연구범위 및 연구수행 방법

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대장암 발생과정에서 Prostaglandin의 조절기전 규명 및 암 예방약제의 반응성 표지자로 15-hydroxyprostaglandin

dehydrogenase의 역할

울산대학교 의과대학 내과학교실

명 승 재

서 론

과제는 인체에서 대장암 병기의 각 단계에서 PGs (pro- staglandins)의 합성과 대사에 영향을 미치는 유전자들, COX-2, 15-PGDH (15-prostaglandin dehydrogenase), mPGES (prostaglandin synthase)의 변화를 관찰하고 그 대사산물이며 암 발생에 중 요한 역할을 하는 PGE2 (prostaglandin E2)의 발현을 측정하여 대장암 발생과정에서 PGs 조절 기전을 탐색하고자 하였다.

또한 중요한 대장암 종양억제유전자인 15-PGDH를 임상에 서 응용하기 위하여 이 유전자 발현 유무에 따른 암 예방 약 제의 반응성을 검토하여 15-PGDH의 생물표지자로서의 가 능성을 증명하여 향후 임상실험 및 연구에 필요한 기초 자 료를 확보하고자 하였다.

연구범위 및 연구수행 방법

1. 대장 조직에서 RNA분리와 real-time PCR로

15-PGDH와 COX-2 mRNA 발현측정

대장 조직에서 total RNA를 RNeasy Mini kit (Qiagen)을 이 용하여 추출한다. 이렇게 얻어진 RNA는 분광계를 통해 260 nm의 흡광도에서 농도를 측정하고, 260 nm/280 nm의 값이 1.7~2.0임을 확인한 후 0.8%의 agarose gel에서 전기영동한 후 ethidium bromide를 사용하여 RNA를 확인한다. Oligo dT primer와 AMV reverse transcriptase (ABI Applied Biosystems) 를 이용하여 cDNA를 합성한다. Real-time PCR은 human 15-PGDH TaqMan Probe/Primer kit, human COX-2 (cyclooxygenase-2) TaqMan Probe/Primer kit 그리고 the human ACTB TaqMan primer/probe kit (Applied Biosystems)을 사용하여 Applied Biosystem^® 7500 Real-time PCR systems로 수행하였다. RNA의 정량은 15-PGDH or COX-2/β-actin=2 exp (CTβ-actin-CT 15-PGDH) 로 측정한다.

2. 병리조직학적 분석(Histopathologic analysis) 조직의 일정부분을 중성 완충 포름알데히드(10% neutral buffered formalin, NBF) 고정액에서 24시간 동안 고정한 후, 일정한 수세 및 통상적인 방법에 따라 알콜 탈수과정을 거 쳐 파라핀으로 포매한다. 포매된 colon 조직은 박절편기를 이용하여 4 μm 두께의 연속절편을 작성하여 hematoxylin-eosin (H-E) 염색을 시행한 다음 permount로 봉입하여 영구표본을 작성한 뒤, 병리 조직학적 분석을 수행한다.

3. mPGES-1의 단백질 발현 측정(Western blot analysis) 조직을 분석 직전까지 -80℃ 냉동고에 보관한다. 냉동된 colon 조직을 차가운 cell lysis buffer (cell signaling) 100 μL에 넣고 homogenizer로 균질화한 후, 원심분리하여(4℃, 10,000 g, 30분) 상층을 준비한다. 균질화된 대장 조직에서 용출된 단 백질을 정량 후, 30~50 μg의 whole lysate 단백질을 SDS- polyacrylamide gel에 전기영동시킨 후 PVDF paper에 electro- blotting한다. 각각의 항체들을 포함하는 solution으로 반응시 킨 뒤, 2차 항체를 포함한 용액으로 immunoblotting 반응시키고 ECL로 detection한다. X-ray film에 노출시켜 autoradiography 를 하고, 각각의 band의 상대적인 농도는 Imaging Analyzer로 정량화함으로써, 활성화 정도를 Western blot를 통해 확인한다.

4. Prostaglandin E2의 농도분석

냉동된 colon 조직을 차가운 cell lysis buffer 100 μL을 넣고 homogenizer로 균질화한 후, 원심분리하여(4℃, 10,000 g, 30 분) 상층을 준비한다. 균질화된 colon 조직에서 용출된 단백 질을 정량 후, PGE2의 농도를 prostaglandin E2 EIA kit (Assay Designs)로 분석한다.

5. Immunohistochemistry

파라핀으로 포매된 colon 조직은 박편절기를 이용하여 4

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Figure 1. 대장 선종 환자에서 정상 조직에 대한 선종 조직의 15-PGDH, COX-2, mPGEs-1, PGE2의 상대 발현도.

μm 두께의 연속절편을 작성하여 60℃에서 20분 동안 처리 하여 파라핀을 제거하고 함수시킨다. 96℃에서 5분 동안 10 mM citrate buffer (pH 6.0)로 처리하여 항원을 복구시키고 20 분간 식힌다. 상온에서 3% H2O2가 함유된 물에 30분간 처리 하여 내인성 peroxidases를 비활성화시키고 serum-free protein block (Dako, Carpenteria, CA, USA)로 60분간 blocking시 킨다. Monoclonal anti-15-PGDH antibody 함유한 1% BSA로 처리한 후 EnVision+anti-mouse kit (Dako)으로 처리한다.

Harris modified hematoxylin으로 염색한다.

6. 15-PGDH knockout 마우스의 breeding

Case Western Reserve University로부터 15-PGDH knockout 마우스를 도입한다.

7. FVB mouse, 15-PGDH knockout 마우스에서 celecoxib의 반응성 연구

종양 억제 유전자로서의 15-PGDH의 역할을 규명하기 위 해 15-PGDH knockout FVB 마우스에 AOM을 이용한 대장암 모델을 구축하여 종양 발생 단계 과정에서 prostaglandin pathway의 활성화에 미치는 영향을 알아본다.

AOM 유발 대장암 모델: AOM 단독 투여로 대장 종양 유 발이 가능한 FVB 마우스를 이용하여, 8주 내지 12주령의 마 우스에 6주간 AOM 10 mg/kg를 매주 복강 내 주입하였고, 마지막 AOM 투여 후 24주가 경과한 시점에서 마우스를 희 생하여 종양의 개수, 크기를 분석하고, 15-PGDH, PGE2의 분 석에 필요한 검체를 채취하였다.

연구수행 내용 및 결과

1. 대장암 환자와 용종 환자에서 PGs의 대사 조절기전 연구

대장 암과 선종의 15-PGDH의 유용성을 확인하기 위해 대장 암조직과 정상조직, 용종 환자에서 용종 절제술 시행 시 용 종 및 정상 대장 점막에서의 15-PGDH의 발현 정도를 Real time PCR을 이용해서 측정하였다. 15-PGDH의 발현 외에도 관련 유전자인 COX-2와 mPGEs-1과 그 산물인 PGE2의 생성 정도를 함께 측정하였다. 총 20명의 대장 선종 환자와 27명 의 대장암 환자를 대상으로 대장 조직에서 15-PGDH, COX-2, mPGEs-1, PGE2를 측정하였으며, 15-PGDH 및 COX-2의 발 현은 Real time PCR로 정량 분석하였고, mPGEs-1는 Western bolt를 시행하였으며, PGE2는 ELISA를 이용해 정량하였다.

정상 조직에 비해 대장 선종에서 유의하게 15-PGDH의 발 현이 저하되어 있었으나(p=0.000), COX-2, PGE2 및 mPGEs-1 의 발현은 정상 조직에 비해 대장 선종에서 유의한 증가를 보이지는 않았다(p=0.195, p=0.347, p=0.095) (그림 1). 또한, 정상 조직에 비해 대장암 조직에서는 유의하게 15-PGDH의 발현이 저하되고 mPGEs-1와 PGE2의 발현이 증가하였고 (p=0.000), COX-2의 발현은 정상 조직에 비해 대장암 조직에 서 유의한 증가를 보이지는 않았다(p=0.209) (그림 2). 정상 조직에 비해 대장암 조직에서는 15-PGDH의 감소는 90.9%에 서, COX-2의 증가는 68.4%, PGE2의 증가는 59.1%에서 관찰 되었고, 대장 선종에서는 15-PGDH는 75%에서 감소하였고, COX-2 및 PGE2는 각각 50%, 45%에서 증가하였다. 이러한

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Figure 2. 대장암 환자에서 정상 조직에 대한 대장암 조직의 15-PGDH, COX-2, mPGEs-1, PGE2의 상대 발현도.

Figure 3. 대장암조직과 선종조직에서의 15-PGDH발현의 병리적 분석.

결과를 종합하면, 15-PGDH는 COX-2, PGE2 및 mPGEs-1와 달리 대장 선종에서도 발현의 변화가 빈번하게 나타나며 선 종의 진단 또는 재발의 조기 표지자로서의 유용성에 대해 추가적으로 연구를 지속할 만한 가치가 있다고 할 수 있겠다.

2. 대장암 환자와 선종 환자에서 15-PGDH의 발현의 병리학적 분석

대장선종 및 대장암에서의 조직에서의 발현을 눈으로 관 찰하기 위해 15-PGDH의 면역조직화학(immunohistochemistry) 검사법을 시행한 결과, 대장암조직에서는 85.7% (21개중 18 개)가 염색이 되지 않고 주변정상조직에서의 발현이 나타났 으며, 80% (20개 중 16개)의 대장선종에서 발현이 나타나지 않고 주변정상조직에 발현이 나타났다. 스코어는 0에서 3까 지 측정하여 도표화하였다(그림 3).

3. 15-PGDH knockout 마우스에서 celecoxib의 반응성 연구

대장암 또는 대장 선종의 화학예방과 관련하여 COX-2의 선택적 저해제인 Celecoxib이 가족성 선종성 용종증 및 산발 성 대장 선종에서 선종 발생을 예방하는 효과가 있음이 알 려져 있으나, 상당수의 환자에서는 celecoxib의 화학예방 효 과에 내성을 보이는데, 이러한 내성을 보일 수 있는 기전은 아직 알려져 있지 않다. 한편, 15-PGDH는 대장암 발생과 관 련된 prostaglandin의 대사에 관여함으로써 종양억제자로 작 용함이 알려져 있다. 따라서 주관연구자는 celocoxib에 의한 COX-2 억제에 따른 prostaglandin의 생성 저하 외에도 15-PGDH에 의한 prostaglandin의 대사 정도가 대장 점막에서 의 prostagladin 수준에 중요한 역할을 하고, celecoxib의 화학 예방효과 대한 반응성에도 영향을 미칠 것이라는 가정하에 15-PGDH knockout FVB 마우스를 이용한 실험을 수행하였 다(그림 4).

A B C

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Figure 4. Celecoxib resistance in 15-PGDH knockout mice.

먼저, 15-PGDH +/+ FVB 마우스에서 AOM으로 대장 종양 을 유발한 군과 AOM으로 대장 종양을 유발하면서 동시에 celecoxib를 투여한 군을 비교하였을 때, 대장 종양의 개수는 celecoxib 비투여군에서 2.3±0.4개, celecoxib 투여군에서는 0.7±0.3개로 celecoxib 투여군에서 유의하게 적었으며(p=0.003), 크기도 각각 2.2±0.4 mm, 0.3±0.1 mm로 celecoxib 투여군에서 유의하게 작았다(p=0.001). 이를 통해 celecoxib가 15-PGDH 발현이 정상인 FVB 마우스에서는 AOM을 이용한 대장 종양 유발을 예방하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

15-PGDH의 발현 정도에 따라 celecoxib의 대장 종양 발생 예방 효과가 달라지는지 확인하기 위해 15-PGDH -/- FVB 마우스와 15-PGDH +/+ FVB 마우스에 AOM으로 종양을 유 발하면서 celecoxib를 투여하였을 때, 15-PGDH -/- FVB 마우 스에서 대장 종양이 유의하게 많이 발생하였으며, 종양의 크 기도 유의하게 컸다. 또한 15-PGDH -/- FVB 마우스에 대해 AOM으로 종양을 유발하면서 celecoxib를 투여한 군과 celecoxib 를 투여하지 않은 군을 비교했을 때에는 종양의 크기 및 개

수에 유의한 차이가 없음을 확인하였다. 따라서 celecoxib 즉, COX-2 억제를 통한 대장 종양 예방을 위해서는 15-PGDH에 의 한 prostaglandin 대사 작용이 함께 수반되어야 하며, 체내에 서의 15-PGDH의 소실이 celecoxib에 대한 내성을 유발함을 확인할 수 있었다.

15-PGDH 발현 수준에 따라 celcoxib의 화학 예방 효과가 다르게 나타나는 기전을 확인하기 위해 각각의 실험 조건에 따른 FVB 마우스 대장 점막의 PGE2의 수준을 측정하였다.

AOM으로 대장 종양 유발 후 PGE2를 측정했을 때, 15-PGDH +/+ FVB 마우스(5.1 ng/mg protein±0.8)에 비해 15-PGDH -/- FVB 마우스(9.1 ng/mg protein±1.5)에서 PGE2가 유의하게 높 았으며(p=0.04), celecoxib를 함께 투여한 경우에는 15-PGDH +/+ FVB 마우스에서는 PGE2가 1.6 ng/mg protein±0.4로 현저 히 감소한 반면, 15-PGDH -/- FVB 마우스에서는 PGE2가 4.7 ng/mg protein±0.8로 상대적으로 PGE2의 감소 정도가 경미하 였다(p=0.0002).

A B

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요약 및 결론

Prostaglandin 대사에서 매우 중요한 역할을 하는 15-PGDH 는 종양억제유전자로 작용을 하며, 본 연구 결과를 검토하면 대장암 진전에서 매우 초기에 그 발현이 줄어드는 것을 확 인할 수 있었다. 따라서 향후 대장암 전구병변인 대장선종의 발생기전의 연구와 진단 바이오마커로의 개발에 중요한 역 할을 할 수 있는 유전자로 생각할 수 있다.

또한 암 예방약제로 개발 가능성이 있는 celecoxib의 경우 실제 15-PGDH의 발현 유무에 따라 그 반응성이 달라서 향 후 암 예방약제 치료 반응을 예측할 수 있는 바이오마커로 개발할 수 있는 가능성을 제시할 수 있었다.

향후 위암, 췌장암 등의 다른 암종에서의 15-PGDH의 역 할에 관한 연구, 또한 대장암의 진단과 치료에서 바이오마커 로 개발하기 위한 임상연구 등이 이어져야 할 것으로 생각 된다.