임상병리검사과학회지
:
제 27권 제 1 호1995.
체 액 에 서 Nested Polymerase Chain Reaction을 이 용한 결핵균의 검출에 관한 고찰
서울의과학연구소·서울임상병리검사센터 검미영·이무주·최철석·이경옥
Detection of Mycobacterium tuberculosis in Body Fluids by Nested Polymerase Chain Reaction
Kim , Mi - Young. , Lee , Moo - Joo. , Choi , Cheol- Seok. , Lee , Kyung - Ok
Seo uJ Medical Scieηce 1:ηstitμte . Seo uJ Clinical L뼈m-atories( SCL)
The diagnosis of Mycobacterium tuberculosis( M tuberculosis) in body fluids is not easy due to their small copy numbers and several technical problems. Recently molecular diagnosis for M.
tuberculosis by Polymerase chain reaction(PCR) has frequently been used. In this study , the nested PCR method was tried to obtain higher sensitivity for the detection of M. tuberculosis and compared with the first step PCR in a total of 400 specimens. The oligonucleotide se- quences of primers were selected from IS6110 gene of M. tuberculosis and were designed to amplify a 324 bp for first PCR and a 239 bp for Nested PCR , respectively. In 400 body fluid samples , 82( 20.5 %) cases were positive in the first PCR group. However , in Nested PCR group , 190(47.5 %) cases were positive. Sensitivity of Nested PCR group was more than dou- bled. This study showed that the nested PCR method has higher sensitivity than first PCR.
Therefore , it is our opinion that nested PCR , especially in body fluids , is more useful tool for diagnosis of M. tuberculosis than first PCR method.
Key words: 빼'CO，뻐cterium tuberculosis. nested PCR , body fluids
를 이용하여 인위적으로 목표로 하는 DNA를 수십만 배이상 단시간에 증폭시킬 수 있는 획기적인 분자생물 최근 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction : 학적 방법이다l이. 이 방법은 임상에서 유전자질환의 진 PCR) 은 SaÏl선 등에 의하여 임상에 처음 활용되기 시 단， 암유전자나 암억제유전자 등의 검출， 각종 유전자 작한 분자생물학적인 기법으로써 Taq DNA polymerase 의 분자생물학적 연구 뿐 아니라 감염증의 진단에도
I. 서 로 」
그 활용성에 대하여 많이 보고되고 있다2) 특히 감염 losis와 M. bovis에 특이성을 가지며 결핵균 한 개체당 증분야 중 결핵 균의 진단에 서 는， 기 존에 사용되 던 결 10-
’’-.‘‘.‘‘‘‘‘‘‘‘‘핵균 염색방법이나 배양 등의 방법이 감도가 떨어지 부위에서 선택하였다. 1 차 PCR을 위한 pnmer로는 고， 4"'8주 정도의 긴 시일이 소요되는 단점이 있어， TB1 , TB2를 사용하였고， Nested PCR을 위해서는 이를 보완할 수 있는 PCR 방법은 객담검체에서 결핵 TB3와 TB4를 사용하였다 3l) (Table 1).
균 검출을 위해 임상에서 활발히 이용되고 있는 추세
이다1 ， 2) 그러나 소변 및 척수액 등 각종 체액에서는객담과는 달리 결핵균의 수가 매우 적고， 기존의 PCR 방법으로는 그 측정에 한계가 있으며 위음성률이 높아
좀 더 민감도가 높은 방법이 요구되어 왔다 11 ， 15) 이에저자들은 각종 체액에서 민감도가 높은 결핵균 PCR을 실행하기 위하여 첫째， 체액 검체 중 DNA를 추출하는 가장 효과적인 방법을 검토하였고， 둘째로 기존의 PCR방법을 보완하여， 1 차로 PCR을 실시하고 다시 그 PCR 산물내의 염기서열에서 선택한 primer로 PCR을 실시하는 Nested PCR을 시도하였으며， 제한효소분석 을 이용하여 결핵균에 특이한 PCR산물을 확인하였다.
II. 실험재료 및 방법
1. 실험 재료
결핵균 양성대조로 M. tuberculosis(ATCC 27294), M.
bovis(ATCC 29312) 균주를 사용하였고， 음성대조로 M.
intracellulare(ATCC
1395이 ，M. avium(ATCC
19074) 을사용하였다. 임상검체로는 결핵을 의심하는 환자로써
1995년 6월부터 1995년 8월까지 본 기관에 의뢰된 체 액 400예를 대상으로 실시하였다 (Table2).
시약으로서 agarose( type 1) 는 미국 BRL사의 제품을 사용하였 으며 , 제 한효소， 전 기 영 동 marker, Taq polymerase는 미국 Promega사의 제품을 사용하였고， 기타 다른 모 든 시약들은 molecular biology용을 사용하였다.
2. 실험 방법
1) Oligonucleotide primer의 합성
T able 1. The genetic location of M. tuberculosis primer used 1st and Nested PCR.
PCR Primer Location(nucleotides) PCR product First PCR TB1 Sense 561-580 324 bps
TB2 Antisense 865 - 884
Nested TB3 Sense 588-609 239 bps PCR TB4 Antisense 805 - 826
Table 2. The compared data between First PCR and Nested PCR among 400 body fluid samples.
Specimen Total PCR positive 1st PCR Nested PCR Urine 116 21 (1 8.0 %) 48(4 1. 3 %) Bronchial washing 80 30(37.0 %) 52(65.0 %) Pleural fluid 96 12(12.5 %) 35(36 .4 %)
C.S.F 36 2( 5.0 %) 14(38.8 %)
Other body fluid 96 17 (1 7.7 %) 4 1( 42.7 %)
Total 400 82(20.5 %) 190(47.5%)
2)
결핵균 DNA의 추출효과적인 결핵굵 DNA추출을 위하여 boiling방법과
Boom
동 17) 이 사용하였던 silica법을 사용하여 추출하여비교하였다. Boiling 방법은 1. 5 ml tube에 PBS용액
(phosphate buffer solution : PBS , pH 7 .4) 800
μl와 검체를 넣어 세척한 후， 5 % chelex 100μl를 넣고 95
0C
에서 15분간 가열하여 DNA를 용출하였다. 완전히 용
출이 끝난 후 12 , 000 rpm에서 1 분간 원침시키고 상층
액을 PCR에 사용하였다. Silica 법은 1. 5 ml tube에 세
포용해 완충액(O .lM Tris-HCl pH 6 .4 100 ml , GuSCN
PCR
primer는392 DNAjRNA
합성 기(Applied Bio- 120 g , 0.2M EDTA pH 8.0 22 ml , Triton X -100 2.6 g)
system. U.S.A.) 를 이용하여 합성하였으며 ， M. tubercu- 800 μl와 검체를 넣어 혼합한 후 100 t 에서 15분간 가
열하였다. 가열한 후 silica dioxide 용액 40 띠을 혼합 위하여 PCR산물에 제한효소 Asu1 , Hha1을 10 unit 가 하여 10분간 실온에서 방치 후， 12 , 000 rpm에서 15초 한 후 37 t 에서 6시간 이상 처리하였다. 다음으로 12
간 원침시켰다. 다음 상충액 제거 후 침전물을 세포용 % polyacrylamide gel로 제한효소에 의해 절단된 액 (GuSCN 120g , O .1 M Tris-HCl pH 6 .4 100ml)을 DNA단편을 분석하였다.
1 ml 정도 넣고 부유시켜 2회 세척하고， 70 % cold
ethanol로 2회， acetone으로 1 회 처리한 후 60 t 에서 m. 실 험 성 적 건조시켰다. 완전히 건조된 용기에 3차 증류수를 넣고
60 t 에서 10분간 방치하여 silica 입자와 결합된 DNA 1. PCR의 특이도 를 용출하였다. 완전히 용출이 끝난 후 12 , 000 rpm에
서 2분간 원침시키고 상층의 용액을 PCR에 사용하였 다.
3. 중합효소연쇄반응
본 실험에 사용된 1S6110 primer의 특이도를 보기 위하여 사용한 결핵성 항산균 표준균주 중 M. tubercu losis, M.
bovis에 서 1 차 PCR에 서324 bps ,
2 차 PCR에서 239 bps의 특이 한 DNA band를 관찰할 수 있었 다.
반면 에 비 결 핵 성 항산균인 M. intracellulare, M. avium PCR 반응의 최종액은 20 띠로 하였으며 ， Taq DNA 은 음성을 보여 결핵균에만 특이하게 작용하는 것이 polymerase와 검체 DNA를 제외한 모든 반응액의 성 입증되었다 (Fig. 1).
분 (20pM
primer , 0.2mM dNTP , 50mM KCl , 10mM Tris - HCl pH 8.8 , 1. 5mM MgClz. 0 .1 % Triton X-
10이은 실험 조건의 동질성을 위해 사전에 제조하고 분주하여 -70t 에 보관하고， 사용시 필요한 양만람 꺼내 사용하였다. PCR반응은 1 차 PCR에서 94 t 에서 1 분 30초， 62 t 에서 1 분 30초， 72t 에서 2분으로 35
회를 반복하였다. 한편， Nested PCR은 94 t 에서 1 분，
680C 에서 1 분，
72
uC 에서 1 분 30초로 28회를 자동thermal cycler( GeneAmp PCR system 9600 , Perkin Elmer Cetus Inc.) 를 이 용하여 증폭하였다.
4. Agarose gel
전기 영동 및DNA
Band의 분석PCR 반응의 확인을 위하여 증폭된 DNA에 2 띠의
loading buffer( 0.25 % bromophenol blue , 0.25 % xy- lene cyanol) 를 넣은 다음 2 % agarose gel에 100 volt
에 서 30분 전 기 영 동 시 킨 후， ethidium bromide로 염 색 하여 , 1 차 PCR에 서 는 324 bp , Nested PCR에 서 는 239 bp 크기의 DNA band를 확인하였다.
5. PCR산물의 제한효소 분석
증폭된 DNA의 결핵균에 대한 특이도를 검토하기
2. 각종 체액검체에서 1 차 PCR과 Nested PCR결과 의 비교
소변 과 각종 체 액 으로부터 boiling법 과 silica 방법 으 로 결핵균의 DNA를 추출하였을 때 동일한 양성률을 나타내었으나， boiling법에서 보다 더 선명한 DNA
band를 나타내어 구분이 용이하였다. 400예의 각종 체 액 검체중에서 1 차 PCR에서는 소변 21 예(1 8
%),
기 관지세척액 30예 (37%)
늑막액 12예(1 2.5 %)와 척수액 2예 (5 %) 및 기타 체액을 합하여 82예 (20.5 %)에 서 양성을 나타내었다. 한편 Nested PCR의 경우， 소변 48예 (4 1.3 %), 기관지세척액 52예 (65 %), 늑막액 35예
(36 .4 %)와 척수액 14예 (38.8 %) 및 기타 체액을 합 하여 190예에서 양성을 나타내어 총 47.5 %의 양성률 을 보였다 (Table 2). 소변과 기관지세척액에서는 약 2
배 정 도 Nested PCR에 서 1 차 PCR보다 더 높은 양성 을 나타내었으며， 특히 척수액 36예 중 1 차 PCR에서는 2
예 (5 %)에서만 양성이었으나，
Nested
PCR에서는 14예(38.8 %)가 양성으로 7배 이상 높은 양성률을 보였다.
종합적으로 볼 때 1 차 PCR에서보다
Nested
PCR에서2배 이 상 높은 양성 률을 나타내 어 , Nested PCR이 매
우 높은 민감도를 나타내었다.
A.
M123456
M : Phi x 174/Hinf 1 Maker Lane 1 : M. tuberculosis A TCC 27294 Lane 2 : M. bovis ATCC 29312 La ne 3 : M. intracellulare ATCC 13950 Lane 4 : M. avium ATCC 25281 Lane 5 : Negative patient sample Lane 6 : Positive patient sample B.
M123456
M : Phi x 174/Hinf 1 Maker Lane 1 : M. tuberculosis A TCC 27294 Lane 2 : M. bovis ATCC 29312
3. PCR 산물의 제한효소분석
증폭된 PCR산물이 결핵균의 DNA인가를 확인하기 위하여 제한효소 AsuI과 HhaI으로 절단한 결과， 1 차 PCR과 Nested PCR산물에 서 AsuI에 의 해 서 는 각각 4 개의 서로 다른 DNA 절편을 나타내었고， 제한효소 패wI에 의해서는 각각 2개의 다른 DNA절편을 나타내
<?324bps 었다 (Table 3). 결핵균 PCR산물의 제한효소 절편다형
성 분석은 Fig. 2에 나타내었다.
Table 3. Restriction enzyme analysis of 1st PCR and Nested PCR for the detection of M. tuberculosis.
Size of DNA Fragments(bps) Restriction Recognizing
Enzyme Sequence G\GNCC Asu 1
CCNG\G GCG\C
Nested PCR : 131, 110, 59, 24 Nested PCR : 110, 59, 46, 24 First PCR : 185 , 139 Nested PCR : 185 , 54 Hha 1
C\GCG
1 2 3 4 5 6
이그 239bps
Fig. 2. DNA fragments of first PCR and Nested PCR restricted by AsuI and Hha I. They were analyzed by 12 Lane 3 : M. intracellulare ATCC 13950 % polyacrylamide gel electrophoresis.
Lane 4 : M. avium ATCC 25281 Lane 1 : Molecular standard marker(Phix174/Hinf m)
Lane 5 : Negative patient sample Lane 2 : First PCR product digested with Asu 1
Lane 6 : Positive patient sample Lane 3 : First PCR product digested with Hh a 1
Fig. 1. PCR products of (A) One step PCR and (B) La ne 4 : Molecular standard marker(Phi x 174/Hinf m)
Nested PCR for strandard strains of M. tuberculosis and Lane 5 : Nested PCR product digested with Asu 1
clinical samples. Lane 6 : Nested PCR product digested with Hha 1
N. 고 찰
바이러스 8) ， C형 간염 9) 등의 PCR진단을 위하여Nested
PCR방법을 도입하고 있으며， 이것은 매우 뛰어난 효 결핵은 만성감염질환으로 1990년도 현재 한국에는 율성을 보여주고 있다. 그러나 Nested PCR방법은 1 차 70여만 명의 환자가 있으며 연간 4000여명의 새로운 PCR 과정이 끝난 PCR산물을 다시 증폭시키므로 실험 환자를 내고 있는 중요한 국민보건문제로 남아 있다6) 과정에서 발생할 수 있는 오염 가능성이 매우 큰 것이 최근 서구 각지에서도 후천성면역결핍증환자의 증가로 문제점이라고 할 수 있다9) 그러므로 임상검사실에서 인한 속발성 감염으로 결핵이 다시 증가하고 있으며， Nested PCR방법을 일상적인 검사로 활용하기 위해서 다약제내성 결핵균주 등의 출현 등으로 인하여， 결핵 는 실험 공간의 적절한 분리， 양성과 음성 대조의 사 균진단의 보다 신속하고 정확한 방법이 요구되고 있는 용， DNA의 추출에서 PCR산물의 폐기에 이르는 전 과 실정이다. 현재 결핵을 진단하기 위한 방법으로 많이 정에 걸친 철저한 정도관리가 펼요할 것이다. PCR을 사용되는 방법중 염색법은 간단하고 신속하게 결과를 실시한 후 그 산물을 확인하는 방법으로는 probe를 이 얻을 수 있으나 항산균과 비항산균의 구분이 어려우 용한 blotting 방법이나， 염기서열분석 또는 특이한 염 며， 결핵균배양법은 확진방법이지만 배양기간이 4-8 기서열을 인식하는 제한효소를 이용한 방법 등을 들 주 소요되는 문제점이 있다 12) 최근 소개된 중합효소연 수 있다 13) 염기서열분석이나 blotting방법은 동위원소 쇄반옹 (PCR) 은 객담에서 결핵균의 감염진단에 활발히 를 사용하거나， 노동력과 시간이 많이 걸리므로， 저자 이용되기 시작하고 있으며， 많은 임상적인 보고가 나 들은 증폭된 결핵균 DNA로 중합효소연쇄반응-제한 오고 있다상). 그러나 임상에서 소변을 비롯한 체액에 효소절편다형성 (polymerase chain reaction - restriction
서 결핵을 진단하기는 객담에서보다 다소 어려운 점이 fragment length polymorphisms: PCR - RFLP) 원리를 있는데， 이는 체액에서는 분포한 균의 수가 적으므로， 이용하여 분석하였다. 1차 PCR과 Nested PCR에서 증 염색법이나 배양에서 위음성의 가능성이 높기 때문이 폭된 PCR산물에 두 가지 제한효소 AsuI과 HhaI를 처 다 2) 본 저자들의 경험에 의하면， 체액에서는 기존의 리하고 절단한 후 잘라진 DNA단편의 길이를 12 %
PCR방법으로는 매우 낮은 검출률을 보여， 체액에서 polyacrylamide gel을 이용하여 분석한 결과， 1 차 PCR
결핵균의 효과적인 검출을 위한 민감도가 높은 PCR 에서는 제한효소 AsuI에서 131 bp , 110 bp , 59 bp ,
검사방법이 요구되고 있는 실정이다4) 저자들은 400예
24
bp의 4가지 각기 다른 DNA단편이 확인되었으며， 2의 소변을 비롯한 각종 체액으로부터 boiling법과 silica 차 PCR에서는 110 bp , 59 bp , 46 bp , 24 bp의 DNA 단 방법으로 결핵균의 DNA를 추출하였을 때， 양성률은 편이 검출되었다. 한편 제한효소 HhaI을 이용하였을 동일하였으며， boiling 방법의 경우 노동과 시간， 경비 때， 1 차 PCR에서는 185 bp , 139 bp를， Nested PCR에서 면에서 소모가 적고，특히 추출과정이 간단하여 DNA 는 185 bp , 54 bp의 단편을 확인하였다 (Table 3 , Fig.
손실과 검체간의 교차오염의 가능성이 적었고 선명한 2). 따라서 본 실험에서 시도한 1 차 PCR과 Nested DNA band를 나타내었다. 한편 체액에서 결핵균 PCR PCR에서 증폭된 DNA는 결핵균에 특이한 것임을 비 검사의 예민도를 높이기 위하여 시도한 Nested PCR방 교적 간단하고 신속하게 확인할 수 있었다. 이상의 결 법에서는 1 차 PCR방법에 비해 평균 2배 이상의 양성 파로 볼 때， Nested PCR은 균수가 적은 체액 및 객담 률을 나타내어 (Table 2) , Nested PCR의 민감도가 매 에서 결핵균의 검출을 위한 검사로써， 1 차 PCR법에 우 우수함이 입증되었다. Nested PCR은 추출된 결핵 비해 임상에서의 활용이 매우 클 것으로 사료된다.
균의 DNA로 IS6110의 561-884 위치에서 1 차 PCR을
실시하고， 여기에서 음성이 나온 검체는 다시 그 내부 V. 결 론 의 588-826 위치에서 1 차 PCR산물로， PCR을 한번
더 실시하는 방법으로 민감도를 높인 방법이다 12， 13) 현 소량의 특정 DNA단편을 단시간내에 대량으로 증폭
