3차원 입자기반의 세포 배양기술을 위한 광경화 미세유체 공정 기술과 응용
Optofluidic Maskless Lithography and Its Application for 3D Cell Culture Based on a Microparticle
박 욱1ㆍ권성훈2
| Wook Park
1, Sunghoon Kwon
21
Department of Electronics and Radio-engineering, Kyung Hee University, 1732, Deongyeong-daero, Giheung-gu, Yongin-si, Gyeonggi-do 446-701, Korea
2
Department of Electrical Engineering and Computer Science, Seoul National University, Daehak-dong, Gwanak-gu, Seoul 151-744, Korea
E-mail: [email protected]
박 욱
2002 서울대학교 전기공학부 (학사) 2011 서울대학교 전기‧ 컴퓨터공학부
(박사)
2011 대통령 포닥 펠로우 2012-현재 경희대학교 전자‧ 전파공학과
조교수
권성훈
1998 서울대학교 전기공학부 (학사) 2000 서울대학교 의공학과 (석사) 2004 University of California, Berkeley,
(박사)
2004-2006 Molecular Foundry at Lawrence Berkeley National Laboratory (Post-Doc.)
2006 서울대학교 전기공학부 조교수 2013-현재 서울대학교 전기공학부 부교수
1. 서론
인간의 몸은 세포와 조직들로 이루어지며 그러한 3차원 구조들이 서로 유기적으로 상호작용을 통해 생명활동 을 유지한다. 많은 과학자들은 이러한 생명원리를 규명하고 인간 질병, 노화등의 문제들을 풀기 위하여 부단히 노 력하여왔다. 오랫동안 그들은 인체를 구성하는 생명의 작은 단위인 세포를 연구하기 위해, 세포가 살고 있는 생체 내의 환경을 실험실에서 재현해왔다. 그동안 이러한 목적으로 2차원 세포 배양 방법이 널리 사용되었는데, 2차원 의 평평한 배양접시에 세포들은 배양되고 그 위에서 여러 반응들이 관찰되었다. 그렇지만 이러한 2차원 세포 배 양은 생체 내의 3차원 구조 및 표면의 특성들을 반영하는데에 제한이 있었으며, 연구가 진행됨에 따라 생체내부 의 환경들에 얼마나 비슷하게 실험조건이 주어지는냐에 따라 실험결과들이 달라지는 연구들이 보고되었다. 이러 한 한계를 극복하고자 많은 연구자들은 오랫동안 생체와 비슷한 환경의 3차원 세포 배양에 관해 연구하고 있다.1,2 특히 제약산업의 경우 신약개발을 위해 천연물, 화합물 등 다양한 종류의 생체와 반응할 수 있는 물질에 대해 연구한다. 이러한 경우 신약개발을 위해 약물을 스크리닝하는 과정에서 비용 및 시간을 줄이기 위해 멀티플렉 싱 방법을 도입하고 있다.3 즉 한번에 다양한 조합의 에세이를 할 수 있도록 반응의 양을 줄이고 반응수를 늘리 는 방법이다. 그러한 노력의 일환으로 마이크로 어레이 접근방법이 있다. 다양한 종류의 반응에 사용될 물질들 을 마이크로 어레이 형태로 바닥에 고정시키는 방법이다. 각각의 어레이는 세포 배양전에 제작되며, 이때 각각 의 영역의 위치정보와 해당 반응물질에 대해 저장된다. 반응 후 연구자는 의미 있는 반응 조합을 찾고, 영역의 위치정보를 통해 반응에 사용되는 물질에 대한 정보를 역추척하는 과정을 통해 다수의 반응 조합에서 의미있는 반응 조합을 찾아낸다. 이러한 접근방법을 통해 연구자들은 에세이의 단위공정당 반응수를 늘리는데 성공을 했 지만, 어레이를 형성하기 위해서는 별도의 갖추어진 장비들이 필요하며, 이는 소단위의 에세이 실험 등을 위해 서는 적합하지 않은 한계점을 지니고 있다.4
그림 1. 광경화성 하이드로젤을 이용한 마이크로입자 제작 방법 : (A) 광미세유체 공정, 마스크를 사용하지 않고 Digital Micromirror Device를 사용하여, 다양한 모양의 입자를 생성, (B) 실시간으로 연속적으로 패턴을 변형해 가면서 생성되는 입자의 모양 변형, (C) 높이방향의 복잡한 구조를 생성하기 위해 맴브레인 구조를 도입하여 3차원 구조 생성, (D) 무작위 위치에 따른 입자의 캡슐레이션을 위해 동적인 마스크를 생성하여 입자를 캡슐레이션 하는 방법.
2. 본론
최근에는 이러한 에세이의 수율을 높이기 위한 방법으로 입 자기반의 기술들이 주목을 받고 있다. 코드입자를 이용한 세포 배양기술은 서로 다른 기능성 물질을 함유한 입자 위에 세포를 배양하여 기능성 물질에 따른 세포의 반응을 코드를 통해 입자 별로 확인하는 기술이다.5,6 입자에 대한 정보가 입자 자체 내 에 있기 때문에 반응 위치에 구애받지 않고 에세이를 할 수 있 다. 따라서 마이크 어레이를 제작하기 위해 소모되는 시간과 비용을 줄일 수 있으며, 에세이수를 증가시키기 위해서는 단순 히 반응할 입자의 종류를 늘리면 되기 때문에 높은 확장성을 가 진다.
또한 입자들은 3차원의 구조물이며 3차원상태에서 분포 가 가능하기 때문에 2차원의 어레이기술에 비해 높은 집약도 로 에세이를 할 수 있다. 코드화입자를 이용한 에세이방법은 입자생성기술이 발달함에 따라 더욱 현실화되었다.
초기의 입자 생성기술은 결정화 과정 혹은 극성이 다른 물 질을 이용한 방울 형성등의 방법을 이용하였다. 이러한 입자 생성 방법은 대량으로 생산할 수 있는 장점을 가지고 있으나, 입자의 모양이 대부분 구형이며, 크기의 조절이 어렵고, 균일 한 크기의 입자를 얻기 어려웠다.7 소프트 리소 그래피 기술 의 발달로 인하여 마이크로유체관을 용이하게 제작할 수 있 게 되었으며 이 기술을 이용하여, 미세방울을 생성할 수 있는 미세유체관 형태를 발견하였다. 생성기술은 기존의 교반기
술을 이용한 방법에 비해 매우 균일한 크기의 입자를 얻을 수 있는 장점이 있었다. 그렇지만, 이 장치로 제작할 수 있는 입자의 모양은 여전히 구형 혹은 타원형 헝태로 제한되었다.
또한 전체적으로 비슷한 형태의 입자가 생성되므로 모양이 나 형태를 통한 코드의 생성보다 코드로 이용할 수 있는 물질 들을 함께 포함하여 코드를 형성하는 방식으로 응용되었다.
단순한 구형태의 입자에서 벗어나 광경화 공정을 통해 마 이크로 사이즈의 입자를 만들려는 시도들이 있었다. 특히 반 도체의 포토 리소 공정을 통해 광경화 과정을 엔지니어적으 로 접근하여 흥미로운 연구들이 발표되고 있다. 마이크로플 루이딕스와 결합하여 연속공정을 통해 입자를 생산할 수 있 는 광미세유체공정이 개발되었다.8 특히 광미세유체공정 기 술은 동적인 마스크이미지를 형성하기 위해 디지털 마이크 로 미러 디바이스를 사용한다. 이 디지털 마이크로 미러 디바 이스는 멤스기술로 만들어진 마이크로 어레이로서 어레이 하나하나 각도를 조절하여 on/off를 생성할 수 있다. 컴퓨터 로 각 어레이들의 on/off를 조절하여 이에 의해 생성된 반사 형 어레이패턴을 생성한다. 여기에 광경화를 위한 자외선을 조사하여 반사하면서 발생한 광패턴을 렌즈로 축소하여 마 이크로 스케일의 원하는 모양의 입자를 광경화 과정을 통해 생성할 수 있다. 특히 이때 사용될 수 있는 광경화성 PEGDA (poly(ethylene glycol) diacrylate))는 자외선에 의해 광경화 과정을 통해 PEG(poly(ethylene glycol))를 형성하고 이는 하이드로젤로 생체에 적합한 물질로 널리 알려져 있다.
그림 2. (A) 미세유체관내부에 선로와 같이 홈이 파인 채널을 이용하여 입자를 홈에 따라 움직일 수 있는 기술. 미세유체관 내부의 유체의 흐름과 다른 방향의 입자의 움직임을 유도한다. (B) 벨브기술을 사용하여 동적으로 입자가 따라갈 수 있는 홈을 만들어 마이크입자의 분류 기술로 이용. (C) 마이크로입자의 모양을 창의적으로 디자인하여 입자의 방향에 따라 미세유체관 내부에서 자동으로 정렬되어 조립되는 기술. 홈을 따라 움직일 수 있는 핀의 위치(위,아래)와 전면부와 후면부의 경사방향(앞,뒤)에 따라 입자는 총 네가지 상태로 정렬.
이러한 입자들은 대체적으로 마스크에 의해 형성된 빛의 경로에 따라 다양한 모양을 가질 수는 있지만, 높이 방향으로 는 기둥형태의 모양으로 형성된다. 좀더 복잡한 모양의 입자 를 만들기 위해서는 높이 방향으로도 입자의 모양을 조절할 수 있어야 한다. 기존 입자생성을 하던 마이크로채널에 광경 화되는 영역의 높이를 컨트롤할 수 있는 맴브레인 구조를 결 합하여, 입자의 높이 방향으로 다중 레이어를 형성할 수 있도 록 하였다.9 따라서 각 레이어마다 다른 형태의 구조를 생성 할 수 있게 하여 복잡한 형태의 구조물을 생성할 수 있다. 맴 브레인을 통해 미세유체관의 높이를 조절하기 위하여, 별도 의 공기가 통할 수 있는 미세관을 형성하여 미세관으로 양압, 음압을 가해주면서 채널 내의 맴브레인의 높이를 조절한다.
그림 1(C)는 맴브레인의 높이를 점차 높여가면서 각 레이어 별로 다른 형태의 구조를 만들어주어, 기둥형태를 벗어난 3
차원의 복잡한 구조물을 만들 수 있음을 보여준다.
세포들을 3차원 구조물에 고정시키려면 입자를 제작한 후 에 표면에 고정하는 방법과 입자 생성시 세포를 캡슐화하여 하이드로젤 구조체 내부에 세포를 고정시키는 방법이 있다.
특히 하이드로젤과 같이 외부의 영양분이 구조체 내부로 통 과할 수 있는 재료일 경우에는 세포를 입자안에서 배양할 수 있는 환경을 조성할 수 있다.10 광경화를 위한 마스크 기술은 일반적으로 고정되어 고정된 영역으로 세포등의 광경화를 통해 하이드로젤과 함께 경화하여할 타겟을 이동시켜야 한 다. 그렇지만 세포와 같은 타겟은 상대적으로 크기가 크며, 채널상으로 유입되는 모습과 형태가 경우에 따라 다르다. 생 성되는 세포를 포함하는 입자간 편차를 줄이거나 정교하게 개체수 혹은 크기등을 조절하고자 한다면, 이를 고려하여 개 별적인 경우에 따라 마스크의 위치와 모양, 크기들을 변화시
그림 3. (A) 상자성 자성 나노입자를 포함한 마이크로 입자: 내부에 상자성 나노 입자들의 정렬된 체인형태의 구조, 자기장의 방향에 따른 입자의 회전 (B) 이종의 자성축을 가진 마이크로구조물: 사전에 형성된 상자성 나노입자의 정 렬 방향에 따라 자기장을 가해졌을 경우, 두가지 방향의 입자의 이동이 발생.
킬 필요가 있다. 이런 경우 고정 마스크를 사용하기 어려우며 영상처리기술을 사용하여 개별적인 경우 실시간적으로 채널 에 유입된 세포들의 개체수 혹은 모양들을 고려하여 마스크 를 형성할 수 있다. 이러한 기술의 전단계로 일반적인 무기실 리콘 입자들을 채널에 유입하여 실리콘입자을 개별적으로 동적인 마스크를 형성하여 캡슐레이션시키는 기술이 발표되 었다.11 단순히 세포가 포함된 하이드로젤 블럭을 임의의 조 건으로 성형하는 것이 아닌, 세포 개별적으로 캡슐화하거나 소량의 세포들을 수를 조절하여 세포를 캡슐화할 때 이 기술 은 유용하게 적용될 수 있다.
입자기반의 세포배양의 장점은 기존에 2차원 배양접시기 반의 세포배양환경에 비해 다양한 제어환경을 제공한다는 점 이다. 개별적인 입자들이 외부의 전기장, 자기장 혹은 유체의 흐름에 의해 위치와 움직임을 조절할 수 있다. 생체내부에는 유체의 흐름이 존재하는 환경들이 존재하기 때문에 마이크 로입자를 이용한 기술뿐만 아니라 미세유체관을 이용한 기 술도 주목을 받고 있다. 특히 미세유체관에서의 유체의 이동 은 매크로스케일의 일반 유체유동에 비해 층류형태를 유지 하며 이동하며, 이에 따라 유체의 흐름을 예측하고 조절하기 가 상대적으로 용이하다. 이러한 특성은 미세유체관 내에서 의 입자의 흐름 또한 제어하는데 큰 역할을 한다. 그렇지만 단순한 유체의 흐름만으로 유체의 움직임과는 다른 방향으 로 입자를 이동하거나 입자에 복합적인 전단응력이 작용하 도록 하기에는 어려움이 있었다. 그런데 미세유체관에 간단 히 좀더 작은 크기의 채널 길이방향의 홈이 파인 선구조를 고안하여 그 위에서 입자를 제어한다면, 미세유체관에 유체
의 흐름과 입자의 이동이 다른 방향으로 작용할 수 있다.12 즉 단순한 유체의 작용만으로 복잡한 입자의 이동 및 조립을 위 한 유동으로 이용할 수 있다. 그림 2(A)는 미세유체관 내부에 이종의 세포를 각각 캡슐화하여 만들어진 하이드로젤 블럭을 미세유체관내의 선구조를 사용하여 어레이형태로 조립한 모 습이다.
이러한 홈을 조건에 따라 동적으로 생성하게 되면 좀 더 자유도가 높은 제어를 할 수 있으며 이를 이용하여 동적으로 입자를 분류하거나 조립하는데 이용될 수 있다. 채널 안에 홈 형태의 선로가 동적으로 생성되게하기 위해 미세유체관 내 에 공압에 의해 선로의 생성 유무가 조절되는 맴브레인 형태 의 선로를 제작하였다.13 동적으로 생성될 수 있는 선로를 이 용하여 입자를 실시간으로 분류할 수 있으며, 마이크로입자 의 조립 등에서 사용할 수 있다.
이처럼 선로형태의 홈구조를 결합한 미세유체기술은 입 자의 경로를 유도하는 역할을 하기도 하지만, 그 선로구조를 이용하여 외부의 도움없이 입자들을 자체적으로 분류하는 기능을 가질 수 있다. 이를 위해 채널내에 두 갈래로 갈라지 는 선로구조와 한쪽 방향으로 경사진 형태의 입자의 전면부 디자인을 이용한다. 입자가 선로구조를 따라 이동하다가 두 갈래로 갈라지는 분지를 만나면 경로를 결정하게 되는데 입 자의 전면부의 경사진 방향에 따라 그 경로가 결정된다. 이러 한 방법으로 입자의 앞뒤 방향을 구분할 수 있다. 또한 입자 의 위아래 방향을 구분하기 위해서는 입자에 선로를 따라갈 수 있도록 하는 핀구조를 위 혹은 아래 한쪽 방향에만 존재 하게 하고, 이에 따라 입자의 위아래 방향에 따라 각기 다른 선로를 따라 이동하도록 하는 방식을 사용하여 입자의 위아 래도 구분할 수 있다.14 그림 2(C)는 4가지 형태의 앞뒤, 위아 래를 동시에 구분할 수 있는 채널 구조와 입자의 모양등을 설명하고 있고, 이에 따라 복잡한 형태의 미세블록들을 미세 유체관내에서 분류하여 조립된 모습을 보여주고 있다.
하이드로젤에 상자성나노입자를 혼합사용하여 자기장에 따라 균일하게 정렬된 나노입자를 포함하는 입자를 제작할 수 있다. 상자성 나노입자를 포함한 하이드로젤 입자들은 외 부 자기장에 의해 회전 및 제어가 가능하다. 단순히 세포가 자라는 기판으로서가 아니라, 기판인 입자를 회전 혹은 제어 하여 세포에 자극을 줄 수 있는 기능을 제공한다. 그림 3(A) 는 상자성 나노입자를 포함하는 하이드로젤이며, 내부에 1차 원의 상자성 나노입자 체인을 관찰할 수 있다. 자석의 회전을 통해 회전 자기장을 발생시키고, 그에 따라 입자들이 모두 함 께 회전하는 것을 확인하였다.15 한 방향으로의 움직임이 아 닌 다양한 방향으로의 움직임을 구현하기 위해서는 초기 하 이드로젤 입자를 생성할 때 상자성입자의 정렬 방향을 부분 별로 다르게 하여 일정한 자기장을 가했을시 정렬된 방향에 따라 다르게 움직이도록 할 수 있다. 하이드로젤 입자를 넘어
서 하나의 조직으로서 다른 운동방향을 가지는 생체구조로 모사가 가능할 수 있도록 응용될 수 있다. 그림 3(B)는 자기 장을 인가하기 전과 자기장을 가한 후 미리 형성된 상자성나 노입자의 정렬방향에 따라 입자가 자기장에 의해 다르게 힘 을 받는 모습을 보여주고 있다.16
3. 결론
입자기반의 에세이 플랫폼은 단순한 분자생물학 수준의 응용가능성을 넘어서 3차원 세포배양기술을 접목하여 새로 운 형태의 세포기반 에세이 플랫폼으로서 가능성을 보여주 고 있다. 많은 연구자들은 입자기술이 가지는 확장성과 기능 성등을 바탕으로 생체내의 여러 환경을 모사하려는 노력을 하고 있다. 최근에는 이러한 입자위에 나노구조를 포함하여 더욱 복잡하고 다양한 기능을 부여하기 위한 연구들이 진행 되어, 생체모사적인 3차원 세포배양 기술을 바탕으로한 새로 운 형태의 에세이 플랫폼 기술의 현실화에 한걸음 더 다가설 것으로 기대된다. 향후 입자기반의 3차원 세포배양 기술은 3 차원 세포배양 기술의 한 영역을 담당하여 조직공학, 세포생 물학, 신약개발 등에 큰 기여를 할 것으로 예상된다.
참고문헌
