제 6장 음이온 교환 멤브레인 크로마토그래피
6.1 개요
이온교환 멤브레인 크로마토그래피는 거의 모든 가용성 단백질에 적용할 수 있는 일반적인 정제 방법이다. 단백질은 중성의 수용액 중에서, 아미노기가
로 카르 복실기(carboxyl)가
로 해리되어 있다. 이와 같은 양(+)과 음(-) 전하를 가진 물질을 양쪽성 전해질이라 부르며 그 순전하(net charge)는 pH에 의존하고 있다. 순 전하가 제로(0)가 되는 pH를 등전점(isoelectric point; pI)이라고 부른다. [그림 6.1]에 나타낸 것처럼 단백질의 순전하는 등전점보다 높은 pH에서 음이 되고 등전점보다 낮은 pH에서는 양이 된다.
[그림 6.1] pH에 의한 단백질의 순전하의 변화와 이온 교환체의 흡착
한편, 이온교환 멤브레인 크로마토그래피에서는 양의 전하를 띤 음이온 교환체와 음 의 전하를 띤 양이온 교환체가 있다. 이러한 이온교환체는 해리기에 따라 강 음이온 교환체, 약 음이온 교환체, 강 양이온 교환체, 약 양이온 교환체 등 4가지로 대별되는 데 몇몇 해리기와 구조에 대해 [표 6.1]에 나타내었고 형태별 이온화 커브를 [그림 6.2] 나타내었다. 음의 순전하를 가진 단백질은 양의 전하를 가진 음이온 교환체에, 양의 순전하를 가진 단백질은 음의 전하를 가진 양이온 교환체에 결합할 수 있다. 결
합한 단백질의 용출에는 용출 buffer의 이온 강도(염농도)를 증가시키는 방법이 일반 적으로 이용되고 있다. 이온 강도(염농도)의 증가는 이온 교환체에 결합하는 반대이온 (counter ion)을 증가시킨다. 반대이온이 단백질 대신에 이온교환체에 결합하고 결합 이 약한 단백질로부터 순차적으로 유리되고 용출된다. 이러한 과정을 [그림 6.3]에 나 타내었다. 이와 같이 이온교환 멤브레인 크로마토그래피는 단백질이 갖는 순전하와 해리기와의 정전기적 결합(이온결합)을 이용하여 실행하는 크로마토그래피이다.
[표 6.1] 이온교환체의 종류
이온교환체 해리기 구조
강음이온교환체
Q(quaternary ammonium) QAE(quanternary
aminoethyl)
CHNCH
OCHCHNH CHCHCHCH OH CH
약음이온교환체 DEAE(diethylaminoethyl) ANX(diethylaminopropyl)
OCHCHNH CHCH
OCHCH OH CHNH CHCH
강양이온교환체 S(methyl sulphonate) SP(sulphopropyl)
CHSO
CHCHCHSO 약양이온교환체 CM(carboxymethyl) OCHCOO
[그림 6.2] 이온교환체 종류별 이온화 커브1)
1) R. K. Scopes, Protein Purification, 3nd ed., Springer-Verlag (1994), N.Y.
[그림 6.3] 음이온 교환 크로마토그래피의 모식도
6.2. 담체의 선택
이온교환체는 합성 폴리머, 아가로스, 덱스트란, 셀룰로오스 등의 입자에 여러 종류 의 이온 교환기를 결합시킨 것이다. 강이온 교환체는 넓은 pH 범위로 해리하고 있지 만, 약이온 교환체는 pH에 의존하여 전하가 변화하고 단백질의 결합능도 변화한다.
이온교환체에 너무 강한 결합은 회수율을 저하시킨다. 고분자계의 겔에는 분리능이 우수한 것이 많지만 경질 겔이 고분자계의 겔보다 비특이적 흡착이 적다. 겔의 입자 직경이 작을수록 분리능은 높게 되지만, 대량정제는 되지 않는다. [그림 6.4]는 과거 Amersham Bioscience사2)의 이온교환 크로마토그래피용 겔의 분리능, 사용하는 정 제의 단계, 경제성, 정제 스케일을 나타낸다. Mono Q/S, Source Q/S, Q/SP Sepharose HPⓇ는 컬럼에 충전되어 있고 HPLC용으로서 사용 가능한 상태로 되어 있다. 그 외 경질의 겔은 개방된 컬럼에 충전하고, 특히 대량정제의 초기 단계 등에 사용한다. 이러한 목적을 위하여서는 Sepharose 이온 교환체 또는 Sepharose FF 이온 교환체가 일반적으로 선택되어진다. 이러한 경우에는 다음의 단계에서도 한번 더 이온교환 HPLC를 행하는 것이 가능하다. 소량의 정제에서는 최초로부터 이온교환 FPLC나 HPLC를 행한다.
2) GE Healthcare에서 Cytiva로 변경 후 2021년 Danaher에 인수됨
[그림 6.4] 이온교환 크로마토그래피에 있어서 겔의 선택
6.3. 완충액(buffer)
이온교환 크로마토그래피에 잘 사용되어지는 버퍼를 [표 6.2]에 나타내었다.
[표 6.2] 이온 크로마토그래피에 사용되는 완충액3)
이와 같은 버퍼에 필요에 따라 안정화제 등을 첨가한 것을 기초 버퍼로서 컬럼의 평 형화 등에 사용한다. 대부분의 경우, 특정의 pH와 저 이온 강도를 갖는 버퍼로 목적
3) D.M.Bollag, M.D.Rozycki, S.J.Edelstein, Protein Method 2nd ed., Wiley-Liss, 1996. N.Y., pp.
231-269.
pKa pH 범위 완충액
3.8 4.8 6.2 6.6 7.2
3.4-4.2 4.4-5.2 5.8-6.6 6.2-7.0 6.8-7.6
양이온 교환 Lactic acid Acetic acid
MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid) ADA (N-2-Acetamidoiminodiacetic acid) MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid)
6.0 7.8 8.1 8.8 9.5
5.6-6.4 7.4-8.2 7.7-8.5 8.4-9.2 9.1-9.9
음이온교환 Histidine
Triethanolamine Tris
Diethanolamine Ethanolamine
단백질을 흡착시키고 난 후에 이온 강도를 서서히 높여 용출시킨다. 단백질은 pH가 중성보다 높을수록 음이온 교환체에 흡착하기 쉽고, 그리고 낮을수록 양이온 교환체 에 흡착하기 쉽다. 목적 단백질을 음이온 교환체에 흡착시키기 위해서는 그 단백질의 등전점(pI) 보다 0.5 이상 높은 pH(통상 pH 7~9)를, 양이온 교환에는 pI보다 0.5이상 낮은 pH(통상 pH 5~7)을 선택한다. 버퍼의 pH를 결정하기 위하여서는 목적 단백질 의 안정성도 고려해야 한다. 버퍼는 통상 10~50mM의 농도로 사용되어지지만, 흡착 력이 강한 단백질에서는 다시 NaCl 등의 염이 첨가되어진다. 대부분의 단백질은 pH 5.5~7.5의 범위에 등전점을 가진다. 따라서 목적 단백질의 등전점이 알지 못할 경우 에는 DEAE 등의 음이온 교환체와 20mM 정도의 Tris 버퍼(pH 7.5~8.0)를 이용하여 행하여 본다. 목적 단백질을 흡착시키지 않고, 잡다한 다른 단백질의 대부분을 흡착시 키는 것도 효과적인 분리방법 중의 하나이다. 이러한 경우에는 얻어진 비흡착 분획을 역의 음이온 교환체 컬럼으로 분리하면 정제도가 또다시 상승한다.
6.4. 시료액
연질 담체의 경우, 적어도 베드 체적 2배의 버퍼를 흘려보내 컬럼을 평형화한다.
세료액은 처음부터 투석, 겔여과, 희석 등에 의해서 컬럼의 평형화 버퍼의 pH 와 이 온강도와 맞춘다. 시료가 조추출액의 경우는 원심분리(10,000 x g, 30분 이상, 가능 하면 100,000 x g, 1시간 정도)로 불용물을 제거한다. HPLC의 경우는 필터를 통과시 킨다. 겔의 흡착용량은 겔의 종류, 단백질의 등전점, 버퍼의 pH에 의하여 다르게 나 타난다. 예를 들면 DEAE-Sepharose 컬럼은 사람 혈청 알부민을 최대 170 mg/mL gel, Mono Q 컬럼은 최대 65mg/mL gel 정도 결합하는 것이 가능하다. 실제의 크 로마토그래피에서는 최대 흡착량의 1/10~1/5 시료를 첨가하면 좋다. 시료액의 최적 은 문제되지 않는다.
6.5. 유속
유속은 단백질의 분리에 영향을 주는 중요한 인자이다. 최대유속은 컬럼의 단면적 에 비례하기 때문에 선유속(cm/hr) 으로 표시한다. 연질 겔에서는 60cm/hr 이하, 통상 10cm/hr 전후로 행하고 HPLC 용의 연질 겔 으로는 150~600 cm/hr 정도로 행한다. 과도의 유속은 분리능을 저하시키기도 하고 압력 상승에 따른 문제를 야기한
다.
6.6. 용출, 컬럼의 보존
이온 교환체에 결합한 단백질은 버퍼 중의 염농도를 연속적으로 상승시키는 방법 (gradient 법)이나 단계적으로 상승시키는 방법(stepwise 법)으로 용출시킨다. 효과적 으로 분리하기 위하여서는 NaCl 농도를 0~0.5M 정도의 범위로 직선적인 용출이 주 로 이용되고 있다. [그림6.5]는 이온교환 HPLC의 gradient 용출 예를 나타낸 것이다.
한번 사용한 컬럼은 1M 정도의 NaCl로 씻어준 후 개시 버퍼로 평형화하면 재사용이 가능하다. 만일, 다른 시료를 첨가하기도하고, 불가역적으로 흡착한 단백질이나 지질 을 제거하기 위하여서는 0.1M NaOH로 씻어주는 편이 좋다. 사용한 컬럼은 설명서에 따라 보존한다. 많은 담체는 20% 에탄올, 0.05%(w/v) chlorine (trichloro butanol) 의 약산성 용액으로 평형화하고 냉장고에서 보관 가능하다.
[그림 6.5] 이온교환 HPLC에 있어서 NaCl 농도 구배의 예
6.7. 음이온 멤브레인 크로마토그래피
흐름을 통한 음이온 교환(AEX) 크로마토그래피는 검증된 바이러스 제거 전략의 일 부로 순 음(net negative charge) 으로 하전된 숙주 세포 단백질(HCP) 및 바이러스 감소를 위한 생물약제 정제 공정에 주로 사용된다. AEX 컬럼 크로마토그래피는 특히 상업적 규모의 바이오의약품 제조에서 정전기 바이러스 제거에 가장 많이 사용되는
기술이다. 바이오제약 공정에서 AEX 컬럼에 의한 HCP 및 바이러스 제거 검증에는 운영 및 규제 비용에 크게 기여하는 복잡성이 수반된다. 바이오 의약품을 제조하는 기업은 컬럼 패킹의 결함으로 인해 발생할 수 있는 컬럼의 미세 채널링 문제에 신중 하게 접근해야 한다. 이러한 문제는 분석물의 업스트림 펄스 주입, 용출 피크 머무름 시간 및 너비에서 파생된 이론단과 등가 높이(HETP) 뿐만 아니라 수지 분해를 일으 킬 가능성이 있는 중간 세척 절차와 함께 수지 재사용으로 인한 바이러스 제거 손실 가능성 등이다.
최근 몇 년 동안 일회용 AEX 기술의 도입으로 통과형 AEX 크로마토그래피와 관 련된 사용에 대한 제한 조건의 완화 및 운영 비용 절감의 가능성이 밝혀졌다. 물리적 으로는 필터와 유사한 음이온 멤브레인 크로마토그래피(AEMC)인 일회용 AEX 제품은 확산 역학을 대류 흐름으로 대체하기 때문에 컬럼에 비해 향상된 비 용량 및 향상된 유속의 이점을 가진다. 이러한 기능을 통해 더욱 단순한 운전, 처리 시간의 감소, 버 퍼의 소비량 감소로 인해 컬럼에 비해 경제성이 향상될 것으로 평가되고 있다. 또한 일회용 특성으로 인해 바이러스 제거 성능을 포함하여 반복 사용 주기에 대한 성능 및 세척과 관련된 검증 비용이 필요하지 않다. 일회용 AEX 제품은 초기에 주로 실험 실 및 공정 개발 활동에서 사용되었지만 최근 리간드 및 매체 설계의 발전으로 인해 유체 조건 전반에 걸쳐 높은 비 용량과 강력한 성능을 가진 장치로 발전하고 있다.
대규모 제조에서 AEMC 장치의 배치와 관련하여 성공적으로 사용된 HETP 및 피크 비대칭 연구는 높은 유속, 큰 혼합 부피 및 짧은 베드 높이를 감안할 때 AEMC에는 중요 인자로서 기능하지 않음이 알려졌다. AEMC에 대한 테스트 전략을 정의할 때 발생할 수 있는 바이러스 제거 위험을 고려하는 것이 필요하다. 예를 들어, 제조 또 는 운송 및 취급 중에 발생할 수 있는 매체 또는 씰 손상으로 인한 기계적 우회로 인 해 바이러스 제거 손실이 발생할 수 있다. 대안적으로, 몇 가지 가능한 화학적 결함 으로 인해 기계적으로 통합된 캡슐에서 조기 바이러스 돌파가 발생할 수 있다. 또한, 바이오프로세싱 동안 위험 시간 분포가 있다. 손상된 캡슐로 귀중한 제품 함유 유체 를 처리하여 프로세스 편차와 값비싼 재처리가 필요한 위험을 줄이기 위해 비파괴 테 스트가 필요하다.
AEC는 음전하를 띤 pDNA와 고정상에 있는 비특이적 양전하 리간드 사이의 상호 작용을 통해 기능하며, 여기서 이 상호작용의 강도는 순전하와 국부 전하 밀도에 따 라 달라진다. 염 구배의 도입은 이러한 상호작용을 대체하고 pDNA는 사슬 길이, 형 태 및 동형체에 의해 영향을 받는 전하 밀도가 증가하는 순서로 용출된다. 서로 다른 DNA isoform은 동일한 사슬 길이, 전하 및 분자량을 갖지만, isoform 간의 전하 밀 도 및 물리화학적 특성의 차이를 통해 분리할 수 있다. supercoiled pDNA의 높은
압축률은 OC pDNA와 비교하여 더 큰 국소 전하 밀도를 제공하며, OC pDNA와 비 교하여 후에 supercoiled pDNA가 용리되도록 하는 더 강한 상호 작용에 기여한다.
무작위 코일이 있는 초나선 막대로 특징지어지는 선형 pDNA는 본질적으로 더 큰 탄 성도를 가지며 전단력에 의해 늘어날 수 있다. 이러한 독특한 특성은 선형 pDNA를 다른 두 개의 isoform으로부터 분리하는 데 기여한다. TSK 겔 DNA-NPR 약한 음이 온 교환 컬럼을 사용하여 Smith 등4) 은 supercoiled와 LO pDNA 사이의 용출 순서 에서 크기 및 구배 변화율에 의존적인 변화를 확인하였다. Quinine-carbamate 기반 약한 음이온 교환기를 사용한 연구에서 Mahut 등5) 은 isoform의 용출 순서는 이동 상, gradient change-rate, plasmid 크기의 변화에 무관하지만 온도 변화에 따라 달라진다고 보고하였다.
한편 큰 크기의 pDNA는 주로 고정상의 다공성 비드(<0.2μm)를 통과할 수 없는 큰 생체분자로 인해 컬럼 크로마토그래피에 의한 상업적 정제 공정에 상당한 제한을 가 져오며, 그 결과 pDNA가 주로 비드의 기공 내부로 침투하지 못하고 표면 위에 흡착 됨으로써 흡착 용량이 매우 제한된다. 이러한 제한에 대해 Prather 등6)은 단백질 정 제시 일반적으로 10-100g 정도의 로딩과 대조적으로 수지 1리터당 0.2-2g pDNA 정 도의 소량이 로딩되기 때문에 상당한 양의 수지 비드가 pDNA 정제에 필요하다고 하 였다. 낮은 회수율 및 비가역적인 pDNA 결합과 함께 컬럼 패킹, 세척 및 재생과 관 련된 시간 소모적이고 노동 집약적인 프로세스는 기존 컬럼 크로마토그래피에 대한 약점이다. AEMC는 음이온 교환막이 큰 대류 기공(>2μm)을 가지고 있어 pDNA를 막 표면으로 빠르게 수송하는 동시에 수지 대응물보다 한 차원 높은 결합 능력을 얻을 수 있어 컬럼 크로마토그래피의 한계를 극복할 수 있다. 높은 유속에서도 pDNA 정제 효율이 달성되므로 높은 처리량을 얻을 수 있으며, 상업적인 pDNA 정제는 바로 사용 할 수 있는 일회용 멤브레인을 사용하여 정제공정에 선형적으로 스케일 업할 수 있 다.7)
Zhong 등8)은 이전에 하이드로겔 기반의 강한 음이온 교환(Q) 멤브레인을 사용하 여 pDNA 정제 시 높은 결합 능력(12.4g /l의 멤브레인 부피)과 ~90%의 플라스미드
4) C.R. Smith, R.B. DePrince, J. Dackor, D. Weigl, J. Griffith, M. Persmark, J. Chromatogr. B, 854 (2007), p. 121
5) M. Mahut, A. Gargano, H. Schuchnigg, W. Lindner, M. Lammerhofer, Anal. Chem., 85 (2013), p. 2913
6) K.J. Prather, S. Sagar, J. Murphy, M. Chartrain, Enzyme Microb. Technol., 33 (2003), p.
865
7) C.H.Sum, J.Y.Chong, S.Wettig,R.A.Slavcev, Separation and purification of linear covalently closed deoxyribonucleic acid by Q-anion exchange membrane chromatography, Journal of Chromatography A, 1339 (2014) pp.214-218
8) L. Zhong, J. Scharer, M. Moo-Young, D. Fenner, L. Crossley, C.H. Honeyman, S.Y. Suen, C.P. Chou, J. Chromatogr. B, 879 (2011), p. 564
회수율을 보여주었다.
Vicent 등9)은 로타바이러스 유사 입자(RLP)를 Sartorius, Sartobind™ D, 디에틸아 민 음이온 교환기(DEAE) 매트릭스에서 상업적으로 입수할 수 있는 약한 음이온 교환 멤브레인 매트릭스를 사용하는 AEMC에 대한 연구를 하였다. 조기 유아 로타바이러 스 설사는 세계적으로 매우 흔하게 나타나는 문제이다. 이 특정 바이러스 유사 입자 는 로타바이러스 단백질 빌딩 블록인 VP2 및 VP6과 면역 반응에 필수적인 외부 당 단백질 층인 VP7의 어셈블리로서, 감염의 원인이 되는 바이러스 성분(예: DNA 또는 기타 단백질)을 피하는 이 입자는 약독화 생백신 또는 비활성화 바이러스 백신에 비 해 잠재적인 이점을 가지고 있다. 이들은 AEMC가 RLP의 DSP에 효율적으로 통합될 수 있음을 확인한 후 개선된 회수율 및 수율을 효과적으로 달성할 수 있었다고 보고 하였다.
강한 AEMC에 대한 베타-락토글로불린의 흡착에 대한 배치 흡착, 방사형 및 접선 흐름의 세 가지 다른 접촉 모드에 대한 연구를 Voswinkel 등10)이 수행하였다. 이들 은 온도의 함수로서 평형 흡착 등온선을 이용하였고, 실험결과 최대 결합 용량(qmax) 은 (1) 10°C 에서 qmax=1.08 mg/㎠ 대 50°C에서 qmax=0.82 mg/㎠인 등온선에 대해 낮은 온도에서 qmax가 더 높음을 관찰하였다. (2) 평균 qmax=0.82 mg/㎠ 인 경우 배 치 흡착에 대한 온도와 무관하다는 것을 확인하였으며, (3) qmax인 방사형 흐름에 대 해서도 더 낮은 온도에서 qmax가 더 높은 것을 확인하였다(qmax=0.87 mg/㎠ @15°C, qmax=0.38 mg/㎠ @50°C). 10°C, qmax=0.65 mg/㎠ 에서 접선 흐름의 경우, 배치 흡 착보다 10배 더 높은 물질 전달 계수의 차이에 비해 성능이 미미했는데, 이것은 유동 채널에 가장 가까운 멤브레인 기공의 대류 흐름과 유동 채널에서 가장 먼 멤브레인 기공의 확산 물질 전달에 기인한 것으로 분석하였다.
9) T.Vicent, M.F.Q.Sousa, C.Peixoto, J.P.B.Mota, P.M.Alves, M.J.T.Carrondo, Anion-exchange membrane chromatography for purification of rotavirus-like particles, Journal of Membrane Science, 311 (2008) pp. 270-283
10) L.Voswinkel, M.R.Etzel, U.Kulozik, Adsorption of beta-lactoglobulin in anion exchange membrane chromatography versus the contacting mode and temperature, LWT - Food Science and Technology, 79 (2017) pp.78-83
