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Herpes Simplex Virus 1 , II 의 동정 에 관한 연 구

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임상병리검사과학회지 : 제 27권 제 1 호 1995.

뇌척수액에서 PCR-RFLP법을 이용한

Herpes Simplex Virus 1 , II 의 동정 에 관한 연 구

서울의과학연구소 · 서울임상병리검사센터 (SCL) 주은미 이무주 · 최철석 이경옥

Detection of Heγþes

Simplex

Virμs Type 1 and II

in Cerebrospinal Fluids by Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length Polymorphisms

Joo, Eun-Mi., Lee, Moo-Joo., Choi, Cheol-Seok., Lee, Kyung-Ok

SeOí따 Medic,따 Science Institute . Seo따 Clinic따 U뼈ratories( SCL)

Three different DNA extraction methods including phenol/chloroform, GuSCN/silica and boiling methods were tried to increased sensitivities of detection of HSV by PCR in clinical CSFs. And types of HSV were identified by Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length Poly- morphism(PCR - RFLP). AIso these samples were analysed by Enzyme Immuno Assay(EIA) to compare with PCR results. 476 bp of amplified DNA products was restricted by A vaII and resulted in 206, 183, 87 fragment for HSV 1, 389 and 87 fragment for HSV JI, respectively. In a total of 58 CSF samples, all samples were IgM and IgG negative by EIA. However 8 samples were positive by PCR. And by PCR - RFLP, HSV type 1 was 6 cases, HSV type JI was 2 cases. In 6 HSV 1, phenol and silica extraction method were same result as 6 case. But 5 were positive in boiling meth od. In 2 HSV JI, phenol and silica extraction method were also same results as 2 cases. But one was positive in boiling method. AS above our results, phenol and silica extraction method were usefullness for detection of HSV in CSF by PCR. Also PCR was more sensitive as 13.8 % then EIA. In conclusion, HSV PCR - RFLP method provides relatively rapid and practical tool in CSF samples for the early diagnosis of HSV infection.

Key words : HSV, CSF, PCR - RFLP

(2)

를 실시하였다. 효소면역방법의 항체측정시약으로 독 일 B.M사의 제품을 사용하였고, PCR-RFLP검사를 위 단순 헤르페스 바이러스 (herpes simplex virus: 한 시약으로 phenol, chloroform, GuSCN, silica, 제한 HSV) 는 두 가지 형으로 구분되는데, 제 1 형은 주로 효소, acrylamide, 전기영동 marker와 Taq polymerase

상체감염으로 구강, 얼굴 등에 수포성 괴양성 병변을 는 미국 Promega사 제품을 사용하였다.

1.서

일으키고, 제 2형은 주로 생식기 계통의 감염으로 성

기 및 항문 등에 병변을 일으킨다 3-5) 임신 초기에 2. 실험 방법 HSV에 감염된 모체로부터 태아에게 전염되면 뇌막염

뿐 아니라 태아의 사산, 기형, 자궁내 사망, 체형성의 1) HSV 항체검사

미숙 또는 뇌형성의 불완전 등의 원인이 되며, 정상적 검체 희석액으로 환자검체를 희석 후 항원이 흡착된 으로 발달된 태아의 경우라도 출산 경과 중에 산도에 plate의 각 well에 일정량 분주한 다음 1 시간 동안 배 있는 HSV 병소와 접촉하거나 또는 주변 환경으로부터 양시켰다. 제조된 세척액으로 세척 후 효소표지항체 감염된 선생아는 성장 초기에 어려운 상황에 처하게 (conjugate IgG, IgM) 를 각각 넣고 실온에서 방치한 된다 4-7) 현재까지 HSV검출을 위한 검사방법으로 보 다음 다시 세척하고 기질액을 각각의 well에 넣고 빛 체결합법, 중화항체법, 효소면역법 등의 혈청항체검사 이 차단된 장소에 방치 후 반응 정지액을 넣어 흡광도 HSV 바이러스 배양법이 사용되고 있다. HSV 항체 를 측정하였다 1)

를 검사하는 방법 중에서는 비교적 소요시간이 짧고

간편한 효소면역법이 많이 이용되고 있으나, 이 방법 2) HSV PCR - RFLP 검사

으로는 바이러스의 수가 적은 뇌척수액에서 HSV의 검

출은 어렵다 8-9) 한편 바이러스 배양법으로도 HSV의 ( 1) Oligonucleotide primer의 합성

측정이 가능하나 과정이 까다롭고 1 개월 이상의 시간 PCR primer 는 392DNA/RNA 합성기 (Applied Bio

이 요구되어 일상검사실에서 사용하기 어렵다. 본 실 system. U .S.A.) 를 이용하여 합성하였다. Primer는 HSV

험에서는 이러한 문제점을 개선하기 위하여 최근 여러 분야에서 다양하게 사용되고 있는 최신 분자생물학적 기법인 PCR을 이용하여 뇌척수액 중의 HSV DNA를 증폭하고, 제한효소절편의 다형성으로 유전자의 형별 을 구분하는 중합효소연쇄반응-제한효소절편다형성

(polymerase chain reaction - restriction fragment length polymorphism : PCR -RFLP) 방법을 이용하여 HSV의 형별 구분을 시도하였다.

11. 실험재료 및 방법 1. 실험 재료

표준균주로 HSV A549 세포주를 사용하였으며, 검 체는 헤르페스성 뇌막염이 의심되는 환자의 뇌척수액 58예를 대상으로 하여, 효소변역방법과 PCR-RFLP검사

DNA polymerase 유전자 부위에서 선택하였으며, 그 염 기 배 열 5' - CAG T ACGGCCCCG AGTTCGTG A - 3'

5' -GTAGATGGTGCGGGTGATGTT-3' 이다 10, 11)

(2) DNA 추출

CD Phenol/Chloroform 추출방법

뇌 척 수액 100 띠에 세 포용해 완충액 (0.6 % SDS, 10 mM tris pH 8.0, 10 mM EDTA, 100 t땅/ml proteinase K) 500 띠를 가하고 50 vC 에서 1 시간 반응시킨 후 phe

nol용액 200 띠를 넣고 원심분리하여 상층액을 취한다.

Chloroform 용액 200 μl를 넣고 원심분리하여 상층액을 취하고 100 % ethanol을 가하였다. Ethanol을 완전히 건조시킨 후 TE buffer(l O mM Tris pH 8.0, 0.5 mM

EDTA) 에 재용해시켜 PCR 에 사용하였다 8, 12)

@ Boiling방법

뇌척수액 500 띠를 18,000 rpm에서 30분간 원심분리

%

(3)

를 한 후 50 띠 정도만 남기고 상충을 제거한 다음 HSV - IgM, HSV - IgG 항체는 모두 음성을 나타내었

resin(chelex 100) 50 띠를 넣 100 uC 15분간 가열 하 다.

였다 13)

@ Silica방법 2. HSV 0m마1\‘‘\‘‘\‘‘뻐‘

뇌 척 수액 500 띠에 세 포용해 완충액 (GuSCN, 100

mM Tris, 200 mM EDTA, Triton X -10이을 가하고 바이러스의 수가 적게 분포되어 있는 뇌척수액에서 10분간 실온에 방치한 후 silica입자에 홉착되도록 하 HSV PCR을 실시함에 있어서 민감도가 높고 DNA 였다. 이어 약 12,000 rpm에서 5초간 원침시키고 상층 실이 적은 DNA추출방법의 선택이 필수적이다. 본 실 을 제거한 침전물에 guanidinium thiocyanate 세척액으 험에서는 HSV DNA의 효과적인 추출을 위하여, 대상 로 2회, 70 % ethanol 2회, acetone 1회씩, 각각 세척 검체 58개로 phenol방법, boiling방법과 silica방법을 각 하여 56 t 에서 건조시켰다. 건조된 DNA 결합 silica 각 사용하여 HSV-DNA를 추출하고 PCR을 시도하였 입자에 증류수 50 띠를 넣고 다시 56 t 에서 약 10분간

방치하여 DNA를 추출하였다 2)

(3) PCR반응 및 제한효소 절단

PCR buffer(50 mM KCl, 10 mM Tris-Cl pH 8.8, O.

2 mM dNTP, 1.5 mM MgC12, 0.1 % Triton X -100,

10 pM primer) 에 음성대조에는 증류수를, 양성대조로

HSV DNA 5 띠, 환자 검 체 DNA 5 띠, Taq DNA poly- merase 0.5 unit를 각각 넣어 모든 반응액의 최종량을

20 띠로 한 다음, Perkin - Elmer automatic thermal cy- cler(GeneAmp PCR system 9600. Perkin Elmer Cetus

Inc.) 에서 94 t 에서 1 min 50 sec, 60 t 에서 2 min, 72

℃에서 2min을 1 cycle로 하여 40단계를 실시하였다.

PCR이 끝난 후 PCR 산물 10 띠에 제 한효소 AvaII를

20 unit넣고 buffer 2 띠를 첨가 후 37 t 에서 하룻밤 방치시켰다.

다. 그 결과 silica방법 과 phenol방법 에 서 추출한 DNA

로 PCR을 실시하였을 때, 동일하게 8예(1 3.8 %)에서 양성을 보였으며, boiling방법에서는 6예가 양성으로 앞의 두 방법에 비해 3.5 % 낮은 양성률을 나타내었다

(Table 1).

Table 1. The positive rates of HSV -PCR using three dif- ferent DNA extraction methods in 58 CSF samples

HSV DN A extraction metnod

Type Phenol 법 Boiling Silica 법

HSV 1 6(10.3%) 5(8.6%) 6(10.3%) HSV II 2(3.5 %) 1(1.7 %) 2(3.5 %) Total 8/5803.8 %) 6/5800.3 %) 8/5803.8 %)

3. HSV PCR -RFLP의 결

( 4) Agarose gel 전기영동 및 DNA Band의 분석 HSV PCR을 실시하여 양성대조와 검체에서 476bp

증폭된 DNA를 5' -GjGA(T)CC-3' 을 인식하는 제 의 PCR산물을 확인하였다. 또한 뇌척수액 58예 중에 한효소 Ava 11 로 자른 다음 12 % polyacrylamide gel 서, 8예(1 3.7 %)가 양성을 나타내었다. 한편 HSV 에서 전기영동 시킨 후 ethidium bromide로 염색하여 PCR양성이 나온 8예를 제한효소 Ava 11 로 처리하여 DNA의 band를 확인하고 HSV의 형별을 구분하였다 12 % polyacrylamide gel로 분석 한 결과, HSV 1 형에 서는 206 bp, 183 bp, 87 bp 등 3개로 PCR산물이 절단

m.

실 험 성 적 되었으며, HSV 11 형에서는 389 bp, 87 bp 등 2개의 DNA단편이 확인되었다 (Table 2). 또한 양성이 나온 6

1. HSV 효소면역측정법의 결과 예 중에서 HSV 1 형이 6예(1 0.3 %), HSV 11 형이 2예

(3.5 %)로 판명되어, HSV 1 형이 HSV 11 형에 비해 대상검체 뇌척수액 58예 중 효소면역 측정법에 의한 높은 양성률올 보였다 (Table 1). Fig. 1 은 HSV PCR을

(4)

M 1 2 3 4 M1234

Fig. 1. Amplified DNA fragments of HSV using PCR in Fig. 2. Detection of Herpes Simplex Virus type 1 and II standard strain and clinical CSF sample determined by 2 DNA by PCR - RFLP in standard strain and clinical CSF

% agarose gel. sample determined by 12 % polyacrylamide gel.

M: Molecular Weight Marker(cþX174/Hinf 1) M: Molecular Weight Marker(cþX174/Hae ill) lane 1 : Positive control(HSV A549) lane 1 : Positive control(HSV A549)

lane 2 : Negative control la.ne 2 : HSV type 1 : 206 bp, 183 bp, 87 bp lane 3 : HSV negative sample lane 3 : HSV type II : 389 bp, 87 bp lane 4 : HSV positive sample lane 4 : Negative control

Table 2. The DNA fragments of HSV 1 and II restricted 도 될 수 있다 15) 뇌 척 수액 에 서 HSV는 급성 헤 르페

by Ava II 성 뇌막염환자의 경우에서만 매우 드물게 분리된다 16)

헤르페스성 뇌막염의 경우는 뇌척수액 중의 항체의 측 정으로 진단의 근거가 된다 18) 일반적으로 뇌척수액 중 의 항체는 혈청 중의 항체가 뇌관 사이로 통과해서 유 입되는 것으로 추정되는데, 그 항체가는 혈청 항체가

의 1/140이라고 알려져 있다 17) 따라서 혈청 중에 특

실시하여 476 bp의 PCR산물을 나타낸 것이며, HSV 히 높은 항체가 존재하지 않는 한, 뇌척수액 중의 항 I 형과 HSV 11 형을 제한효소로 처리한 후 12 % poly- 체는 통상 검출되지 않는다. 본 실험에서 시도한 PCR

HSV PCR DNA fragment(bps)

by AvaII 206, 183, 87 Type

HSV 1 HSV II

product(bps) 476

476 389, 87

acrylamide gel로 전 기 영 동한 각각의 DNA단편 Fig.

2에 나타내었다.

N.

단순 헤르페스 바이러스는 생식기 감염, 각질염, 결 막염, 전신성 피부염과 폐렴 등 임상적으로 심각한 질 병을 일으킬 수 있는 바이러스이다. 뿐만 아니라 자궁 내막염, 신생아감염 및 뇌염 등의 중증 감염의 원인체

법은 검출률이 낮은 뇌척수액 중의 HSV의 증명이 가 능하며, 산모의 수직 이환을 의심할 경우 양수로도 측 정할 수 있고, HSV감염의 조기진단이 가능하므로 임 상에 매우 유용한 검사방법이 될 수 있을 것이다. 저 자들은 다양한 PCR기법 중에서 최근 의학 및 여러 생 명공학 분야에서 다양하게 사용되고 있는 중합효소연 쇄반응-제한효소절편다형성 (PCR-RFLP) 방법을 이용 하여 HSV DNA를 증폭하고, HSV 1 형과 H 형의 구 분을 시도하였다. 효과적인 PCR을 실시하기 위해서는

1 l 4

n

(5)

무엇보다도 미량의 DNA를 오염과 손실없이 추출하는 PCR검사를 동시에 실시하였을 때 병태의 파악이 더욱 것이 중요하다. 본 실험에서 비교하였던 세 가지 DNA 용이하리라고 사료된다19, 20) 향후 더 많은 수의 검체로 추출방법 중 phenol추출방법과 silica방법에서는 동일하 써, 신생아의 HSV감염, 헤르페스성 전신감염과 헤르페 게 58예 중 8예(1 3.8 %)에서 양성을 나타내어 매우 스성 뇌막염 둥 질환별로 분류하여, 동일한 환자의 혈 높은 민감도를 보여 주었다. 반면 boiling법은 추출과정 청과 뇌척수액에서 동시에 HSV PCR을 실시하여 그 이 간단하여 짧은 시간에 추출이 가능했지만 6예(10.3 결과를 비교한다면, 결과를 임상에서 이용하는데 보다

%)에서만 양성을 나타내어, 검체를 원심분리한 후 상 큰 도움이 될 수 있을 것이라고 사료된다.

충을 버리는 과정에서 DNA의 손실이 비교적 컸던 것

으로 판단된다. 저자들은 현재 HSV-PCR 검사를 위 V. DNA 추출방법으로 silica방법을 택하여 사용하고

있는데, 그것은 DNA의 손실이 적을 뿐 아니라 guam- 뇌척수액 58검체에서 효소면역법을 이용하여 HSV-

dinium thiocyanate로서 세포를 용해 시 키 고 유리 IgG, HSV -IgM을 측정 하고, 동시 에 PCR-RFLP법 을 DNA를 silica입자에 홉착하므로서 PCR 저해제로서 작 실시하였다. HSV DNA를 추출하여 HSV DNA poly- 용할 물질들을 완전히 제거할 수 있고, 민감도는 phe- merase유전자에서 선택한 pnmer로 PCR을 실시하고,

nol방법에 봇지 않으면서 추출과정은 훨씬 간편하고 증폭된 PCR산물을 제한효소 AvaII로 처리한 후, 12 %

빠르다고 판단되었기 때문이다 polyacrylamide gel에 전기영동을 실시하여 절단된 본 실험에서 임상적으로 헤르페스성 뇌막염이 의심 DNA단편의 크기를 분석한 결과 다음과 같은 결론을 되는 뇌척수액 58검체를 효소면역법으로 항체를 측정 얻었다.

한 결과 모두 음성으로 나왔으나, PCR-RFLP방법으 로 하였을 때 58예 중 8예(1 3.8 %)에서 양성이었으며 그 중 6예 가 HSV type 1 으로 나타났고, 2예 가 HSV

type 11 로 판명되었다. 여기서 효소면역법으로 측정한

항체와 PCR에서 전부 음성이 나온 경우에, 퍼indow"

기간일 가능성도 있고, 조직검사를 실시하지 않았으므 로 완전히 음성이라고 단정할 수는 없다고 본다 19) 특 히 본 방법은 비교적 간단하게 HSV 1, 11 의 구분이 가능하므로, 항체의 측정이 적합하지 않은 시기에 PCR방법을 이용한 HSV DNA의 검출은 임상진단에

1. 민감도가 높고 효과적인 DNA의 추출을 위하여 시도한 phenol방법, silica방법, boiling방법 세 가 지 DNA추출방법 중에 서 phenol방법 과 silica방법 에서는 PCR 양성율이 일치하였으며, boiling방법 에서는 위의 두 방법에 비하여 3.5 % 정도 낮은 양성률을 나타내었다.

2. PCR을 실시한 결과 양성대조와 검체에서 476 bp

의 PCR산물을 확인하였으며, 효소면역법으로

HSV 항체의 측정이 되지 않았던 뇌척수액 58검 체 중, 8예(1 3.8 %)에서 양성을 나타내었다. PCR

큰 역할을 할 수 있을 것이다 10, 20) 이러한 PCR방법을 양성예 중 HSV 1 형이 6예(1 0.3 %), HSV 11 형 임상실험실에서 유용하게 사용하기 위해서는 오염에 이 2예 (3.5 %)로 판명되어 HSV 1 형이 HSV 11 주의하여야 하며 반드시 음성과 양성대조를 세워 실험 형보다 높은 분포를 보였다.

의 정도관리를 실시해야 한다. 본 실험의 뇌척수액 58 본 실험의 결과 PCR-RFLP를 이용한 HSV의 진단 예의 PCR실험에서 DNA를 넣지 않은 음성대조에서는 은 혈청진단법과 배양법을 보완한 최신 분자생물학적

DNA band를 볼 수 없었고, 양성대조에서는 분명한 방법으로, 비교적 간편하고 민감도가 우수하므로 뇌척

HSV PCR산물을 나타내었다. 뇌척수액에서는 HSV 수액과 같이 바이러스의 함량이 적은 검체로 HSV

DNA가 1-4주 후에 없어지며, 이것이 곧 질환이 완전 염을 진단할 경우 임상에서 유용성이 클 것으로 기대 히 치료된 것이라고 말할 수는 없으므로 항체검사와 된다.

(6)

REFERENCES 289-93, 1991.

9. Aurelius E. Herpes simplex encephalitis : Early di- 1. 조낙용, 박해준, 박송용, 문홍모 : Herpes simplex agnosis and immune activation in the acute stage

virus(HSV) 항원의 정 제 및 HSV 항체 (IgG, IgM) and during iong - term follow up. Scand J Infect

검사용 ELISA. Purification and use of Herpes Dis Suppl. 89 : 3-62, 1993.

simplex virus(HSV) Antigens for ELISA of Anti 10. Roger BB, Josephson SL and Mak SK.: Detec- - HSV 1 gG and IgM. 한바이 러 스학회 23 : tion of herpes simplex virus using the polymerase

123-9, 1993. chain reaction followed by endonuclease cleavage.

2. 최철석, 김은아, 이경옥, 이규범, 이연태 : 중합효소 연 Am J Pathol. 139: 1-6, 1991.

쇄반웅올 이용한 신생아 소변에서 Cytomegalovirus 11. Troendle AJ, Demmler GJ and Buffone GJ.:

측정 및 방법. 대한 바이러스학회지 24 : 71- 5, 1994. Rapid diagnosis of herpes simplex virus encephali- 3. Boerman RH, Arnoldus EPJ, Raap AK, Bloem

BR, Verney M, van Gemert G and Peters ACB.

tis by using the polymerase chain reaction. J Pediatr. 123 : 376-80, 1993.

: Polymerase chain reaction and viral culture 12. H Hoon, Kim SY, Chung Y J and Kim TG.: A techniques to detect HSV 1 n small volumes of

cerebrospinal fluid: An experimental mouse en- cephalitis study. J Virol Meth. 25: 189-198,

1989.

4. Kawana T, Kawaguchi T and Sakamoto S. : Clin- ical and virological studies on genital herpes.

Lancet 2 : 964, 1976.

5. Roger BB, Josephson SL, Mak SK and Sweeney P J. : Polymerase chain reaction amplification of herpes simplex virus DNA from clinical samples.

Obstet Gynecol. 79 : 464-9, 1992.

6. Kohl S. A hypothesis in the pathophysiology of

study on Allele Frequencies of HLADR, DQ, DP by Two - Step PCR in Korean .. K J Immuno 14 : 2,261-271, 1992.

13. Boom R, Sol CJA, Salimans MMM, Jansen CL, Wertheim - Van Dillen PME and Noordaa JVD. : Rapid and simple method for purification of nu- cleic acids. J Clin Microbiol. 28 : 495-503, 1990.

Cytomegalovirus in Urine Sample of Infant by Polymerase Chain Reaction. 대 한바이 러 스학회 24 : 71-5, 1994.

14. Baker DZ. Herpes and pregnancy: New manage- ment. Clin Obstet Gynecol. 33 : 253-7,1990.

neonatal herpes simplex virus encephalitis : clinical 15. Whitley RJ, Nahmias AJ, Vinstine AM, Fleming recurrence after asymptomatic primary infection.

Pediatr Infect Dis. 9 : 307 - 8,1990.

7. Vontver LA, Hickok DE, Brown Z, Reid L and

CL and Alford CA. : The natural history of her- pes simplex virus infection of mother and new- born. Pediatrics 66 : 489-94, 1980.

Corey L. : Recurrent genital herpes simplex virus 16. Goto T, Yamaguchi Y, Hashido M, Yoshikawa H infection in pregnancy: Infant outcome and fre- and Kawana T.: Diagnosis of genital herpes by quency of asymptomatic recurrences. Am J

Obstet Gynecol. 143 : 75-84, 1982.

Polymerase chain reaction amplification. Microbiol Immunol. 37 : 987 - 90, 1993.

8. Kimura H, Futamura M, Kito H et al. : Detection 17. Rowley AH, Whitley RJ, Lakeman FD and of viral DNA in neonatal herpes simplex virus in-

fection : frequent and prolonged presence in serum and cerebrospinal fluid. J Infect Dis. 164 :

- 83-

Wolinsky SM. : Rapid detection of herpes simplex virus DNA in cerebrospinal fluid of patients with herpes simplex encephalitis. Lancet 335: 440-1,

(7)

1990. Rapid diagnosis of herpes simplex encephalitis by 18. Ando Y, Kimura H, Miwata H, Kudo T, Shihata nested polymerase chain reaction assay of cere-

M and Morishima T.: Quantitative analysis of brospinal fluid. Lancet 337 : 189-92, 1991.

herpes simplex virus DNA in cerebrospinal fluid 20. Troendle AJ, Demmler GJ and Buffone GJ.:

of children with herpes simplex encephalitis. J Rapid ddiagnosis of herpes simplex virus encepha- Med Virol. 41 : 170-3, 1993. litis by using the polymerase chain reaction. J 19. Aurelius E, Johansson B and Skoldenberg B.: Pediatr. 123 : 376-80, .1993.

수치

Table  1.  The  positive  rates  of  HSV -PCR  using  three  dif- dif-ferent  DNA  extraction  methods  in  58  CSF  samples
Table  2.  The  DNA  fragments  of  HSV  1  and  II  restricted  도 될 수 있다 15)  뇌 척 수액 에 서 HSV는 급성 헤 르페  스

참조

관련 문서

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