22(3)-253-262-2009] Streptococcus parauberis 인위 감염에 의한 넙치, Paralichthys olivaceus 심장의 병리학적 변화

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�Corresponding Author :

연쇄구균증은 전세계적으로 담수와 해수의 다 양한 어류에서 발병하며 (Ghittino et al., 2003), 주요 원인체로는 Lactococcus garvieae, Strpeto- coccus iniae 및 S. parauberis 등이 알려져 있다 (Toranzo et al., 2005). 이 중 L. garvieae와 S. iniae 는 어류 연쇄구균증의 원인체로 널리 알려져 있 어, 발병사례 (Kusuda et al., 1991; Perera et al., 1994), 분자생물학적 분석 (Eldar et al., 1997;

Eldar et al., 1999) 및 백신 (Klesius et al., 2000;

Vendrell et al., 2007) 등에 관한 다양한 연구가 이루어져 있다. S. parauberis는 1996년 스페인 Galicia 지역의 turbot Scophthalmus maximus에서 처음으로 분리되었으며 (Domenech et al., 1996) 주로 여름철 고수온기에 발병해 많은 폐사를 유 발하는 것으로 보고되고 있다.

우리나라에서도 오래전부터 L. garvieae 및 S.

iniae가 넙치 연쇄구균증의 주요 원인균으로 지 목되어 왔으며 (이 등 2001; 김과 김, 2003), 이들

Streptococcus parauberis 인위 감염에 의한 넙치, Paralichthys olivaceus 심장의 병리학적 변화

김진우∙조미영∙원경미∙김병관∙최희정

∙한명철

∙박명애

국립수산과학원 수산동물방역센터,

국립수산과학원 병리연구과,

한화 63시티

Pathological changes of the heart of olive flounder Paralichthys olivaceus in experimental Streptococcus parauberis infection

Jin Woo Kim, Mi Young Cho, Kyoung Mi Won, Byoung Gwan Kim, Hee Jung Choi

, Myoung Chul Han

and Myoung Ae Park

Aquatic Animal Disease Control Center, National Fisheries Research and Development Institute, Busan 619-900, Korea

�

Pathology Division, National Fisheries Research and Development Institute, Busan 619-900, Korea

��

Seaworld Team, Hanwha 63 City, Seoul 150-763, Korea

We conducted bacteriological and histopathological analysis for olive flounder Paralichthys olivaceus after experimental infection with Streptococcus parauberis (FP2284) isolated from diseased olive flounder under different stress conditions. Experimental challenge was performed in healthy flounder (40.4 g in aver- age body weight) by intraperitoneal (i.p.) injection with 2×10

CFU/fish under normal (no stress) or netting (for 2 min, twice/day) stress condition. The cumulative mortalities of no-stress and netting stress group were 70% and 95%, respectively. The most prevalent changes observed in experimentally infected flounder were darkness of skin and inflammation of the heart. Severe pericarditis, myocarditis and fibrosis were observed in the heart of the affected flounder. The results of viable counts showed the number of bacteria of the heart tissue was maintained over the 10

CFU∙g

heart for 3 weeks after inoculation. Histological lesions of the heart was more extensive and gradual decrease in bacterial numbers of heart tissue was delayed under stress condition.

Key Words: Streptococcus parauberis, Histological changes, Heart, Pericarditis, Olive flounder

�Corresponding Author : Myoung Ae Park, Tel : 051-720-2470 Fax : 051-720-2498, E-mail : [email protected]

7...

병원체에 대한 다양한 연구가 이루어져 있다 (김 등, 2005; 우 등, 2006). 그러나 최근 S.

parauberis의 검출 빈도가 뚜렷하게 증가하고 있으나 (정 등, 2006; 강 등, 2007; 조 등, 2007), 분리 균의 병원성에 대한 연구는 매우 제한적으 로 이에 대한 연구의 필요성이 대두되고 있다.

S. parauberis에 의한 연쇄구균증에 대한 대책 을 위해서는 병원체의 특성 및 분포, 질병의 발 생동향, 어종별∙환경 조건별 병원성 차이, 감염 어의 병리학적 특성 등에 관한 전반적인 연구 가 요구되고 있으나, 현재까지의 연구는 S.

parauberis의 분자생물학적 특성 (Romalde et al., 1999; 이 등, 2007), 동정방법 (조 등, 2007) 및 발 생 동향 (정 등, 2006)에 관한 연구에 집중되어 있다. 또한, 병원성 및 감염어의 병리학적 관찰 에 관한 연구도 S. parauberis에 의한 넙치의 만 성 감염 (이 등, 2007)과 강도다리에서 감수성을 확인한 보고 (조 등, 2008)가 있을 뿐이고, 환경 조건에 따른 병원성의 차이와 주요 감염 부위 등 질병의 예방과 치료에 필요한 병태∙생리학 적 특성에 대한 연구는 매우 드문 실정이다.

본 연구에서는 양식 넙치에서 분리한 S.

parauberis를 건강한 넙치에 인위감염시킨 후 병 원성을 확인하고, 감염어의 증상을 관찰하여 주 요 감염 장기로 추정되는 심장의 병리조직학적 관찰과 심장 조직 내의 세균수 변화를 조사하여 원인균의 병리학적 특성을 규명하고자 하였다.

재료 및 방법

시험균주

시험균은 2005년 체색흑화, 안구의 돌출 및 백 탁, 복수, 장출혈 등의 증상을 나타내는 넙치에 서 분리된 S. parauberis FP2284 (조 등, 2007)를 사용하였다. 시험균주는 BHIA (Difco) 배지에서 30℃, 36 시간 배양하여 생리식염수로 현탁하여 2×10

cfu/㎖의 농도로 조정한 후, 넙치에 0.1 ㎖ 씩 복강주사하였다.

시험어 및 병원성 시험

병원성 시험에 사용된 넙치는 부산시 기장 소 재의 육상수조식 양어장으로부터 외관상 질병 의 징후를 나타내지 않은 건강한 넙치 (평균 어 체중 40.4 g)를 공급받아 사용하였다. 인위감염 시험은 스트레스에 따른 영향을 분석하기위해 Table 1과 같이 설계하였으며, 인위적인 스트레 스는 Caruso et al. (2002)의 방법을 변형하여 1일 2회, 뜰채로 넙치를 떠서 수면 상에 2분간 정치 시키는 방법 (Netting stress)을 사용하였다. 대조 구는 스트레스 조건 (Trial 1)과 비스트레스 조건 (Trial 2)으로 나누어 생리식염수를 복강 주사한 것이고, 시험구는 스트레스 조건 (Trial 3)과 스트 레스를 주지 않은 조건 (Trial 4)으로 나누어 S.

parauberis를 2×10

CFU/fish로 복강주사 하였 다. 각각의 Trial은 다시 두 구간으로 나누어, 한

Trials Stress conditions Challenge dose

(bacteria/fish) No. of Fish Object

1 Netting

No 20 Observation of mortality

80 Bacteria counts & Histological test

2 No No 20 Observation of mortality

80 Bacteria counts & Histological test

3 Netting 2×10

CFU 20 Observation of mortality

80 Bacteria counts & Histological test

4 No 2×10

CFU 20 Observation of mortality

80 Bacteria counts & Histological test

*, Net for 2 min, twice/day

쪽은 넙치를 20마리씩 수용하여 주사 3주째까 지 누적폐사율과 증상을 관찰하였고, 다른 한쪽 은 넙치를 80마리씩 수용하여 시간대별로 넙치 의 병리조직학적 검사와 세균수 조사에 사용하 였다. 시험어는 40 ℓ수조에 수용하여 수온을 22

± 1℃로 유지하면서 유수식으로 관리하였다.

사료는 실험기간동안 공급하지 않았다.

감염된 넙치에서 재분리된 S. parauberis의 분자생물 학적 검증

감염된 넙치에서 재분리된 S. parauberis가 주 사한 종과 동일한지를 확인하기 위해, 폐사어 및 조직내 세균수 조사에서 순수분리된 colony를 Gram 염색하여 균의 형태를 확인한 후, Mata et al. (2004)의 방법에 따라 Multiplex PCR을 수행 하였다. 순수분리된 colony의 genomic DNA 추출 은 시판되고 있는 High pure PCR Templet prepara- tion kit (Roche, Germany)를 사용하여 분리한 후, DNA elution buffer 100 ㎕에 녹여 사용하기 전까 지 -20 ℃에 보관하였다. PCR primer는 Spa2152 (5'-TTTCGTCTGAGGCAATGTTG-3')와 Spa2870 (5'-GCTTCATATATCGCTATACT-3')을 사용하였 으며, Accupower PCR premix (Bionner, Korea)로 PCR 반응을 하였다. PCR 반응조건은 predenatu- ration (94℃, 5분) 한 후, denaturation (95℃, 30초), annealing (55℃, 30초), extension (72℃, 30초)의 과 정을 30 cycles로 반복하고 final extension (72℃, 5 분)을 하였다. PCR 생성물은 0.5 ㎍/㎖ EtBr이 첨 가된 1 % agarose gel 상에서 전기영동한 후, image system (GB/GeneGenius Super 12, SynGene) 으로 718 bp의 최종생성물을 확인하였다.

병리조직학적 검사

넙치에 S. parauberis를 주사한 후, 1, 2, 3 및 6 주째에 각 장기에 대한 육안 검사를 실시하고 병리조직학적 검사에 필요한 장기를 적출하였 다. Bouin's solution에 전고정하고 24 시간 후 각 장기를 세절한 다음 동일 고정액에 후고정하였 다. 고정이 완료된 후, 70%에서 100%까지 순차

농도의 에탄올 수용액에 탈수하고 xylene으로 투명화하여 파라핀을 침투시켜 포매하였다.

Rotary형 microtome (Richert-Jung 820, Leica)으 로 4�5 ㎛ 두께의 박편을 제작하여 Harris' hematoxyline-eosin (HE) 염색하여 광학현미경 (BX50F4, Olympus)하에서 관찰하였다.

넙치 심장 조직내의 세균수 조사

S. parauberis에 인위감염된 넙치를 0, 1, 3, 6, 12, 24 시간 및 3, 7, 14, 21 일째에 각 구간마다 3마리 씩 무균적으로 해부하였다. 적취한 심장은 표면 을 알콜솜으로 소독한 후, 0.1 g당 100 ㎕의 PBS 를 넣어 pestle motor로 균질화하여 이를 10배수 단계희석하고 BHIA 배지에 drop하여, Collins and Lyne (1976)의 방법에 따라 생균수를 측정하였다.

결 과

넙치에 대한 S. parauberis의 병원성

스트레스 유∙무에 따른 S. parauberis의 병원 성을 확인한 결과, 스트레스를 받은 넙치에서 인 위감염 3주 후의 누적폐사율이 90%로 가장 높 게 나타났으며 (Trial 3), 스트레스를 받지 않은

Fig. 1. Cumulative mortality of olive flounder Paralichthys

×10

CFU/fish) under normal condition

(Trial 2 and 4) and stress condition (Trial 1 and 3) induced

by netting for 2 min, twice/day. Trial 1 and 2, injected with

saline; Trial 3 and 4, injected with S. parauberis.

넙치 (Trial 4)는 75%를 나타내었다 (Fig. 1). 이에 비해 생리식염수를 주사한 구간에서는 스트레 스를 받은 넙치가 10%의 누적폐사율을 나타내 었으나 (Trial 1), 스트레스를 받지 않은 넙치 (Trial 2)는 폐사가 일어나지 않았다 (Fig. 1). 따 라서 본 시험에 사용한 S. parauberis FP2284는 넙치에 병원성을 가지는 것으로 확인되었으며, 스트레스를 받은 경우 감수성이 더 커지는 것으 로 나타났다.

S. parauberis 인위감염에 의한 넙치의 증상 및 심장 의 병리조직학적 변화

감염된 병어에서 외관상 체색흑화 이외의 특 징적인 증상은 관찰되지 않았다. 해부소견으로는

심장에 염증 소견이 다수 관찰되었으며 (Fig. 2), 일부 개체에서는 맑은 복수 저류 및 간충혈 증 상도 관찰되었다. 그러나 간 충혈 증상은 대조구 의 넙치에서도 종종 관찰되었다.

S. parauberis의 주요 감염 장기로 추정되는 심 장의 병리조직학적 변화를 1, 2, 3, 6주째에 관찰 하여 Fig. 3에 나타내었다. S. parauberis에 감염 된 넙치는 1주째부터 심외막염이 나타나기 시작 하여 3주째까지 심해지다가 6주째에는 회복되 면서 심외막염이 완화되는 경향을 보였다. 시험 구별 비교에서는 스트레스를 받은 넙치 (Fig. 3, C)의 심외막염이 스트레스를 받지 않은 넙치 (Fig. 3, B)보다 더 심하게 나타났으며, 심근에서 백혈구계 세포침윤이 일어나 심근염이 나타났

Fig. 2. Gross findings of the heart surface of olive flounder Paralichthys olivaceus in experimental infection with Streptococ-

CFU/fish). Note the moderate (A and B) and sever (C and D) inflammation of the heart surface

(Arrows).

으며, 심근의 섬유화로 진행된 개체도 관찰되었 다 (Fig. 3, 3W-C). 이에 비해, 대조구의 넙치는 정상적인 심장 소견을 보였으며, 대조구 내에서 스트레스 유∙무 (Trial 1 and 2)에 따른 심장조직 의 변화는 관찰되지 않아 스트레스를 준 후 생 리식염수를 주사한 넙치 (Trial 1)의 결과만을 나

타내었다 (Fig. 3, A).

S. parauberis 인위감염에 의한 넙치 심장 내의 세균 수 변화

S. parauberis를 인위감염 시킨 넙치의 심장을 0, 1, 3, 6, 12, 24 시간 및 3, 7, 14, 21 일째에 무균

Fig. 3. Histological changes in the heart of olive flounder Paralichthys olivaceus at 1 (1W), 2 (2W), 3 (3W) and 6 weeks

(6W) caused by Streptococcus parauberis. A, control group; B, no stress group; C, stress group by netting for 2 min,

twice/day. H&E, ×200.

적으로 해부하여 세균수를 측정하였다. 그 결과, 스트레스를 받은 넙치 (Trial 3)는 7일째까지 세 균수가 증가하다가 감소하였고 스트레스를 받 지 않은 넙치 (Trial 4)는 3일째까지 증가하다가 감소하였으며, 시험 종료시 (21일째)에는 두 구 간의 세균수 차이가 현저히 나타났다 (Fig. 4).

그러나 주사 후 21일째까지 심장 g 당 10

CFU 이상의 S. parauberis가 심장에서 검출되었다.

Trial 1과 2 (대조구)의 넙치에서도 주사 후 1, 2, 3주째에 동일한 방법으로 세균수를 조사하였으 나, 검출한계 이하로 나타났다. 분리된 모든 세 균은 Mata et al. (2004)의 방법에 따라 Multiplex PCR을 수행한 후 S. parauberis 특이 band인 718 bp의 최종 생성물을 확인하였다 (data not shown).

고 찰

최근 우리나라 양식 넙치에서 발생하는 연쇄 구균증은 기존의 L. garvieae 및 S. iniae에 의한 감염보다 S. parauberis에 의한 감염이 증가하고 있다. 본 연구에서도 넙치에 S. parauberis (FP2284)를 2×10

CFU/fish로 복강주사한 후 3 주 동안 관찰한 결과, 70%의 누적폐사율이 나타 났으며, 이러한 누적폐사율은 하루 2회, 2분간

netting 스트레스를 가한 경우 95%까지 증가하 는 것으로 나타나, S. parauberis 자체의 독성뿐 아니라 외부에서 가해지는 스트레스의 영향을 크게 받는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 어 류의 방어력을 저하시키는 스트레스 요인이 연 쇄구균증의 발병에 주요한 영향을 미친다는 보 고 (Plumb, 1994)와 건강한 어류에는 질병을 야 기하지 않고, 체표 상처와 같은 병원체 침입 관 문이 형성될 경우에만 발병된다는 보고 (Rasheed and Plumb, 1984)와도 일치한다.

S. parauberis가 어류 병원체로서 처음 보고된 turbot에서는 심한 안구돌출, 화농성 복수에 의 한 복수팽만, 안구∙비장∙신장∙뇌의 염증 반 응 등이 특징적이며, 모든 장기에 전신적인 병변 을 야기하는 전신 감염형과 안구 및 안구주변의 화농성 국소 염증을 야기하는 국소 감염형으로 나뉜다 (Nieto et al., 1995). Domenech et al. (1996) 도 이 균에 감염된 양식 turbot에서 출혈 및 농 양을 동반한 안구돌출과 복부 또는 복벽의 점상 출혈, 그리고 비장과 신장의 점액성 출혈을 보고 한 바 있다. S. parauberis에 감염된 강도다리는 안구돌출, 안구 주위 농양 및 출혈, 주둥이 주위 출혈, 복부팽만 등의 외부 증상과 간의 충혈 및 울혈 등의 내부 증상이 관찰되어 turbot의 증상 과 매우 유사하다고 보고되었다 (조 등, 2008). S.

parauberis에 감염된 넙치의 증상은 연구자에 따라 보다 다양하게 보고되고 있다. 정 등 (2006)은 S. parauberis에 의한 감염 증상으로 체 색흑화, 복강 내벽 및 무안측의 출혈, 안구돌출 및 안구출혈 등을 보고하였으며, 강 등 (2007)은 체색흑화, 안구출혈, 복벽 출혈 및 아가미 뚜껑 의 출혈 등을 보고하였다. Kim et al. (2006)은 인 위감염 시킨 넙치의 증상으로 주둥이와 안구 및 가슴지느러미 주변의 출혈, 간 비대와 탄력 소 실, 복강의 복수를 보고하였다. 이에 비해 이 등 (2007)은 넙치에 S. parauberis를 인위감염 시킨 후 증상을 관찰한 결과, 체색 흑화 외의 특이적 인 증상이 관찰되지 않았다고 보고하였다. 본 연 구에서는 대조구에서도 종종 나타나는 간의 울 Fig. 4. Changes of bacterial counts in the heart of olive

flounder Paralichthys olivaceus after intraperitoneal infec-

tion with Streptococcus parauberis (2 ×10

CFU/fish)

under normal condition (Tiral 4) and stress condition (Trial

3) induced by netting for 2 min, twice/day.

혈 증상과 감염어의 극히 일부에서 나타난 복수 저류를 제외하고, 감염어에서 전반적으로 나타 난 체색흑화와 심외막의 염증을 S. parauberis 감 염에 의한 넙치의 주요 증상으로 판단하였다.

S. parauberis에 감염된 넙치의 조직학적 변화 를 1, 2, 3, 6주째에 관찰한 결과, 심외막염이 전 형적으로 나타났으며 증상이 심해지면서 심근 염 및 심근의 섬유화로 진행되었다. 뇌의 병변은 관찰되지 않았으며, 비장 협조직의 비후가 나타 났으나 대조구에서도 동일한 소견이 종종 관찰 되어 S. parauberis에 의한 전형적인 조직학적 변화에 포함시키지 않았다. 이와 달리, S. iniae와 L. garvieae에 감염된 무지개 송어의 주요 조직 학적 변화는 전자에서 뇌수막염과 전 (全) 안구 염, 후자에서 초급성 전신감염으로 나타났고 (Eldar and Ghittino, 1999), S. iniae에 감염된 hybrid tilapia에서는 안구의 세포 침윤, 뇌수막염 및 신장의 대량 세포 침윤이 관찰되었으며 일부 개체의 심장에서 심막염과 심근염이 보고되었 다 (Perera et al., 1998). S. parauberis 감염된 강도 다리에서 나타난 조직학적 변화로 간조직 전체 의 심한 괴사, 염증 반응 및 농양형성, 세균을 식 작용한 백혈구계 세포와 괴사 세포의 군집이 간 조직 전반에서 관찰되었으며 비장 조직과 신장 조직 전체에 균체 침윤과 식세포 및 백혈구계 세포의 괴사가 관찰되었다 (조 등, 2008). 특히 심장의 심외막에 심한 염증성 병변이 관찰되었 고, 심근에서도 백혈구계 세포 침윤이 관찰되어, 어종이 다르기는 하나 본 연구의 결과와 매우 유사하였다. 지금까지 넙치에서 S. parauberis 감 염에 의한 넙치의 조직 변화에 관한 연구는 거 의 없는 실정이어서, 심외막염과 심근염을 S.

parauberis에 의한 넙치의 주요 조직학적 소견 으로 규정지은 본 연구는 매우 의미 있는 결과 라고 생각된다.

S. parauberis의 병원성 기작에 대한 기초 조 사로 인위감염 시킨 후 넙치 체내 세균수의 변 화를 조사한 결과, 시험구별로 차이가 있었으 나 주사 후 3일 내지 7일 정도까지 증가하다가

감소하는 경향을 보였다. 그러나 주사 3주후까 지 심장 g당 10

CFU 이상으로 세균수가 유지 되는 것으로 보아, 심장에서 장기간동안 생존 가능하며 이러한 장기간의 생존이 S. iniae 혹은 L. garvieae에서 나타나는 급성감염과는 달리 S.

parauberis에서 나타나는 만성감염과 관련이 있 을 것으로 추정된다. 현재까지 숙주조직 내에서 의 장기간의 생존을 가능하게 하는 기작에 대해 서 밝혀진 바가 거의 없다. S. parauberis의 세균 표면 바깥쪽에 존재하는 capsule이 식작용과 혈 청 살균능에 강한 저항성을 가진다는 보고 (황 등, 2008)가 있어, 이러한 capsule이 숙주 체내에 서의 생존과 관련이 있을 것으로 생각된다. 감염 후 어체 내 세균수를 조사한 연구로, Streptococ- cus sp.에 침지 감염된 gulf killifish (Fundulus grandis)의 비장과 간에서의 세균수가 3일째에 최고치를 보이고 4일째에는 감소하였으며 이는 4일째를 전후로 많은 폐사가 일어난 결과와 상 응한다는 보고가 있다 (Rasheed and Plumb, 1984). 한편, Kimura and Kusuda (1979)는 방어에 Streptococcus sp.를 인위감염시킨 후, 신장, 비장, 간, 장, 혈액 중의 세균수를 조사한 결과, 주사 직 후부터 세균수가 감소하였다. 그러나 주사한 균 주의 어체 통과 횟수를 늘리거나 extracellular products를 사전에 주사한 후 인위감염시키는 방법을 통해 세균수의 감소가 지연되거나 증가 하는 것으로 나타났다. 이는 병원체의 병원성은 다양한 조건에 의해 영향을 받을 수 있음을 의 미하며, 본 연구에서 스트레스를 받은 넙치의 심 장에 더 많은 세균이 더 오랫동안 유지되는 것 으로 나타나 숙주의 상태에 따라 어체 내에서의 증식이 영향을 받을 수 있는 것이 확인된 것과 일치한다.

본 연구 결과, S. parauberis는 넙치에 병원성을

가지며 이러한 병원성은 양식장 환경에서 주어

지는 다양한 스트레스 조건하에서 더 강해지는

것으로 나타났다. 감염어에서는 체색흑화와 심장

의 염증이 주요 증상으로 관찰되었으며 조직학

적 관찰에서는 심외막염과 심근염이 두드러지게

나타났다. 또한 감염 이후 시간이 경과할수록 심 장 내에서의 세균수가 감소하였으나 3주후에도 높은 수치가 유지되는 것으로 보아, 본 원인균이 심장에서 증식 및 생존 가능한 병원성 기작을 통해 만성 감염을 유발하는 것으로 추정되며, 이 를 토대로 향후 S. parauberis의 병원성 기작에 관한 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.

요 약

병든 넙치에서 분리한 Streptococcus parau- beris (FP2284)를 스트레스 조건을 달리하여 넙 치, Paralichthys olivaceus에 인위감염한 후 조직 내 생균수 변화 및 병리조직학적 변화를 분석하 였다. 인위감염 실험은 건강한 넙치 (평균 어체 중 40.4 g)에 2×10

CFU/fish 농도로 복강주사하 고 스트레스를 주지 않거나 하루 2번, 2분간 Netting 스트레스를 처리하였다. 스트레스를 주 지 않은 그룹과 Netting 스트레스를 준 그룹의 누적 폐사율은 각각 70% 및 95%로 나타났다.

인위감염 시킨 넙치에서는 체색흑화와 심장의 염증이 주요 임상소견으로 나타났으며, 심장에 서는 주로 심외막염, 심근염 및 심근의 섬유화가 관찰되었다. 인위감염 후 심장 조직의 세균수 변 화를 측정한 결과, 주사 후 3주째까지 심장 1 g 당 10

CFU의 세균수가 유지되는 것으로 나타 났다. 스트레스 조건하에서 심장에서의 병리조 직학적 변화가 더 심한 것으로 나타났으며, 심장 조직내 세균의 점차적인 감소가 지연되는 것으 로 나타났다.

감사의 글

본 연구는 국립수산과학원 (양식생물 백신 연 구, RP-2009-AQ-075)의 지원에 의해 운영되었 습니다.

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Manuscript Received : October 30, 2009

Revised : December 2, 2009

Accepted : December 11, 2009