Original Article
원고 접수일 2012년 7월 16일, 원고 수정일 2012년 8월 4일, 게재 확정일 2012년 8월 27일
책임저자 이상운
(210-702) 강릉시 죽헌길 7, 강릉원주대학교 치과대학 구강악안면외과학교실 Tel: 033-640-3139, Fax: 033-640-3113, E-mail: [email protected]
RECEIVED July 16, 2012, REVISED August 4, 2012, ACCEPTED August 27, 2012
Correspondence to Sang-Woon Lee
Department of Oral and Maxillofacial Surgery, College of Dentistry, Gangneung-Wonju National University
7, Jukheon-gil, Gangneung 210-702, Korea
Tel: 82-33-640-3139, Fax: 82-33-640-3113, E-mail: [email protected]
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가토 두개골 결손부 모델에서 테트라사이클린 함유 실크 파이브로인 차폐막의 골유도 재생 효과
이상운ㆍ박용태ㆍ김성곤ㆍ권해용1ㆍ조유영1ㆍ이희삼1
강릉원주대학교 치과대학 구강악안면외과학교실, 1농촌진흥청
Abstract
The Effects of Tetracycline-loaded Silk Fibroin Membrane on Guided Bone Regeneration in a Rabbit Calvarial Defect Model
Sang-Woon Lee, Yong-Tae Park, Seong-Gon Kim, HaeYong Kweon 1 , You-Young Jo 1 , Heui Sam Lee 1 Department of Oral and Maxillofacial Surgery, College of Dentistry, Gangneung-Wonju National University,
1
Sericultural & Apicultural Materials Division, National Academy of Agricultural Science
Purpose: The aim of this study was to evaluate the bone regeneration ability of 1% tetracycline (TC)-loaded silk fibroin membrane (SFM), in a rabbit calvarial defect model.
Methods: Twenty New Zealand white rabbits were used for this study. Bilateral round defects were made on the rabbit parietal bone, using trephine bur with an 8 mm diameter. TC-loaded SFM or SFM was covered on the right parietal bone defect, and the left parietal bone defects were uncovered for the control. The animals were humanely sacrificed at 4 or 8 weeks postoperatively. A micro-computerized tomography (μ-CT) of each specimen was taken for analysis of bone regeneration. Hematoxylin and Eosin stain were done to observe histological findings.
Results: From the μ-CT results, regenerated bone volume (mm3) of 1% TC-loaded SFM, SFM, and control were 7.80±5.87, 8.79±3.44, and 10.61±5.3 at 4 weeks postoperatively, respectively (
P
＞0.05). Regenerated bone volume (mm3) of 1% TC-loaded SFM, SFM, and control were 36.56±8.50, 25.86±8.17, and 19.09±5.07 at 8 weeks postoperatively, respectively (P
＜0.05).Conclusion: The 1% TC-loaded SFM showed more bone regeneration than the SFM and the uncovered control, in guided bone regeneration.
Key words: Tetracycline, Silk fibroin, Guided bone regeneration
서 론
낭종(cyst), 종양 등으로 인하여 악골 부위에 골결손부가 발생 하거나, 임플란트 식립 시 치조골이 부족한 경우에 골의 재생 혹은 증강을 위하여 골유도재생술을 시행하게 된다. 골유도재생 술은 차폐막(membrane)을 이용하여 골결손부의 치유를 유도하 는 치료법으로 골형성이 필요한 임상 증례에서 널리 적용이 되고 있다[1,2]. 일반적으로 골결손부의 치유는 골세포에 의한 골재생 보다는, 연조직 세포에 의한 치유가 더 빠르게 진행이 된다. 따라 서, 차폐막이 골유도재생술에서 가지는 역할 중 하나는 상피 혹은 결합조직 세포가 골결손부로 이동하지 못하도록 기계적으로 차단 해 줌으로써 골이 재생될 때까지 그 공간을 유지해주는 것이다[3].
성공적인 골조직의 재생을 위하여 여러 가지 종류의 차폐막이 시판되고 임상에서 활용되고 있으며, 성공적인 결과들을 보이고 있다[2]. 대부분의 흡수성 차폐막들은 돼지나 소의 콜라겐 (collagen)을 이용하여 만들어지고 있는데[4], 전반적으로 높은 비용은 차폐막을 임상에서 적극적으로 활용하는 데 어려움을 주는 부분이다. 따라서 비용이 비교적 저렴한 재료를 활용하여, 기존 제품과 비슷하거나 더 좋은 효과를 나타내는 차폐막을 개발하는 것은 임상가나 환자에게 많은 도움을 줄 수 있을 것이다. 본 연구에 서는 비용이 저렴하면서도 농가소득에 많은 기여를 할 수 있는 누에에서 생산된 실크 단백질을 이용하여 차폐막을 제작하였다.
또한 감염 방지 등의 보조적인 효과를 얻기 위해서 1%의 테트라사 이클린(tetracycline, TC)을 제조과정에서 첨가를 하였다.
누에(silkworm)는 자기 몸을 감싸기 위해 실을 토해 누에고치 (cocoon)를 만든다. 이 누에고치에서 실을 뽑아낸 후, 가공과정 을 거치게 되면 실크가 만들어지게 된다. 실크는 세리신(sericin) 과 피브로인(fibroin) 단백질로 구성이 되는데, 일반적으로는 정 련(degumming) 과정을 통해 점착성(gummy)의 세리신을 제거 한 후 피브로인 만을 이용하게 된다[5]. 실크 피브로인은 생체조직 을 구성하는 세포에 대한 부착 증식률이 우수하고[6], 산소 및 증류수 투과도가 높으며[7,8], 비교적 약한 면역반응을 나타내는 특징이 있어서, 창상치료용 재료, 인공고막 소재 등과 같은 의료소 재 분야에서 많은 연구와 개발이 이루어지고 있다[9,10].
실크 피브로인 소재 차폐막(silk fibroin membrane, SFM)이 구강 내에서 사용될 경우는 높은 세포 부착력으로 인하여[11]
구강 내에 서식하는 박테리아에 의한 감염 우려가 높다. 따라서 SFM이 구강 내에서 성공적으로 사용되기 위하여는 SFM 단독 제재에 비하여 균의 증식을 억제할 수 있는 첨가물을 부가하는 것이 이식재에 대한 감염 방지에 도움을 줄 것으로 생각한다.
테트라사이클린은 여러 감염의 치료에 사용이 되는 항생제이며, 광범위한 범위의 세균에서 그 효과를 나타낸다. 이 약제는 뼈와 치아의 주성분인 수산화인회석(hydroxyapatite)과 상호작용하 여 변색을 야기하는 특징이 있어서, 그 사용에 제한이 있지만,
국소 혹은 전신적 투여를 통해서 현재까지도 임상에서 유용하게 활용되고 있는 약제이다[12,13].
SFM에 테트라사이클린을 첨가하는 경우 널리 알려진 테트라 사이클린의 항균력으로 인하여 감염은 억제될 수 있으나, 테트라 사이클린의 첨가가 뼈의 재생을 억제한다면 테트라사이클린 첨가 SFM은 임상적으로 사용될 수 없을 것이다. 따라서 본 연구의 목적은 테트라사이클린을 함유한 실크 피브로인 소재 차폐막(TC 함유 SFM)을 인위적으로 형성한 가토 두개골 결손부에 적용한 후 micro-computerized tomography (μ-CT) 및 조직학적 분 석을 통하여 TC 함유 SFM이 SFM과 비교하여 신생골의 형성을 억제하는지 여부를 평가하는 것이다.
연구방법
1. 실험 동물 및 재료
생후 10∼11주의 뉴질랜드산 백색 가토(체중 2.0∼2.5 kg) 20마리를 실온에서 고형 사료와 물을 공급하며 일정기간 사육한 뒤 사용하였다. 본 연구는 강릉원주대학교 연구윤리위원회의 승 인을 얻은 후, 위원회의 감독을 받으며 수행하였다(승인번호 2011-14). 실험재료인 1% TC 함유 SFM과 TC를 함유하지 않은 SFM은 농촌진흥청(Suwon, Korea)에서 제공받은 것을 사용하 였다.
2. 동물 실험
술 전에 전신마취를 유도하기 위해 가토 대퇴부 근육에 0.5 mL Tiletamine and Zolazepam (125 mg/mL; Zoletil, Bayer Korea, Seoul, Korea)과 0.5 mL xylazine (10 mg/kg body weight; Rompun, Bayer Korea)을 주사한다. 코 부위부터 수술 부위인 두정골(parietal bone) 상부까지 제모를 시행 후 povi- done-iodine 용액으로 소독한 다음 지혈 및 국소마취 목적으로 1:100,000 에피네프린이 함유된 2% lidocaine을 주사하였다.
두피의 정중부에 시상방향으로 절개를 시행한 후 골막하 박리를 시행하여 피부 및 골막을 거상해 두정골을 노출시켰다. 토끼 두개 골 정중 봉합부에 대칭이 되도록 두정골상에 trephine bur를 이용하여 좌, 우측에 각각 직경 8 mm, 깊이 2 mm의 골결손부를 형성하였다[14]. 실험군인 우측 골결손부에는 TC 함유 SFM 혹은 SFM을 적용하였고, 대조군인 좌측 골결손부에는 특별한 처치를 시행하지 않았다. 골막과 근육 및 피부를 3-0 black silk로 봉합하 였다. 술 후 감염 방지를 위해 gentamycin 1 mg/kg (Kookje, Seoul, Korea)을 1일 3회 3일간 근육주사하였다.
수술 4주 후, 10마리의 토끼를 희생시킨 후, bur를 이용해 실험
군과 대조군을 포함한 두개골 부위 표본을 채취하였다. 표본은
10% 중성 formalin 용액에 담가 보관하였다. 수술 8주 후 나머지
Fig. 1. Bone volume. There was no significant difference among
groups at 4 weeks postoperatively. However, there was statisti- cally significant difference among groups at 8 weeks post- operatively (P=0.009). In the post hoc test, silk membrane plus tetracycline (TC) group showed significantly higher bone volume that that of silk membrane only group (*P=0.041) and that of unfilled control group (**P=0.003).10마리의 토끼에 대하여 4주 후와 같은 과정을 시행하였다.
3. 방사선학적 분석(μ-CT analysis)
수술 후 4주 및 8주에 가토를 희생시킨 후, 채취한 표본을 μ-CT 장비인 Explore Locus SP scanner (GE Medical System, Ontario, Canada)를 이용하여 촬영하였다. CT scanner 내부의 turntable에 표본을 고정한 후 수평 및 수직 위치를 조정하 고 0.05 mm 두께 절편으로 단층촬영을 시행하였다. 촬영된 이미 지는 MicroView software (GE Medical Systems)를 사용해 삼차원적으로 재구성되었다. 골결손부가 지름 8 mm, 깊이 약 2 mm의 원통형이므로 관심영역(region of interest)은 결손부의 크기와 형태에 맞게 100.4 mm
3(4×4×3.14×2)로 설정이 되었 다. 각 표본에서 관심영역 내의 신생골 부피(bone volume)를 컴퓨터 소프트웨어를 이용해 조사하였다.
4. 조직학적 검사
술 후 4주와 8주에 얻은 조직표본을 10% 중성 포르말린에 고정한 후, 5% nitric acid를 이용하여 2주간 탈회를 시행하였다.
다음으로 ethyl alcohol 및 xylene을 이용하여 탈수 및 투명과정 을 시행한 후, 파라핀을 이용하여 시편을 포매하였다. 제작된 파라핀 블록을 4 μm 두께로 세절한 후 Hematoxylin and Eosin 염색을 시행하였다. 광학현미경을 이용하여 조직학적 소견을 관 찰하였고, 디지털 현미경 카메라를 이용하여 현미경상의 이미지 를 촬영하였다.
5. 통계 분석
μ-CT분석 결과에서 신생골 부피(bone volume)에 대하여 통계 분석을 시행하였다. SPSS for window ver. 19 (IBM Co., Armonk, NY, USA)를 이용하여 ANOVA를 시행하였다. Post hoc test로는 LSD를 사용하였다. P ＜0.05를 통계적으로 유의한 수준으로 설정하였다.
결 과
1. 방사선학적 분석결과
μ-CT를 이용해 실험군과 대조군의 신생골 부피(bone vol- ume)를 비교하였다(Fig. 1, 2). 수술 4주 후 신생골 부피는 TC+SFM군에서 7.80±5.87 mm
3, SFM군에서는 8.79±3.44 mm
3, 차폐막을 적용하지 않은 대조군에서 8.27±4.99 mm
3로 측정되었다. 세 그룹 간에 통계적인 유의성은 없었다( P ＞0.05).
수술 8주 후 신생골 부피는 TC＋SFM군에서 36.56±8.50 mm
3, SFM군에서는 25.86±8.17 mm
3, 차폐막을 적용하지 않은 대조 군에서 19.09±5.07 mm
3로 측정되었다. 세 그룹 사이의 차이를
통계적으로 검정하였을 때, 그룹 간의 차이가 통계적으로 유의하 였다( P =0.009). Post hoc test 결과 TC+SFM군과 SFM군 사이의 차이도 유의하였고( P =0.041), TC+SFM군과 차폐막을 적용하지 않은 대조군 사이의 차이도 유의하였다( P =0.003).
2. 조직학적 소견
술 후 8주 조직 소견에서 TC 함유 SFM을 적용한 군은 대조군보 다 좀 더 많은 골형성을 보였던 반면, 차폐막이 적용되지 않은 대조군에서는 결체 조직, 근육 등이 골결손부에 위치해 있는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 3). SFM을 적용한 군에서도 대조군에 비하여 우수한 골형성을 보여주었지만 TC 함유 SFM을 적용한 군에 비하여 형성된 골의 양은 다소 적은 것으로 보였다. 술 후 4주와 8주의 조직 소견에서 실험군과 대조군 모두에서 뚜렷한 염증 소견은 관찰되지 않았다(Fig. 3).
고 찰
이상적인 차폐막은 골재생 기간 동안 골형성을 위한 공간을
유지할 수 있어야 하며, 주변 연조직 세포가 골결손부로 이동하여
들어오는 것을 차단할 수 있어야 한다[3]. 본 연구에서 μ-CT
8주차 결과를 살펴보면, TC 함유 SFM을 적용한 실험군에서 SFM
적용군이나 아무것도 적용하지 않은 대조군에 비하여 유의하게
많은 신생골 형성을 보여주었다(Fig. 1, 2). 이 결과는 실험군에
적용한 TC 함유 SFM이 골재생 기간 동안 공간유지 및 연조직
침투 방지 기능을 적절히 수행하였다고 해석할 수 있다. 또한
테트라사이클린의 첨가에 의하여 신생골의 형성이 억제되지 않는
Fig. 2. Micro-computerized tomography.
(A) The unfilled control at 4 weeks postoperatively. (B) Silk membrane only at 4 weeks postoperatively. (C) Silk membrane plus tetracycline at 4 weeks postoperatively. (D) The unfilled control at 8 weeks postoperatively. (E) Silk membrane only at 8 weeks postoperatively. (F) Silk membrane plus tetracycline at 8 weeks postoperatively.
다는 것을 보여주었다. 대조군에서는 차폐막을 적용하지 않았기 때문에 골막이 직접 골결손부를 덮게 되는데, 골형성 잠재력이 있는 많은 세포들이 골막에 존재하며, 골막을 통한 혈액 공급이 추가된다는 점에서 대조군이 골형성에 유리한 조건을 가지고 있다 고 생각이 되지만[15], 골막이나 골막 주변에 존재하는 연조직 세포가 골결손부로 이동해 들어오는 것은 막지 못하기 때문에 SFM군이나 TC＋SFM군보다 더 적은 골형성을 보인 것으로 생각 이 된다. 이러한 결과는 조직 소견에서도 확인할 수 있는데, SFM 군이나 TC+SFM군에 비하여 대조군에서 더 많은 연조직 세포들 이 골결손부 쪽으로 증식해 들어와 있는 것을 관찰할 수 있었다 (Fig. 3).
이상적인 차폐막은 골재생을 위한 공간 유지 기능을 한 후 적절한 시기에 특별한 염증 반응 없이 흡수가 되어야 한다[16].
TC 함유 SFM이 생체 내에서 언제 흡수되는지에 대해서는 추가적 인 연구가 필요하나, TC 함유 SFM과 SFM의 4주와 8주의 조직 소견에서 눈에 띄는 염증 반응이 보이지 않는 것은 고무적인 결과이다.
SFM을 차폐막으로 적용하였을 때 골재생에 긍정적인 영향을 미치는 것은 이전 동물실험에서 이미 확인된 바 있다[17]. 본 연구에서 SFM에 TC를 첨가한 이유 중 하나는 감염에 대한 저항성 을 높이기 위해서이다. 골유도재생술 시행 후 차폐막이 구강 내로 노출되면서 세균에 의한 감염으로 충분한 골재생을 얻지 못하는 것은 임상에서 흔히 접하는 문제이다[18,19]. TC는 광범위 항생제 로써 세균의 단백질 합성을 저해하여 그 효과를 나타낸다[13].
연조직이 치유가 되어 안정적으로 구강 내 세균을 차단하는 기능
을 할 수 있을 때까지 TC가 SFM에서 방출이 되어, 세균의 성장과 증식을 억제할 수 있다면 감염의 예방에 많은 도움을 줄 것이다.
TC의 국소적인 적용은 peri-implatitis 치료의 예[20]에서처럼 임상에서 많이 활용이 되고 있는 부분이다.
그 외에 TC는 기질을 분해하는 효소인 matrix metal- loproteinases의 작용을 억제하며, 생체 내에서 항염증 효과를 보이는 것으로 알려져 있다[21,22]. Yaffe 등[23]은 rat에서 비스 포스포네이트 계열의 약과 TC를 동시에 국소적으로 적용하였을 때 상승적으로 치조골 흡수를 억제하는 효과가 있음을 보고하였 고, Payne와 Golub[24]은 최근의 논문에서 골다공증과 같은 전 신 질환이나 치주염과 같은 국소 질환의 치료에 있어서 TC 계열의 약제가 골흡수를 조절하는 데 좋은 약제가 될 수 있음을 제시하고 있다. 따라서 TC를 SFM에 함유하여 골결손부에 적용한다면, SFM이 물리적으로 상피 및 결체조직 세포의 유입을 차단하는 것 이외에, TC에 의한 골밀도 증가 효과가 추가적으로 발생할 것으로 생각한다. 그러나, TC 함유 SFM의 TC가 생체 내에서 어느 기간 동안, 어떠한 속도로 방출되는지에 대해서는 추가적인 연구가 필요하며, 충분한 골재생이 일어날 때까지 지속적으로 방출이 되도록 차폐막을 제작하는 것이 필요하다.
본 연구에 사용된 TC 함유 SFM은 실크 피브로인 단백질을
중성염(neutral salt)에 녹여서, 용액을 만든 후, 실크 피브로인에
대한 1% 무게 비율로 TC를 첨가하여 일정한 형태의 틀을 이용하여
침전(precipitation) 과정을 통하여 제작을 하였다. 만들어진 TC
함유 SFM은 유연성이 적어 잘 부서지는 특성을 가지고 있기 때문
에 조작성이 떨어진다. 혈액이나 수분에 의해 어느 정도는 향상이
Fig. 3. Histological view (original magnification ×100, H&E stain). (A) The unfilled control at 4 weeks postoperatively. (B) Silk membrane
only at 4 weeks postoperatively. (C) Silk membrane plus tetracycline at 4 weeks postoperatively. (D) The unfilled control at 8 weeks postoperatively. (E) Silk membrane only at 8 weeks postoperatively. (F) Silk membrane plus tetracycline at 8 weeks postoperatively.될 수 있으나 좋지 않은 조작성은 임상에 적용하기 위해서 반드시 개선이 필요한 부분이다. 수분에 의해 부드러워지면서도 적절한 강도를 가질 수 있는 물성을 가진 TC 함유 SFM을 만들기 위해 추가적인 물질을 첨가하거나, 제조공정의 변화가 필요할 것이다.
결 론
TC 함유 SFM을 적용한 골결손부에서는 SFM을 적용한 골결손
부나 아무것도 적용하지 않은 골결손부에 비해 유의하게 높은
신생골 형성을 보여주었다. TC 함유 SFM의 물성 및 조작성이 좀 더 개선이 된다면, SFM은 비용이 저렴하면서도, 임상적으로 적용 가능한 차단막으로 활용이 될 수 있을 것이다.
Acknowledgements
이 논문은 농촌진흥청 차세대 바이오그린21사업 농생명바이오 식의약소재개발사업단의 지원에 의해 이루어진 것임(과제번호:
PJ009013).
References
