여 보내어졌다.

3. 미세 전산화 단층 촬영 및 조직학적인 분석

　미세 전산화 단층 촬영은 기초과학 지원센터(청원, 대한민국) 에 의뢰되어 시행되었다. 각 조직은 Explored Locus SP μ-CT scanner (GE Medical systems, Ontario, Canada)를 이용하여 촬영되었다. 전산화 단층 촬영 장치 내부에 있는 판에 조직을 움직이지 않게 고정한 후에 수평과 수직으로 움직여서 위치를 조정하였다. 이후 표본은 0.05 mm의 두께로 촬영되었다. 촬영된 이미지는 Microview software (GE Medical systems, Ontario, Canada)를 이용하여 삼차원으로 재구성되었다. 수술 시 형성한 결손부가 지름 8.0 mm의 원형이므로 관심영역(ROI, region of interest)은 초기 결손부 크기와 형태에 맞게 고려되었다. 각각 시편에서 관심영역의 골밀도(BMD, bone mineral density) 및 attenuation coefficient (AC)가 소프트웨어를 통하여 분석되었다.

　전산화 단층 촬영을 거친 조직은 다시 탈회를 거쳐서 파라핀에

포매되었다. 조직절편은 골이식부위 및 정상부위가 모두 포함되

도록 제작되었고 박편의 두께는 6μm로 하였다. 신생골의 형성

정도를 분석하기 위하여 조직은 Masson's trichrome stain법

(MT 염색법)으로 염색하였다.

Table 1. The results of microscopic computerized tomogram 4 weeks postoperatively

Group Unfilled Silk only

P value

P value

BMD (g/cm³) 0.29±0.01 0.35±0.05 0.037 0.33±0.02 0.37±0.07 NS

AC 0.0139±0.0001 0.0150±0.0008 0.038 0.0146±0.0004 0.0152±0.0012 NS

BMD, bone mineral density; AC, attenuation coefficient; NS, not significant.

Table 2. The results of microscopic computerized tomogram 8 weeks postoperatively

Group Unfilled Silk only

P value

P value

BMD (g/cm³) 0.42±0.10 0.47±0.11 NS 0.33±0.04 0.41±0.02 0.004

AC 0.0161±0.0016 0.0169±0.0018 NS 0.0147±0.0007 0.0159±0.0003 0.004

BMD, bone mineral density; AC, attenuation coefficient; NS, not significant.

Fig. 2. Histological view at 4 weeks after grafting (A: unfilled control, B: silk only, C: silk＋substance P (10μg/ml), D: silk＋substance

　미세 전산화 촬영 결과에 대한 통계 분석은 같은 실험 동물에서 좌우 차이의 분석을 위하여 paired t-test를 사용하였다. 가토의 경우 개체의 차이에 따른 골 형성 능력의 차이가 크므로 서로 다른 동물에서 골 결손부의 수복 정도는 비교하지 않았다. 조직

시편에서 신생골의 형성 정도는 박편이 어느 부위에서 제작되었는

가에 따라서 차이가 크기 때문에 본 연구에서는 분석하지 않았고

다만 관찰된 시편에서 관찰되는 multinucleated giant cell의

수는 각 시기의 이물 반응 정도를 평가하기 위하여 측정하여

Fig. 3. Histological view at 8 weeks after grafting (A: unfilled control, B: silk only, C: silk＋substance P (10μg/ml), D: silk+substance

4개의 군에서 평균값을 independent t-test를 이용하여 상호비교 하였다. 모든 통계 분석에서 유의 수준은 P 값이 0.05 미만으로 나오는 경우에 한하여 그 차이가 유의한 것으로 판단하였다.

결 과

1. 미세 전산화 단층 촬영 결과

　이식 후 4주 및 8주에 촬영한 전산화 단층 사진은 Fig. 1에 정리되어 있다. 각각의 사진에서 BMD 및 AC를 측정하여 각 군 사이의 비교에 사용되었다. 이식 후 4주가 경과된 상태에서 얻어진 시편에서 측정한 결과는 Table 1에 요약 정리되어 있다.

BMD의 경우 대조군의 경우에는 0.29±0.01이었고 silk only군 에서는 0.35±0.05이었다. 두 군을 서로 비교한 결과 그 차이는 통계적으로 유의하였다( P =0.037). AC의 경우 대조군은 0.0139±

0.0001이었고 silk only군에서는 0.0150±0.0008이었다. 두 군

을 서로 비교한 결과 AC의 차이도 통계적으로 유의하였다 ( P =0.038). 이에 비하여 Sub10군과 Sub100군을 서로 비교한 경우 BMD와 AC에서 통계적으로 유의한 차이는 관찰되지 않았다 ( P ＞0.05).

　이식 후 8주가 경과된 상태에서 얻어진 시편에서 측정한 결과는 Table 2에 요약 정리되어 있다. BMD의 경우 Sub10군의 경우에 는 0.33±0.04이었고 Sub100군에서는 0.41±0.02이었다. 두 군을 서로 비교한 결과 그 차이는 통계적으로 유의하였다( P = 0.004). AC의 경우 Sub10군은 0.0147±0.0007이었고 Sub100 군에서는 0.0159±0.0003이었다. 두 군을 서로 비교한 결과 AC 의 차이도 통계적으로 유의하였다( P =0.004). 술 후 4주의 결과와 는 대조적으로 대조군과 silk only군을 서로 비교한 경우 BMD와 AC에서 통계적으로 유의한 차이는 관찰되지 않았다( P ＞0.05).

2. 조직학적 분석 결과

4주 및 8주에 얻어진 시편에서 촬영한 사진은 Fig. 2 및 3에

Fig. 4. Residual graft amount at 8 weeks postoperatively (*P

＜0.001). Compared to silk only group, the application of sub- stance P showed significantly higher graft degradation.

정리되었다. 실크를 이식한 모든 시편에서 실크의 분해와 관련된 것으로 보이는 다핵 거대 세포가 관찰된다. 실크는 MT 염색법 상에서 진한 붉은빛을 나타내는 것으로 보였고 실크에 포함된 substance P는 실크 내에 푸른색으로 관찰되었다. 잔존 이식편의 양을 측정하여 분석한 결과는 Fig. 4에 나와 있다. 실크만 사용한 군의 경우 8주에 잔존 이식재의 양이 52.1±15.8%이었고 sub- stance P를 10μg/ml 함유한 경우는 15.2±9.2%, substance P를 100μg/ml 함유한 경우는 9.0±3.3%이었다. 실크 단독 사용의 경우가 substance P를 10이나 100μg/ml 함유한 경우에 비하여 통계적으로 유의할 만큼 많은 양의 잔존 이식재를 보였다 ( P ＜0.001). 그러나 substance P를 10이나 100μg/ml 함유한 경우를 서로 비교하는 경우에는 통계적으로 유의할 만한 차이는 없었다( P ＞0.05).

고 찰

　본 실험에서 다공성 실크 피브로인 지지체와 substance P를 같이 사용하여 가토에서 골 재생 정도를 비교분석하여 보았다.

실크 피브로인 지지체만 단독으로 사용한 경우 자연 치유시킨 경우에 비하여 4주까지 골형성은 더 우수하였으나 8주에서는 그 차이가 통계적으로 유의하지 않았다(Table 1, 2). 이에 비하여 substance P를 혼합하여 사용한 경우에는 4주에서는 큰 차이가 없었으나 8주에는 더 높은 농도의 substance P를 사용한 경우가 낮은 농도의 substance P를 사용한 경우에 비하여 골 형성이 더 우수하였다. 다핵거대세포의 출현은 4주에서는 자연 치유시킨 군을 제외하고는 모두 높게 나왔으나 8주에서는 실크 피브로인 지지체만 사용한 경우에 비하여 substance P를 혼합하여 사용한 경우에 유의하게 낮게 나왔으며 잔존 실크 지지체의 양도 sub- stance P를 사용한 경우에 더 적게 나타났다(Fig. 4).

실크 피브로인을 이용한 골 이식재는 다양한 형태로 시도 되고

있다. 가장 많이 사용되는 방법은 수산화인회석을 실크 피브로인 지지체에 침적시키는 방법으로 몇몇 연구에서는 성공적인 골 재생 유도를 보고한바 있다[24]. 하지만 실크 피브로인 지지체는 생체 내에서 분해되는 데 많은 시간을 요한다. 신생골은 지지체가 분해 된 공간을 통하여 재생되는 데, 실험 동물의 경우 골 조직의 재생 능력이 사람에 비하여 우수한 경우가 많기 때문에 지지체가 장기 간에 거쳐 서서히 분해되어도 골 결손부가 골 조직으로 회복될 수 있으나 성장이 완료된 사람의 경우에는 6개월이 경과되면 골조 직으로의 자가 재생 능력은 거의 없게되어 결손부가 골 조직으로 회복되지 못하고 섬유성 조직으로 잔존하게 된다. 따라서 기존 연구 중에서 가토의 경우를 보면 3개월 이후, 예를 들면 6개월이나 1년후에 골조직으로 치유되었다는 것은 인체 내에 적용하기에는 곤란한 결과라 하겠다[25].

　이러한 이유에서 최근에는 실크 피브로인을 미리 산으로 가수 분해하여 그 분자량을 줄임으로서 분해 속도를 가속화시키려는 시도를 하게 되었다. 이 중에서 저분자량 실크 피브로인 분말과 혈장 제재를 복합하여 이식한 결과에서 치과 임플란트 주변의 골 결손부나 가토의 두개골 결손 모형에서 그 효과가 뛰어나다는 보고가 있었다[26]. 저분자량의 실크 피브로인 분말을 MG63 세포 에 직접 가하는 경우 세포에서 alkaline phosphatase와 교원 섬유의 합성이 증가된다는 보고가 있다[27]. 따라서 저분자량의 실크 피브로인 분말이 최소한 조골세포와 유사한 특징을 가지는 세포에서 세포 활성화와 골 기질에 해당하는 단백질의 합성을 증가시키는 데 기여할 수 있다는 생각은 가지게 한다. 하지만 저분자량의 실크 피브로인 분말의 경우 그 흡수가 지나치게 빨라 서 지지체로서의 역할은 거의 하지 못하게 되고 교원 섬유의 합성은 섬유화 조직에서도 일어나므로[26] 실크 피브로인에 대한 세포 반응이 반드시 골 형성에 이르게 한다는 확신을 할 수는 없다.

　본 연구에서 실크 지지체만 사용한 경우 4주에서는 자연 치유시 킨 대조군에 비하여 통계적으로 유의할 만큼 높은 수준의 골 재생을 보여주었다(Table 1). 이는 실크 지지체 자체가 세포 부착 을 촉진하는 효과가 있어서 많은 수의 세포들을 창상 부위에 고용함으로서 조직의 재생이 빨라진 것으로 보인다. 하지만 초기 염증 단계에서 치유기로 넘어가는 기간에는 염증 반응이 점점 약해지면서 조골세포 등이 고용되어야 하는데, 흡수되지 않고 남아 있는 실크 지지체가 그 분해 과정에서 여전히 많은 수의 다핵거대세포 및 이와 관련된 염증 세포를 필요로 하므로 이러한 반응들이 8주에서는 더 이상 자연 치유시킨 대조군에 비하여 높은 수준의 골 재생을 보이는 데에 실패하게끔 하는 원인으로 사료된 다.

　이에 비하여 substance P를 사용한 군에서는 4주에서는 두

군 사이에 큰 차이가 없었으나 8주에서는 100μg/ml의 sub-

stance P를 사용한 군이 10μg/ml의 substance P를 사용한

군에비하여 높은 수준의 골재생을 보여주고 있다(Table 2). 또 한가지 흥미로운 사실은 substance P를 사용하지 않고 실크 지지 체만 사용한 군에 비하여 4주에서는 더 많은 수의 다핵거대세포가 substance P를 사용한 군에서 관찰되지만 8주에서는 오히려 substance P를 사용한 군에서 더 적은 수의 다핵거대세포가 관찰 된다(Fig. 2, 3). 술 후 8주에서 잔존 실크 지지체의 양을 서로 비교하면 실크만 사용한 군에 비하여 substance P를 함께 사용한 군에서 훨씬 적은 양의 실크 지지체가 관찰된다(Fig. 4).

Substance P는 상처 부위에서 발현이 증가된다. 따라서 초기 염증 반응에서 손상된 조직의 제거나 이물질의 제거와 관련되는 혈액 내 세포들이 substance P의 영향 아래 다수 군집될 가능성이 높다. 실제 substance P는 골수 내 미분화 간엽세포에 대한 주화 성 작용물질로 보고된바 있다[28]. 따라서 실크 복합체에 포함된 substance P는 실크 지지체만 사용한 경우에 비하여 훨씬 많은 수의 대식세포를 실크 주위로 고용하여 실크 지지체의 빠른 분해 와 이에 따른 신생골의 재생을 도왔을 가능성이 제기된다. 이식 후 4주까지는 초기 염증 반응이 우수하기 때문에 두 군 사이에 골 재생에서 큰 차이가 없었으나 이식 후 8주에서는 강하고 빠른 염증 반응 후에 재생이 100μg/ml의 substance P를 사용한 군에 서 더 많이 나타나서 10μg/ml의 substance P에 비하여 더 많은 양의 골이 재생된 것으로 보인다. 많은 종류의 성장인자들이 농도에 비례하여 그 작용을 나타낸다는 것은 잘 알려진 사실이다 [29].

　하지만 본 연구 결과에서 보여준 골 재생 정도는 바로 임상화하 기에는 상당히 미약한 결과라 하겠다. 비록 substance P가 골수 내의 미분화 간엽세포를 상처 부위에 많이 고용한다고 하더라도 미분화 간엽세포가 꼭 조골세포로만 분화하라는 법은 없으며 미분 화 간엽세포가 조골세포로 분화하기 위하여는 충분한 양의 칼슘이 공급되어야 할 것이다. 그런데 본 연구에 사용된 지지체에는 칼슘 이 전혀 실려있지 않아서 이러한 부분이 한계점으로 사료된다.

이번 연구 결과를 토대로 향후에는 실크 피브로인-substance P 복합체에 적용 가능한 이상적인 칼슘 제재의 혼합 비율을 알아내 는 연구를 시행하여야 할 것이다.

결 론

　실크 피브로인은 값싼 소재이며 의료 소재로 개발되는 경우 농가 소득의 증대로 이루어질 수 있는 소재이므로 이와 관련된 연구가 보다 더 많이 이루어져야 한다. 본 연구에서 실크 피브로인 지지체에 substance P를 혼합하여 사용함으로써 실크 피브로인 지지체의 생체 내 분해 속도에 대한 조절 가능성을 살펴볼 수 있었고 추후 연구를 통하여 실크 피브로인 지지체를 이용한 골 이식재의 성공 가능성을 볼 수 있었다.

Acknowledgements

This study was supported by a grant from the Bio- Green21 Program (No. PJ007170201006) and the Rural Development Administration, Suwon, Republic of Korea.

References

1. Buser D, Dula K, Hess D, Hirt HP, Belser UC. Localized ridge augmentation with autografts and barrier membranes.

Periodontol 2000 1999;19:151-63.

2. Laurie SW, Kaban LB, Mulliken JB, Murray JE. Donor-site morbidity after harvesting rib and iliac bone. Plast Reconstr Surg 1984;73:933-8.

3. Sommers BN, Eisenstein SM. Donor site pain from the ilium. A complication of lumbar spine fusion. J Bone Joint Surg Br 1989;71:677-80.

4. Younger EM, Chapman MW. Morbidity at bone graft donor sites. J Orthop Trauma 1989;3:192-5.

5. Dumas JE, Davis T, Holt GE, et al. Synthesis, characteriza- tion, and remodeling of weight-bearing allograft bone/poly- urethane composites in the rabbit. Acta Biomater 2010;6:

2394-406.

6. Matthias S, Hermann S, Inga D, Sebastian S, Wolf M. Bio- materials as Scaffold for Bone Tissue Engineering. Eur J Trauma 2006;32:114-24.

7. Meinel L, Karageorgiou V, Fajardo R, et al. Bone tissue en- gineering using human mesenchymal stem cells: effects of scaffold material and medium flow. Ann Biomed Eng Ann Biomed Eng 2004;32:112-22.

8. Sonja EL, Treena LA. Biphasic calcium phosphate ceramics for bone regeneration and tissue engineering applications.

Materials 2010;3:815-26.

9. Kim KH, Jeong L, Park HN, et al. Biological efficacy of silk fibroin nanofiber membranes for guided bone regeneration.

J Biotechnol 2005;120:327-39.

10. Altman GH, Diaz F, Jakuba C, et al. Silk-based biomaterials.

Biomaterials 2003;24:401-16.

11. Sofia S, McCarthy MB, Gronowicz G, Kaplan DL. Functional- ized silk-based biomaterials for bone formation. J Biomed Mater Res 2001;54:139-48.

12. Kweon H, Yeo JH, Lee KG, et al. Semi-interpenetrating pol- ymer networks composed of silk fibroin and poly(ethylene glycol) for wound dressing. Biomed Mater 2008;3:034115.

13. Jones GL, Motta A, Marshall MJ, El Haj AJ, Cartmell SH.

Osteoblast: osteoclast co-cultures on silk fibroin, chitosan and PLLA films. Biomaterials 2009;30:5376-84.

14. Garcia-Fuentes M, Meinel AJ, Hilbe M, Meinel L, Merkle HP.

Silk fibroin/hyaluronan scaffolds for human mesenchymal stem cell culture in tissue engineering. Biomaterials 2009;30:

5068-76.

15. Porter JR, Ruckh TT, Popat KC. Bone tissue engineering: a review in bone biomimetics and drug delivery strategies.

Biotechnol Prog 2009;25:1539-60.

16. Carletti E, Endogan T, Hasirci N, et al. Microfabrication of

PDLLA scaffolds. J Tissue Eng Regen Med 2011;5:569-77.

17. Cho KJ, Trzaska KA, Greco SJ, et al. Neurons derived from human mesenchymal stem cells show synaptic transmission and can be induced to produce the neurotransmitter sub- stance P by interleukin-1 alpha. Stem Cells 2005;23:383-91.

18. Hong HS, Lee J, Lee E, et al. A new role of substance P as an injury-inducible messenger for mobilization of CD29(+) stromal-like cells. Nat Med 2009;15:425-35.

19. Keskar V, Marion NW, Mao JJ, Gemeinhart RA. In vitro evaluation of macroporous hydrogels to facilitate stem cell infiltration, growth, and mineralization. Tissue Eng Part A 2009;15:1695-707.

20. Rameshwar P, Zhu G, Donnelly RJ, et al. The dynamics of bone marrow stromal cells in the proliferation of multipotent hematopoietic progenitors by substance P: an understanding of the effects of a neurotransmitter on the differentiating hematopoietic stem cell. J Neuroimmunol 2001;121:22-31.

21. Tran MT, Lausch RN, Oakes JE. Substance P differentially stimulates IL-8 synthesis in human corneal epithelial cells.

Invest Ophthalmol Vis Sci 2000;41:3871-7.

22. Sohn JY, Park JC, Um YJ, et al. Spontaneous healing ca- pacity of rabbit cranial defects of various sizes. J Periodontal Implant Sci 2010;40:180-7.

23. Lee EH, Kim JY, Kweon HY, et al. A combination graft of low molecular weight silk fibroin with Choukroun plate-

let-rich fibrin for rabbit calvarial defect. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 2010;109:e33-8.

24. Bhumiratana S, Grayson WL, Castaneda A, et al. Nucleation and growth of mineralized bone matrix on silk-hydrox- yapatite composite scaffolds. Biomaterials 2011;32:2812-20.

25. Cao Y, Wang B. Biodegradation of silk biomaterials. Int J Mol Sci 2009;10:1514-24.

26. Jang ES, Park JW, Kweon H, et al. Restoration of peri-im- plant defects in immediate implant installations by Chou- kroun platelet-rich fibrin and silk fibroin powder combina- tion graft. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 2010;109:831-6.

27. Kim JY, Choi JY, Jeong JH, et al. Low molecular weight Silk Fibroin increases alkaline phosphatase and Type I collagen expression in MG63 Cells. BMB Rep 2010;43:52-6.

28. Hong HS, Lee J, Lee E, et al. A new role of substance P as an injury-inducible messenger for mobilization of CD29(+) stromal-like cells. Nat Med 2009;15:425-35.

29. Cury PR, Canavez F, de Araújo VC, Furuse C, de Araújo NS.

Substance P regulates the expression of matrix metallopro- teinases and tissue inhibitors of metalloproteinase in cul- tured human gingival fibroblasts. J Periodontal Res 2008;43:

255-60.