제 3장 멤브레인 크로마토그래피의 원리
고분자 멤브레인과 크로마토그래피를 결합시킨 것이 멤브레인 크로마토그래피이다.
일반적으로 사용되는 입자 크기에 의한 분리기능을 갖는 멤브레인과 멤브레인 크로마 토그래피에 대한 개략적인 모식도를 [그림 1]에 나타내었다.
[그림 1] 멤브레인과 멤브레인 크로마토그래피
일반적으로 생물공정에서 사용되는 멤브레인이 기공크기1)에 따라 물질을 분리하는데 비해, 멤브레인 크로마토그래피는 멤브레인의 표면 개질2)이나 표면개질 후 친화성 리 간드를 결합시켜 목적물3)만을 용액으로부터 분리하기 위한 것이다. 따라서 멤브레인 크로마토그래피는 기존 컬럼 크로마토그래피와 마찬가지로 음이온교환, 양이온교환, 친화성, 소수성 멤브레인 크로마토그래피로 구분된다.
이러한 멤브레인 크로마토그래피는 전통적인 비드 형태 컬럼 크로마토그래피의 한 계를 극복하기 위하여 마이크로 또는 매크로 기공을 갖는 합성 멤브레인을 크로마토 그래피의 지지체로 사용한 것을 말한다. 따라서, 기존 크로마토그래피의 기본 원리는 멤브레인 크로마토그래피에도 적용될 수 있으며, 동시에 멤브레인의 기본 원리도 작 용하므로 본 장에서는 먼저 이들 두 기술의 대략적인 비교와 적용되는 이론적 원리를 소개하였다.
1) 엄밀히 멤브레인은 입자크기에 따라 분리하기도 하지만, 온도차에 의한 분리, 농도차에 의한 분리, 확 산속도에 따른 분리, 친화도에 의한 분리 등이 있으나, 여기서는 비교대상과의 유사한 멤브레인을 기 준으로 이해하기 쉽게 나타내기 위하여 체거름 방식의 멤브레인을 기준으로 제시함.
2) 여기서 표면개질은 반드시 멤브레인 제조 후 후속 공정을 통해 표면 특성을 변화시키는 것 뿐만 아니 라 이를 포함하여 주 골격을 이루는 고분자의 특성을 변화시키는 방법 모두를 의미하는 것으로, 리간 드를 도입하는 것을 포함하여 음이온 교환, 양이온교환, 소수성 등을 갖도록 하는 광의의 의미를 포 함한다.
3) 목적물이라 함은 우리가 원하는 산물뿐만 아니라 필요한 산물에 있어서는 안되는 불순물도 포함한다.
3.1. 컬럼 크로마토그래피와 멤브레인 크로마토그래피의 비교
멤브레인 크로마토그래피 공정은 용질을 포획할 수 있는 결합 사이트로 용질의 이 동이 대부분 대류(Convection)에 의해 이루어지는 반면 비드를 충전하여 사용하는 충전식 컬럼 크로마토그래피와 비교하여 기공으로의 확산(Diffusion)은 매우 적다. 따 라서 멤브레인 크로마토그래피 공정에서의 물질전달저항은 컬럼 크로마토그래피와 비 교하여 매우 작다[그림 2].
[그림 2] 충전상 크로마토그래피와 멤브레인 크로마토그래피에서 용질의 이동
기공에서의 대류 용액의 흐름은 물질전달 저항을 크게 감소시킴으로써 율속단계가 컬럼 크로마토그래피의 흡착단계에서 결합속도단계(binding kinetics)로 변화하게 된 다. 즉, 비교대상의 두 크로마토그레피 공정에서 결합속도는 거의 변화하지 않지만 컬 럼 크로마토그래피에서는 느린 확산으로 인해 확산시간이 지배적인 반면, 멤브레인 크로마토그래피는 확산시간을 획기적으로 개선하여 결합속도단계가 지배적인 단계가 된 것이다. 따라서 멤브레인 크로마토그래피에서는 흡착시간과 세정, 용리 및 재생 시 간을 줄여주게 되므로 시간을 절약하고 효율을 증가시킬 수 있다. 무엇보다도 가장 중요한 것은 빠른 공정으로 인해 생체분자의 비활성을 피할 수 있다는 것이다. 주지
하다시피 모든 생체분자는 활성을 가지고 있기 때문에 빠른 공정은 생체분자의 활성 저하를 감소시킨다. 작은 비드에 대한 높은 압력강하와 높은 유속에서 연질 겔의 압 축을 포함하는 컬럼 크로마토그래피에 비해 멤브레인 크로마토그래피는 얇은 미세 당 공성 구조로서 압력강하가 낮고, 유속이 높으며, 생산성이 높다. 또한 손쉬운 패킹 및 스케일업과 상대적으로 낮은 오염 및 기공 폐색과 같은 잇점을 지니고 있어 단백질을 비롯한 효소, 백신 등 바이오 의약품의 분리, 정제 및 회수를 위한 잠재력이 큰 분리 공정이다. 그러나 멤브레인 크로마토그래피는 일반적으로 고해상도 분리를 수행하는 데 있어 적절하지 않은 것으로 보고되고 있는데, 이는 유동의 불균일성에 기인한다.
이를 해결하기 위한 다양한 장치들이 고안되고 있는데, 그 중 LFMC(Laterally-fed membrane chromatography)4)5)나 환형 중공사막 크로마토그래피(Annular-flow hollow-fiber membrane chromatography)6) 등에 대한 연구가 이루어지고 있다.
3.2. 멤브레인 크로마토그래피 특성
합성 고분자 다공성 멤브레인이 멤브레인 크로마토그래피에 주로 사용된다. 멤브레 인 재료는 일반적으로 재생 셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트, 폴리설폰, 폴리에테르설 폰(PES), 폴리비닐리덴플루오라이드(PVDF) 및 폴리아미드(PA)와 같은 고분자이다.
기공의 크기가 0.1, 0.2, 0.45, 0.8 µm 및 3µm 이상인 다공성 멤브레인이 일반적으 로 멤브레인 크로마토그래피의 기본 매트릭스로 사용된다. 멤브레인은 일반적으로 매 우 얇기 때문에 기공에서의 기공표면과 기공 내 벌크 흐름에서의 물질 경계층은 무시 할 정도로 작아서 물질전달 경계층에서의 확산 저항은 매우 작다. Sartorius의 Sartobind 멤브레인 크로마토그래피는 0.45 또는 3~5µm 안정화 강화 셀룰로스 멤브 레인을 크로마토그래피 매트릭스로 사용하고 있다. Pall의 Mustang 이온교환 멤브레 인은 0.8µm PES 멤브레인을 매트릭스로 만들어진다. 0.1 및 0.2 µm의 기공크기를 갖는 PVDF 멤브레인이 소수성 상호작용 멤브레인으로 개발되었다. 이들 0.1 및 0.2 µm 멤브레인은 원래 바이러스제거 및 제균 필터로 사용되고 있기 때문에 매우 엄격 한 품질 관리하에 제조되어 멤브레인 크로마토그래피의 중요한 특성 중 하나인 매우
4) R.Ghosh, P. Madadkar, Q. Wu, On the working of laterally-fed membrane chromatography, J. Membr. Sci. 516 26 (2016).
5) P. Madadkar, U. Umatheva, G. Hale, Y. Durocher, R. Ghosh, Ulrafast separation and analysis of monoclonal antibody aggregates using membrane chromatography, Anal.
Chem. 89 4716 (2017).
6) G. Chen, U. Umatheva, L. Alforque, H. Shirataki, S. Ogawa, C. Kato, R. Ghosh, An annular-flow, hollow-fiber membrane chromatography device for fast, high resolution protein separation at low pressure, J. Membr. Sci. 590 1(2019).
우수한 기공 크기 균일성을 갖는다.
멤브레인 크로마토그래피에 널리 사용되는 두 가지 유형의 멤브레인 모듈은 평판형 멤브레인 모듈과 방사형 멤브레인 카트리지이며, 최근에는 중공사형 멤브레인도 개발 되고 있다. 평판 멤브레인은 일반적으로 디스크로 절단되고 높이가 수 밀리미터인 디 스크 스택이 멤브레인 모듈에 고정된다. 멤브레인 부피를 증가시키는 것 외에도 멤브 레인 스택을 사용하면 멤브레인 불균일성을 줄이고 결합력을 높일 수 있는 장점이 있 다. 방사형 멤브레인은 다공성 원통형 코어 주위에 편평한 시트 멤브레인을 절곡하여 나선형으로 감아 제조한다. 여기서 흐름은 카트리지로 펌핑된 다음 방사형 멤브레인 바깥쪽으로 분산된다. 베드 높이가 1cm 미만인 5L 멤브레인 흡착기를 보유하는 이러 한 종류의 카트리지는 Sartorius와 Pall에 의해 개발되어 상품화되었다. 산업용 바이 오 의약품이나 단백질 분리를 위한 더 큰 규모의 경우에는 여러 카트리지를 병렬 및/
또는 직렬로 연결하여 사용한다. 평판 멤브레인 모듈은 일반적으로 단위부피당 면적 이 작아 대부분 실험실에서 사용되지만 방사형 멤브레인 카트리지는 산업용으로 주로 사용한다. 흐름 모드가 서로 다르지만 이들 멤브레인 모듈은 모두 매우 얇은 멤브레 인 시트를 사용하므로 높은 유속과 낮은 압력 강하를 제공한다. 단백질 폴리싱의 예 에서는 600cm/h 이상의 유속에서 4mm 높이의 음이온 교환 멤브레인을 사용했지만, 동일한 기능을 달성하기 위해 컬럼 크로마토그래피는 15cm 높이의 컬럼을 사용해야 하는 것으로 알려져 있다. 대류흐름과 결합된 얇은 멤브레인 베드는 버퍼 소비를 상 당히 줄이고 공정 시간을 단축할 수 있다.
친화성 멤브레인 크로마토그래피 (AMC), 이온교환 멤브레인 크로마토그래피 (IEMC), 소수성 상호작용 멤브레인 크로마토그래피 (HIMC) 및 역상 멤브레인 크로마 토그래피를 비롯한 다양한 멤브레인 크로마토그래피가 사용되고 있다. 예를 들어, 단 백질 A 기반 AMC는 인간 면역 글로불린 (hlgG)의 정제에 사용되고 있다. IEMC는 단일 클론 항체의 정제에 사용되었으며, 친수화된 멤브레인을 사용하는 HIMC는 혈청 및 CHO 세포 배양에서 mAb를 정제하는데 사용하고 있다. HIMC는 일반적으로 멤브 레인 크로마토그래피에 사용되지 않으며, 오히려 친수성 고분자로 변형된 소수성 멤 브레인(예 : PVDF)이 단백질 결합이 적은 미세 여과에 적합한 것으로 알려져 있다.
염 조건에 따라 HIMC은 조정 가능한 소수성 및 따라서 가역적 단백질 결합 특성, 즉 고염에서는 단백질을 결합하고 저염에서는 용출하는 특성을 갖는다. 약한 소수성으로 인해 단백질의 높은 회수율은 경쟁적인 결합 능력으로 관찰된다. HIMC는 항체가 일 반적으로 혈청 알부민과 같은 환경에서 단백질보다 더 소수성이기 때문에 항체 정제 에 특히 적합한 것으로 알려져 있다. Pall Life Science의 Mustang 이온 교환 멤브
레인, Sartobind Protein A/G, Sartorius의 금속 킬레이트 및 이온 교환 멤브레인 과 같은 다양한 화학물질을 가진 상업용 멤브레인 크로마토그래피가 개발되어 사용되 고 있다. Sartorius는 최근에 Sartobind Phenyl이라는 HIMC 멤브레인을 상용화했 는데, 이는 Sepharose Phenyl과 비슷한 결합력을 보였지만 훨씬 더 높은 유속에서 사용할 수 있는 특징을 가진다.
flow-through 모드와 bind-elute 모드는 모두 막 크로마토 그래피를 위해 개발되었 습니다. Flow-through 모드 막 크로마토 그래피는 단일 클론 항체에서 미량 불순물 을 제거하는 데 사용되었습니다 (Knudsen et al. 2001; Philips et al. 2004). 이러 한 연구의 대부분은 산업 연구원에 의해 수행되었으며이 기술은 CAMPATH-1H의 상 업적 생산에 사용되었습니다 (Gallher and Fowler 2001). mAb 생산에서 숙주 세포 DNA, 바이러스, 내 독소 및 많은 숙주 세포 단백질을 포함한 대부분의 미량 불순물 은 중성 pH에서 음으로 하전되는 반면 mAb는 일반적으로 양으로 하전됩니다. 이는 mAb 생성물이 통과하도록 허용하면서 미량 불순물을 결합하기 위해 음이온 교환 크 로마토 그래피를 사용하는 기초를 제공합니다. 그러나 컬럼 크로마토 그래피는 부피 유속 및 유속 분포의 한계를 극복하기 위해 큰 직경과 최소 베드 높이를 필요로하므 로 컬럼 크기가 커집니다 (Knudsen et al. 2001). 막 크로마토 그래피는 대류 흐름 이 결합 능력에 영향을주지 않고 높은 유속을 제공하기 때문에 항체에서 미량 불순물 제거를위한 더 나은 옵션입니다. 흐름 분포는 축 흐름 모드가있는 산업용 멤브레인 카트리지의 제한이 아닙니다. 또한 DNA 및 바이러스와 같은 큰 생체 분자의 결합 능 력은 컬럼 크로마토 그래피보다 막 크로마토 그래피에서 더 높습니다 (Teeters et al.
2003; Etzel 2009). 마지막으로, 멤브레인 카트리지를 일회용으로 사용하면 컬럼 패 킹, 세척, 보관 및 이러한 활동의 검증에 드는 비용을 많이 절약 할 수 있습니다.
Amgen의 Zhou and Tressel (2006)은 미량 불순물 제거를위한 플로우 스루 모드 크로마토 그래피 비용을 분석했습니다. 결과는 10.5 Kg / L Q 막 흡착제의 항체 처 리 능력을 가진 모델 바이러스의 5 log 제거를 보여 주었다. 겔을 100주기 동안 재사 용하더라도 멤브레인 크로마토 그래피에서 10 년 운영 비용이 저렴합니다. 결합 용리 모드 막 크로마토 그래피는 현재 실험실 및 파일럿 규모로 개발되었습니다.
이 모드는 멤브레인 크로마토 그래피의 주류 응용 프로그램이어야합니다. 그러나 다 음 섹션에서 특별히 논의 할 상대적으로 낮은 결합력으로 인해 널리 사용되지 않았습 니다. 막 흡착기에 표적 단백질을 결합한 다음 한 단계 또는 구배 용출을 사용하여 탈착함으로써 막 크로마토 그래피의 분해능을 완전히 활용할 수 있습니다. 친 화성 막 크로마토 그래피가 널리 개발되었습니다. 포괄적 인 검토는 막 재료와 막에 대한
다양한 친 화성 리간드의 커플 링을 소개했습니다 (Zou et al. 2001). 가장 널리 사 용되는 친 화성 막은 항체 정제를위한 단백질 A / G 또는 막상의 합성 리간드, 항체 또는 항원 정제를위한 면역 친 화성 막 및 다양한 단백질에 대한 금속 친 화성 (Castilho et al. 2002; Denizli 2002; Ruckenstein and Guo 2001)을 포함합니다.
결합 용리 모드의 AMC는 높은 선택 성과 높은 처리량을 모두 나타 냈습니다. 유전자 치료 또는 백신을위한 플라스미드 DNA 또는 바이러스는 결합 용리 모드에서 IEMC 를 사용하여 정제 할 수 있습니다. 예를 들어, 6.1 킬로 염기쌍 플라스미드에 대한 Mustang Q의 분리 효율은 200 개의 플레이트 1cm로보고되어 15μm 겔 입자보다 10 배 이상 높습니다 (Teeters et al. 2003). 혈장 단백질 분별을위한 2 단계 IEMC 공정이 수립되고 파일럿 규모로 확장되어 Sepharose 기반 공정보다 더 높은 생산성 과 우수한 재현성과 안정성을 제공합니다 (Gebauer et al. 1997). 친 화성 및 이온 교환을 제외하고 HIMC는 특히 혈청 및 CHO 세포 배양에서 고분해능 항체 정제를 위해 bind-elute 모드에서 널리 사용되었습니다 (Ghosh 2001 및 2005; Ghosh and Wang 2006).
높은 처리량과 고해상도의 이점에도 불구하고 멤브레인 크로마토그래피는 낮은 결합 능력이 단점으로 지적되곤 했다. 그러나 이 단점은 경우에 따라 다르게 나타나므로 재검토가 필요한 부분이다. DNA, 바이러스 및 내독소와 같은 큰 생체 분자의 경우에 는 멤브레인 크로마토그래피가 실제 컬럼 크로마토그래피보다 훨씬 높은 결합능력을 보여주고 있기 때문이다. 음이온 교환 멤브레인 크로마토그래피를 플라스미드 DNA 정제에 사용했을 때 결합능력은 10mg/ml로 보고되었으며, 이는 일반적인 다공성 비 드의 값보다 훨씬 더 높은 수치이다. 또 다른 유사한 연구에서 동적 결합 능력은 20
~ 25배 더 높았고 유속은 비드 값보다 55~550 배 더 높았다. 겔 크로마토그래피에서 비드의 작은 기공은 거대 생체분자에 대해서는 데드 채널로 작동할 수 밖에 없고, 따 라서 대부분 비드의 외부 표면에 결합하는 반면 멤브레인 크로마토그래피의 대류 흐 름은 거대 생체 분자를 기공 표면으로 직접 운반할 수 있기 때문이다. 또한, 멤브레 인의 비표면적은 일반적으로 겔 입자의 비표면적보다 작지만 외부 겔 표면의 비표면 적보다는 훨씬 크다. 예를 들어, 0.65 µm 기공크기, 0.7 공극 분율 및 140 µm 두께 의 일반적인 미세 다공성 멤브레인은 1.1 ㎡/mL의 내부 기공 표면을 갖는 반면 90 µm 비드로 채워진 컬럼은 약 0.11 ㎡/mL 외부 표면을 갖는다. 따라서 플라스미드 DNA 및 바이러스 입자와 같은 거대 생체 분자의 결합 능력은 의심할 여지없이 컬럼 크로마토그래피보다 멤브레인 크로마토그래피에서 더 크다고 할 수 있다. 멤브레인 크로마토그래피에서 작은 단백질의 결합 능력은 작은 단백질이 비드의 기공 구조로 확산될 수 있기 때문에 컬럼 크로마토그래피에서보다 상대적으로 낮다. 예를 들어, 키
토산 음이온 교환 멤브레인은 인간 혈청 알부민, 오발부민 및 대두 트립신 억제제에 대해 각각 11.6, 19 및 20.8 mg/ml 멤브레인에 결합하는 것으로 알려져 있다. 리소 자임 및 혈청 알부민과 같은 작은 단백질의 결합 능력은 Sartobind 이온 교환 멤브 레인에서 22-29mg/ml 정도이다.7) 그러나 100kDa를 초과하는 큰 단백질의 경우 30-50 nm 기공 크기를 가진 겔 입자에 크기 배제 효과가 존재한다. 예를 들어, 660 kDa 단백질인 티로글로불린은 Sartobind Q에서 18mg/ml의 결합능력을 가진 반면 Q 젤 에서는 3.5mg/ml에 불과하다(Sartorius Stedim Biotech). 이 연구에서 연구 된 단백질, 주로 항체 (> 150kDa)와 PEG화 단백질은 상대적으로 큰 크기로 인해 멤 브레인 크로마토그래피에서 상대적으로 높은 결합능력을 가진다. HIMC에서 항체 결 합의 경우, 10% 돌파 결합 능력은 0.22 µm 및 0.1 µm PVDF 멤브레인에 대해 각각 35.2 및 42.8 mg 항체/mL까지 도달할 수 있는 것으로 알려져 있다. PEG화된 단백 질은 PEG의 높은 점도 반경으로 인해 동일한 분자량을 가진 단백질보다 크기가 훨씬 더 크므로 멤브레인 크로마토그래피를 사용한 정제에 보다 적합한 것으로 알려져 있 다. 유동분포, 기공크기 및 멤브레인 두께의 균일성, 멤브레인 표면개질 등 많은 다른 요인들도 결합력에 매우 중요한 역할을 한다. 이러한 요소의 개선은 멤브레인 크로마 토그래피에서 단백질 결합을 향상시키기 위해 필요한 부분이다. 유동 분포 문제는 실 제로 멤브레인 및 컬럼 크로마토그래피 모두에 존재한다. 이러한 문제를 해결하기 위 한 새로운 스택 멤브레인 모듈 설계가 개발되고 있으며 일부 개선된 유동 분포는 양 이온 교환 PVDF 멤브레인을 사용하여 10% 돌파에서 리소자임 결합능력을 28.9에서 45.2 mg/ml로 증가시키기도 하였다. 다층의 멤브레인 크로마토그래피는 불균일한 기 공크기와 막 두께의 역효과를 효과적으로 감소시켜 결합력을 향상시킬 수 있다. 양이 온 교환막의 항체 돌파 결합 능력은 유속과 무관하지만 적층 수에 따라 급격히 증가 하는 것으로 알려져 있다. 단 층의 경우 7mg/ml인데 반해 15 겹 적층의 경우 30mg/ml, 60 겹 적층의 경우 40mg/ml까지 증가한 것으로 보고되기도 하였다.
3.3. 기본 이론
8)분리능은 목적 성분 피크를 분리할 때 필요한 컬럼의 분리 능력을 나타낸다. 분리 능은 목적성분 피크를 분리할 때 필요한 분리능력을 나타낸다. 분리능은 효율성(N),
7) Sartorius 데이터 기준
8) Agilent Technologies, ‘고성능 액체크로마토그래피 기초 이론’ 자료를 바탕으로 작성함
선택성(α), 머무름(k)등의 요소에 영향을 받는다. 정량 분석을 수행하는데 필요한 최 소 분리능의 값은 1이다. 동일한 높이의 두 피크 간의 골을 식별하려면 최소 0.6이어 야 한다. 안정한 분석법의 경우, 일반적으로 분리능의 값이 1.7 이상이어야 한다. 값 이 1.6이면 베이스라인 분리를 실현하였음을 의미하며 가장 정확한 정량 분석 결과를 얻을 수 있다.
⋅
여기서
: 성분 의 머무름 시간
: 피크 높이 1/2 지점에서의 피크 폭
: 베이스라인에서의 피크 폭
위의 식은 효율성, 선택성, 머무름 항으로 구분하여 다시 쓰면
⋅
⋅
와 같이 되고, 여기서
효율성 : ⋅
선택성 :
머무름 :
이고, 위의 3개 파라미터 중 하나를 최적화함으로써 분리능을 향상시킬 수 있다. 특 히 선택성은 분리능에 가장 큰 영향을 분다. 선택성의 미세한 변화는 분리능에 큰 변 화를 야기한다. 머무름은 k 값이 작은 피크에서만 현저한 변화를 보인다. 효율성은 컬럼의 분리능력을 나타낸다.
여기서, 분리능은 선택성, 컬럼 효율성 및 머무름의 함수로 나타낼 수 있다. 효율성 또는 이론단수(N)은
⋅
⋅
으로 나타낼 수 있다. 컬럼 효율성은 서로 다른 컬럼 간의 성능을 비교할 때 사용된 다. 이는 이론단수 N으로 표현된다. 단수가 높은 컬럼은 효율성이 더 좋다. 높은 단 수 N을 갖는 컬럼은 단수가 낮은 컬럼에 비해 주어진 머무름 시간에서의 피크 폭이 더 좁다. 컬럼의 효율성에 영향을 미치는 파라미터는 컬럼 길이와 입자크기인데, 효율 성은 컬럼 길이가 길수록, 입자크기가 작을수록 증가한다.
머무름 인자(k)는
으로 나타낼 수 있는데, 시료 내 성분이 이동상에 머무른 시간과 고정상에 머무른 시 간의 비를 나타낸다. 이러한 계산법은 머무름 시간을 머무르지 않고 흘러간 피크 시 간()으로 나누어 준 것이다. 머무름 인자에 영향주는 파라미터는 고정상, 이동상, 기 울기 경사, 시스템 체류시간(System dwell volume)이다.
머무름인자 – 기울기 용출간의 관계는
⋅ ∆ ⋅
⋅
로 나타낼 수 있는데, 이 방정식은 유속(), 기울기 시간(), 기울기 범위(∆), 컬 럼 부피()가 머무름 인자에 주는 영향을 나타낸다. 머무름 인자를 일정하게 유지 하려면 분모의 변화량에 따라 분자가 같은 비례로 변해야 서로 상쇄될 수 있다. 반대 로 해도 역시 마찬가지이다.
선택성 또는 분리인자 ()는 다음 식으로 나타낸다.
여기서,
: 선택성
: 첫 번째 피크의 머무름 인자
: 두 번째 피크의 머무름 인자
이다. 선택성은 두 피크의 최대치간의 거리차 또는 시간차를 의미한다. 만약
이라면 두 피크는 서로 같은 머무름 시간을 가지며 두 성분은 동시에 용출된다. 즉, 두 물질간의 분리가 불가능하게 된다. 선택성은 용량인자(capacity factor)의 비율로 정의된다. 머무름 인자에 영향을 주는 파라미터는 고정상, 이동상, 온도이다.
