DOI 10.17480/psk.2017.61.5.248
B16 흑색종세포에서 아라키돈산 유발 활성산소종의 멜라닌 합성 촉진 효과
이 용 수# 덕성여자대학교 약학대학
(Received September 15, 2017; Revised October 16, 2017; Accepted October 24, 2017)
Effects of Reactive Oxygen Species Induced by Arachidonic Acid on the Stimulation of Melanin Synthesis in B16 Melanoma Cells
Yong Soo Lee#
College of Pharmacy, Duksung Women's University, Seoul 01369, Korea
Abstract — Arachidonic acid (AA) increased production of reactive oxygen species (ROS) in B16 melanoma cells. The AA- induced ROS production and melanogenesis were significantly blocked by treatment with DPI and DIOA, specific inhibitors of NADPH oxidase and K+-Cl--cotransport (KCC), respectively. These results suggest that ROS production by the KCC- linked activation of the NADPH oxidase may play a role in the AA-induced melanogenesis.
Keywords arachidonic acid, melanogenesis, reactive oxygen species, NADPH oxidase, K+-Cl--cotransport, B16 mel- anoma cell
멜라닌은 피부의 구조 중 기저층에 존재하는 멜라닌세포 (melanocyte)의 소기관의 일종인 멜라닌소체(melanosome)에서 합성되며, 피부의 색을 결정하는 색소로 작용할 뿐만 아니라, 자 외선 조사나 독성 화학 물질 등의 물리·화학적 자극에 의한 피 부 손상을 방어하는 역할 등 다양한 기능을 가지고 있다.1)피부에 서 멜라닌 합성이 과도하게 일어나 과색소침착(hyperpigmentation) 이 되면 기미(melasma), 흑색점(lentigo), 모반세포모반(nevocellular nevi) 및 악성 흑색종(malignant melanoma) 등이 발생할 수 있 으며, 반대로 멜라닌세포의 기능이 상실되면 저색소침착 (hypopigmentation)이 일어나 백반증(vitiligo)을 유발할 수 있다.2) 건강한 피부를 유지하기 위해서는 멜라닌 합성이 적절한 수준으 로 조절되어 균형을 이루는 것이 필요하다.
멜라닌의 생합성은 여러 효소들에 의해 일어나는데 이 중 티 로시나제(tyrosinase)는 율속효소(rate-limiting enzyme)로 작용
하며 티로신에서 3,4-dihydroxyphenylalanine(DOPA)를 거쳐 DOPA quinone을 형성하는 반응에 관여한다.3)인과관계에 대한 분명한 증거는 없지만, 피부의 염증반응과 멜라닌 합성과는 서 로 관련이 있는 것 같으며, 염증반응이 저색소침착,4)또는 과색소 침착5)에 관여하고 있다는 상반된 연구결과가 발표된 바 있다. 염 증반응에 관여하는 phospholipase A26) 효소에 의해 형성되는 아 라키돈산(arachidonic acid)이 기니아픽 피부에서 멜라닌 합성을 촉진하고,7)또한 아라키돈산의 대사체도 멜라닌 합성을 유도하 는 티로시나제의 활성을 증가시킨다는 보고가 있다.8) 본 연구실 에서도 B16 흑색종 세포에서 아라키돈산이 멜라닌 합성 촉진 효 과를 가지고 있으며 이 작용에 칼륨-염소-수송체(K+-Cl-- cotransport, KCC)가 관여한다는 사실을 밝힌 바 있다.9)
아라키돈산은 사람 중성구 등 여러 종류의 세포에서 직접적으 로 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)을 발생시킨다.10,11) 활성산소종의 일종인 과산화수소는 멜라닌 합성을 촉진하고,12) 갈댓잎 물 추출물의 멜라닌 합성 억제효과는 활성산소종 생성을 방해하는 작용에 기인한다는13)보고도 있다. 따라서, 본 연구에 서는 B16 흑색종 세포에서 아라키돈산에 의한 멜라닌 합성 촉 진 작용이 활성산소종의 생성과 관련이 있을 것으로 가정하고 이 를 규명하고자 하였다.
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Corresponding Author Yong Soo Lee
College of Pharmacy, Duksung Women’s University, Seoul 01369, Korea
Tel.: 02-901-8396 Fax.: 02-901-8386
E-mail: [email protected]
Short Report
종설실험 방법 (Experimental methods)
시약
Arachidonic acid(AA), diphenylene iodonium(DPI), 각종 용 매 및 염류는 Sigma–Aldrich(미국)에서, R-(+)-[(2-n-butyl-6,7- dichloro-2-cyclopentyl-2,3-dihydro-1-oxo-1H-inden-5- yl)oxy]acetic acid(DIOA)는 BIOMOL Research Laboratories(미 국)에서, fetal bovine serum(FBS)와 penicillin-streptomycin 혼 합액은 GIBCO(미국)에서, 2',7'-dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA)는 Molecular Probes(미국)에서 구입하였다.
세포 배양
B16 흑색종 세포의 배양은 본 연구실에서 이미 보고한 방법과 동일하게 시행하였다.9) B16 흑색종 세포(서울대학교 한국세포주 은행)를 10% FBS와 penicillin 100 IU/mL와 streptomycin 50µg/mL을 함유한 DMEM 용액으로 37℃로 유지되는 5% CO2 배양기(Forma, 미국)에서 배양하였다.
세포내 활성산소종 측정
세포내 활성산소종은 DCFH-DA 형광분석법을 이용하여 측정 하였으며, 과거 본 실험실에서 보고한 논문에서 사용한 방법과 동 일하게 시행하였다.14) 세포를 두 번 세척하고 Hank 용액에 4 × 105 cells/mL 밀도로 현탁시킨 후 5 µM의 DCFH-DA를 가해 37oC에 서 2 시간 동안 진탕 배양하여 세포내로 봉입시켰다. 세포 현탁액 을 cuvette에 옮겨 485 nm 파장에서 excitation 시켜, 530 nm 파장 에서 나오는 형광을 형광분석기(Hitachi F4500, 일본)로 측정하였다.
멜라닌 정량
B16 세포에서 멜라닌 정량은 흡광도 분석법을 이용하여 측정 하였다.9) 간단히 설명하면, B16 세포에서 phenol red가 없는 DMEM을 사용하여 24 well plate에 mL 당 5 × 104 개로 분주하 고 12 시간이 지난 뒤 약물을 처리하고 48 시간 후 세포를 수집 하여 1200 rpm에서 5 분간 원심 분리하여 침전한 후, 1 mL 균 질완충액(50 mM sodium phosphate pH 6.5, 1% Triton X-100, 2 mM PMSF)으로 용해시켰다. 여기서 얻은 세포 pellet을 1 N NaOH, 10% DMSO 용액 200 µL를 첨가하고 vortex 후 멜라닌 을 완전히 녹인 다음 96 well plate에 옮긴 후 ELISA reader (Molecular Device, 미국)를 사용하여 405 nm에서 흡광도를 측 정하였다. 멜라닌 양은 표준품을 사용하여 그린 표준 검량선을 이용하여 산출한 후 단위세포(104개)에서의 생성량을 비교하여 백분율로 나타내었다.
자료 분석 및 통계적 검정
모든 실험은 네 번 실시하였으며, 실험 결과는 시험 약물이 빠
진 대조군과 비교한 백분율의 평균값±SEM으로 표시하였다. 실 험 결과의 통계 처리는 ANOVA로 먼저 분석한 후, 각 군끼리의 유의성 유무는 Student-Newman-Keul’s test를 이용하여 확인하 였다. P값이 0.05 이하인 경우에만 통계적으로 유의한 것으로 판 정하였다.
실험 결과 및 고찰 (Results and discussion)
아라키돈산에 의한 활성산소종의 생성과 NADPH oxidase의 역할
이전에 발표된 본 연구실의 논문에서 B16 흑색종 세포에 대 한 아라키돈산의 세포독성은 50 µM 이상의 농도에서 관찰되었 다.9)따라서 본 연구의 실험에서 아라키돈산은 세포 독성에 영
Fig. 1 − Effect of AA on the ROS production in B16 melanoma cells. The data (A) show changes in ROS levels as a function of time. The arrow shows the time point for addition of 5 µM AA. In the data (B) results are expressed as a percentage of negative control in which cells were grown in medium without AA. Data points represent the mean values of four replications with bars indicating SEM.
*
P<0.05 compared to negative control.
향이 없는 10 µM 이하의 농도로 사용하였다. B16 세포에서 아 라키돈산은 농도-의존적으로 활성산소종의 발생을 증가시켰다 (Fig. 1). 이전 발표된 논문에서 아라키돈산이 여러 종류의 세포 에서 활성산소종을 발생시킨다는 보고가 있었지만,10,11) B16 세 포에서는 아직까지 보고된 바가 없다.
세포 내에서 활성산소종의 생성은 미토콘드리아,15)혹은 세포 질에 존재하는 여러 효소16) 및 세포막에 존재하는 NADPH oxidase17)에 의해 유발될 수 있다.B16 세포에서 NADPH oxidase 가 존재한다는 사실이 확인되었고,18)또한 이 효소가 활성산소종 의 발생에 중요한 역할을 한다는 사실이 밝혀졌으며,14)특히 아 라키돈산의 세포작용이 NADPH oxidase에 의해 매개된다는 보 고도 있으므로,19) 본 연구의 Fig. 1에서 확인된 아라키돈산에 의 한 활성산소종의 발생이 NADPH oxidase에 의해 매개되는 지를 다음 실험에서 조사하였다. NADPH oxidase의 활성을 선택적으 로 억제한다고 알려진 DPI20)를 처리한 결과 용량-의존적으로 아
라키돈산에 의한 활성산소종의 발생이 감소되었다(Fig. 2). 이 실 험 결과는 아라키돈산에 의한 활성산소종의 발생이 NADPH oxidase에 의해 매개된다는 사실을 시사한다.
아라키돈산에 의한 멜라닌 생성 촉진 효과에 미치는 NADPH oxidase의 역할
다음으로 이전 연구에서 밝혀진 아라키돈산의 멜라닌 합성 촉 진 효과9)에 미치는 NADPH oxidase의 역할을 조사하였다. 실험 결과를 보면 DPI를 전처리하였을 때 아라키돈산에 의한 멜라닌 생성은 가해진 DPI의 농도에 의존적으로 억제되었다(Fig. 3). 이 결과는 NADPH oxidase가 아라키돈산에 의한 멜라닌 합성기전 에 연루되어 있다는 사실을 의미한다. 멜라닌 합성에 대한 NADPH oxidase의 영향에 대한 연구 결과를 보면, 멜라닌 합성 을 촉진하거나,14,21)또는 억제하는22,23)서로 상반된 결과들이 발 표되었다. 이러한 서로 반대되는 결과의 이유에 대해서는 현재 로선 명확히 알 수 없으며 실험에 사용된 세포주 또는 세포배양 액 등의 차이에 기인할 가능성을 추측해 볼 수 있지만, 정확한 원인을 밝히기 위해서는 향후 좀 더 체계적인 연구가 필요할 것 으로 사료된다.
멜라닌 합성은 복잡한 신호 전달 경로를 통하여 일어나며, 멜 라닌 합성에 중요한 효소인 티로시나제의 활성에 관여하는 신호 로서 cAMP24)와 산화질소(nitric oxide)25) 등이 알려져 있다. 아 직까지 NADPH oxidase와 티로시나제의 활성 및 이를 조절하는
Fig. 2 − Effects of DPI on the AA-induced ROS production in B16 melanoma cells. Data presentation is the same as Fig. 1. In these experiments DPI, an inhibitor of the NADPH oxidase, was given 10 min before 10 µM AA application. In the figure (A) 50 µM DPI was used.
*P<0.05 compared to negative control.
#P<0.05 compared to AA alone.
Fig. 3 − Effects of DPI on the AA-induced stimulation of melanin
synthesis in B16 melanoma cells. In these experiments
10 µM AA was used. Each column represents the mean
value of four replications with bars indicating SEM.
*P<0.05
compared to negative control.
#P<0.05 compared to AA
alone.
신호들과의 관련성이 명확히 밝혀진 것은 없으나, 이와 관련된 연구를 보면 NADPH oxidase가 식도선암세포에서는 cAMP의 하위신호인 cAMP-response element-binding protein(CREB)과 연관되어 있고,26)내피세포에서는 산화질소 생성기전에 관련이 있다는 사실이27)보고되었다.
아라키돈산의 신호체계로서 NADPH oxisase와 칼륨-염소-수 송체와의 관계
B16 세포에서 아라키돈산에 의한 멜라닌 합성 촉진 작용이 칼 륨-염소-수송체 의 활성화를 통해서 일어난다는 사실을 확인한 바 있으므로,9)본 연구에서는 아라키돈산의 신호체계로서 NADPH oxidase와 칼륨-염소-수송체와의 연관성을 조사하였다. 실험에서 칼륨-염소-수송체의 활성을 선택적으로 억제한다고 알려진 DIOA28) 를 처리 한 결과, 아라키돈산에 의한 활성산소종의 발생(Fig. 4)
및 멜라닌 합성 촉진 작용(Fig. 5)은 가해진 DIOA의 농도에 의 존적으로 억제되었다. 이 결과를 종합해 보면 아라키돈산에 의 한 멜라닌 합성 촉진 작용은 NADPH oxidase에 의해 생성된 활 성산소종에 의해 유도되며, 또한 NADPH oxidase의 활성화는 칼륨-염소-수송체에 의해 매개될 것으로 사료된다. 다른 연구에 서도 NADPH oxidase와 칼륨-염소-수송체와의 상호 관련성이 중
Fig. 4 − Effects of DIOA on the AA-induced ROS production in B16
melanoma cells. Experimental design and data presentation are the same as Fig. 2. In these experiments DIOA, a KCC inhibitor, was given 10 min before 10
µM AA application. In the figure (A) 100
µM DIOA was used.
*P<0.05 compared to negative control.
#P<0.05 compared to AA alone.
Fig. 5 − Effects of DIOA on the AA-induced stimulation of melanin synthesis in B16 melanoma cells. These experiments were done by the same protocol as used in Fig. 3.
*P<0.05 compared to negative control.
#P<0.05 compared to AA alone.
Fig. 6 − Proposed role of the NADPH oxidase in the mechanism of
AA-induced melanogenesis in B16 melanoma cells. In the
diagram the arrows represent induction of activation of
the next event.
성구29) 세포와 간암세포30)등에서 보고된 바 있다. 아직까지 칼 륨-염소-수송체에 의한 NADPH oxidase 활성 조절에 대한 기전 에 대해서는 별로 많이 알려져 있지 않지만, 칼륨-염소-수송체가 세포내 칼륨과 염소이온의 농도 변화를 초래하는 것은 분명하므 로, 이러한 이온들의 농도 변화가 NADPH oxidase의 활성을 조 절할 수 있다는 가능성을 생각할 수 있다. 실제로, NADPH oxidase의 활성에 칼륨이온이 연관되어 있다는 사실이 혈관31), 신 경32)및 상피세포33)에서 보고된 바 있다. 하지만 NADPH oxidase 의 활성에 관련된 칼륨-염소-수송체의 역할에 대한 분명한 기전 을 밝히기 위해서는 추가적인 연구가 필요하다고 생각된다.
결 론 (Conclusion)
본 연구에서는 이전 연구에서 보여준 아라키돈산에 의한 멜라 닌 합성 촉진 작용이 NADPH oxidase에 의해 생성된 활성산소 종에 의해 매개되는 지를 알아보고자 하였다. B16 세포에서 아 라키돈산은 농도-의존적으로 활성산소종의 발생을 증가시켰으며 (Fig. 1), 이 효과는 NADPH oxidase에 대해 선택적 억제제로 작 용하는 DPI에 의해 농도-의존적으로 감소되었고(Fig. 2), 또한 DPI는 농도-의존적으로 아라키돈산에 의한 멜라닌 합성도 억제 하였다(Fig.3). 칼륨-염소-수송체에 대해 선택적 억제제로 작용하 는 DIOA는 아라키돈산에 의한 활성산소종의 생성(Fig. 4) 및 멜 라닌 합성 촉진 작용(Fig. 5)을 농도-의존적으로 차단하였다. 종 합적으로, 이 결과는 아라키돈산에 의한 멜라닌 합성 촉진 작용 이 다음과 같은 순서로 일어난다는 사실을 시사한다: 칼륨-염소 -수송체의 활성화 → NADPH oxidase의 활성화 → 활성산소종 의 발생 → 멜라닌 합성 촉진(Fig. 6). 본 연구의 결과로써 활성 산소종을 발생시키는 NADPH oxidase가 멜라닌 합성과 연관된 피부 색소 질환의 병인과 치료제의 개발 연구에 유용한 표적 분 자로 충분한 가치를 지니고 있다고 생각된다.
감사의 말씀 (Acknowledgement)
본 연구는 덕성여자대학교 2017년도 교내연구비 지원에 의해 수행되었음.
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