Chromogenic In Situ Hybridization Analysis to Determinate HER-2/neu Status in Breast Carcinoma

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(1)대한외과학회지：제 66 권 제6호 Vol. 66, No. 6, June, 2004. □ 원 저 □. 유방암종에서의 HER-2/neu 유전자 검색을 위한 발색제자리부합화에 관한 연구 부산대학교 의과대학 병리학교실, 1외과학교실 1. 1. 1. 김지연․최경운․정윤주 ․곽희숙 ․배영태. Chromogenic In Situ Hybridization Analysis to Determinate HER-2/neu Status in Breast Carcinoma. practical and economical approach for determining the HER-2/neu stati in breast carcinomas. It is also a useful methodology for confirming the IHC results in paraffinembedded tumor samples, so offers a promising alternative to IHC in a routine diagnostic setting. (J Korean Surg Soc 2004;66:447-453). Jee Yeon Kim, M.D., Kyung Un Choi, M.D., Youn Joo Jung, M.D.1, Hi Suk Kwak, M.D.1 and Young Tae Bae, M.D.1. Key Words: Breast Carcinoma, HER-2/neu, Chromogenic In Situ Hybridization (CISH), Immunohistochemistry 중심 단어: 유방암종, HER-2/neu, 발색제자리부합화, 면 역조직화학염색. Purpose: The determination of HER-2/neu gene amplification has become necessary for the selection of breast cancer patients to undergo anti-HER-2/neu therapy, using a humanized monoclonal antibody. Chromogenic in situ hybridization (CISH) detection of the HER-2/neu gene, a newly developed method, utilizes a robust and unique-sequence DNA probe labeled with digoxygenin, which is sequentially incubated with antidigoxygenin fluorescein, antifluorescein peroxidase and diaminobenzidine. The aim of this study was to establish a CISH assay for the detection of HER-2/neu amplification. The results were compared with those of the immunohistochemistry (IHC) methods, most frequently used for detecting HER-2/neu alteration. Methods: CISH was performed in 4 groups of infiltrating breast carcinomas. Each group was comprised of 20 cases in which the HER-2/neu stati had previously been scored on a four value scale: 0, 1+, 2+ and 3+ by IHC. The results of CISH and IHC were compared for each tumor group. The HER-2/neu gene amplification detected by CISH was thpically visualized as large DAB-stained clusters or by many dots in the nucleus. Results: The concordance between the CISH and IHC was 95% (κ=0.901). Three IHC-positive cases (score 2+) showed no gene amplification and one IHC-negative case (score 1+) showed gene amplification by CISH. Conclusion: The current study showed excellent agreement between the CISH and IHC methods. CISH is an accurate,. ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ. Departments of Pathology and 1Surgery, College of Medicine, Pusan National University, Busan, Korea. 서. 론. HER-2/neu (c-erbB-2) 유전자는 티로신 키나아제 작용을 가진 transmembrane growth factor recepter로서 17q21 유전자 에 위치하며 세포 성장에 관한 세포내 신호 전달과 유전자 활성화에 관여한다.(1,2) HER-2/neu 암유전자는 Slamon 등 (3)이 처음으로 유방암종의 예후예측인자로 평가한 후, 유 방암종에서 나쁜 예후를 시사하는 것으로 알려져 있으며, 특히 유방암 치료에 대한 반응을 예상하는 인자로 각광받 Ⓡ 고 있다.(2,4-6) 최근에는 trastuzumb (HERCEPTIN ; Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA)이라는 HER-2/neu 에 대한 단클론성 항체 치료제가 개발되고, 전이 유방암종 환자에 높은 치료 효과가 보고되면서(7,8) HER-2/ neu의 검 색은 유방암종 환자 치료에 있어 필수적인 과정으로 여겨 진다. 따라서 HER-2/neu의 변화를 평가할 수 있는 정확하고 믿을 만한 측정 방법이 요구된다. HER-2/neu의 변화를 보기 위한 검색 방법으로는 Southern, Northern, Western blot 방법,(3,9) 효소면역측정법(ELISA), (10) 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction) (10,11) 등 의 다양한 방법이 있으나, 대개 외과 병리의 영역에서 볼 때 실용적이지 못한 면이 있다. 현재는 간편하고 경제적인 면역조직화학염색(immunohistochemistry)을 가장 많이 이용. 책임저자：최경운, 부산시 서구 아미동 1가 10번지 ꂕ 602-739, 부산대학교병원 병리과 Tel: 051-240-7422, Fax: 051-240-7579 E-mail: [email protected] 접수일：2004년 2월 3일, 게재승인일：2004년 4월 16일. 447.

(2) 448. 대한외과학회지：제 66 권 제 6 호 2004. ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ. 하고 있다.(12) 그러나 면역조직화학염색은 HER-2/neu 단백 의 과발현을 관찰하는 것으로서 사용되는 항체의 종류만 30여 가지에 달하며, 민감도와 특이도, 판정 기준에 따라 다 른 결과를 보여 표준화에 대한 노력을 계속하고 있다.(9-16) 또한 HER-2/neu 유전자의 경우 단백의 과발현보다는 유전 자의 증폭이 항암제에 대한 효과와 예후를 더 정확히 예측 할 수 있는 지표가 되므로,(13) HER-2/neu 유전자의 증폭 여 부를 확인할 수 있는 검색 방법이 필수적이다. 형광제자리 부합화(fluorescence in situ hybridization, FISH) 검색 방법은 포르말린 고정 파라핀 포매 조직에서 HER-2/ neu 변화를 검색하는 데 있어 면역조직화학염색보다 민감도와 특이도 및 정확도가 우월하고 안정성이 높을 뿐 아니라, 소량의 조 직만으로도 검사가 가능하다는 장점을 가지고 있어 HER-2/ neu 유전자의 증폭 여부를 검색하는 데 우선적으로 추천되 고 있다.(9,10,13,15,17) 그러함에도 형광제자리부합화를 이 용한 HER-2/neu 유전자 증폭 분석이 실질적으로 일반화되 고 있지 못한 이유는 검사에 사용되는 탐색자(probe)와 시 약이 고가이고 형광물질을 분석하기 위하여 특수 현미경 및 필터가 필요하며 형광신호가 보존되지 못하고 급속하게 퇴색되는 단점 때문이다. 최근에 새롭게 제시된 발색제자리부합화(chromogenic in situ hybridization, CISH) 방법은 면역조직화학염색방법과 유사한 peroxidase 반응을 통해 비형광성 염색체 DNA 탐색 자(probe)의 신호를 광학 현미경을 통해 관찰하는 방법으로 형광제자리부합화와 비교하여 많은 장점이 보고되고 있 다.(14,16,18-23) 본 연구에서는 발색제자리부합화와 면역조 직화학 염색을 이용하여 HER-2/neu 암유전자 증폭과 단백 질 과발현의 결과를 비교 분석하면서 발색제자리부합화의 유용성을 알아보고자 한다.. 방. 법. 1) 연구대상 2001년 1월부터 2002년 6월까지 부산대학교 병원에서 유 방암종으로 진단 후 유방암종 절제술을 받은 환자 중 침윤 관암종으로 최종 진단된 조직을 대상으로 하였다. HER-2/ neu 면역조직화학염색의 결과가 0, 1+, 2+, 3+인 조직 각 각 20예씩 총 80예에서 HER-2/neu 유전자에 대한 발색제자 리부합화를 시행하였다. 2) 면역조직화학염색 10% 중성 완충 포르말린에 고정한 후 파라핀에 포매한 조직을 4μm의 두께로 박절하여 자일렌으로 탈파라핀하고 100%, 90%, 75% 및 50% 에탄올에 처리하여 함수시켰다. 10 mM citrate 완충액(pH 6.0)에서 가열한 후 과산화수소수 로 5분간 처리하여 내인성 과산화효소의 작용을 차단하였 다. Tris 완충액으로 세척한 후 일차 항체인 HER-2/neu 단백. (rabbit anti-human monoclonal antibody, Zymed, San Francisco, USA 1：100)을 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 일 차 항체 반응 후 Tris 완충액으로 세척하고 biotin이 부착된 이차 항체(Zymed, San Francisco, USA 1：300)와 작용시킨 후 통상적인 avidin-biotin complex법으로 20분간 반응시켰 다. 발색제는 3-amino-9-ethyl crabazole (AEC)을 사용하였고 Mayer's hematoxylin으로 대조 염색한 후 봉입하였다. 종양 세포의 세포막에 갈색으로 염색되는 정도에 따라 점수를 주어 평가하였다. 음성 반응을 나타내거나 10% 미만의 종 양세포에서 약하게 염색되는 경우를 0, 종양세포의 10% 이 상에서 염색은 되었으나 세포막의 일부가 약하게 염색된 경우를 1+, 종양세포의 10% 이상에서 세포막의 전체가 중 등도로 염색된 경우를 2+, 종양세포의 10% 이상에서 세포 막의 전체가 강하게 염색된 경우를 3+로 판독하였고, 그 중 2+와 3+인 경우를 과발현으로 간주하였다(Fig. 1). 3) 발색제자리부합화 면역조직화학염색을 시행한 조직에서 연속적으로 4μm 의 두께로 박절한 후 자일렌으로 탈파라핀화하였다. SpotLightFFPE reagent kit (Zymed Inc., South San Francisco, CA) o 를 사용하여 92∼100 C를 유지하면서 15분간 완충액에서 전처리하고 20분간 식힌 후 PBS (phosphate-buffered saline) 로 세척한다. 실온에서 FFPE 소화효소 100μl를 10분간 적 용시키고 PBS로 수세한 후 70%, 80%, 95%, 100% 알코올 순으로 탈수하였다. Digoxigenin-labeled HER-2/neu probe o (Zymed) 15μl를 적용한 후 94 C에서 3분간 변성시키고 부 o 합화를 위해 37 C로 18시간 동안 유지하였다. 부합화 후 슬 o 라이드는 0.5XSSC (standard saline citrate)에서 75 C로 5분간 세척하고, 실온에서 PBS/0.2%Tween20 용액으로 세척하였 다. 부합화 신호는 CISH detection kit (Zymed)를 이용하는 데, 먼저 실온에서 10분간 차단제를 적용한 후 fluoresceinlabeled antidigoxygenin, peroxidase-conjugated antifluorescein 에 60분간 순차적 적용을 시행하였다. DAB에 60분간 실온 에서 처리하고 핵은 hematoxylin으로 대조염색하였다. 음성 대조군은 탐색자 대신에 PBS를 처리하여 이용하였다. 발색 제자리부합화에 의한 HER-2/neu 유전자 증폭의 평가는 400 배 광학 현미경에서 관찰하여 Tanner 등(18)의 평가기준에 따라 시행하였다. 각 핵에서 1개 이상 5개 이하의 유전자 복제수(gene copy number)를 보이는 경우 증폭이 없다고 하 였고, 50% 이상의 종양세포에서 각 핵당 6개 이상의 유전자 복제수가 관찰되거나 큰 유전자 복제 무리(large gene copy cluster)가 관찰될 때 유전자 증폭이 있다고 하였다. 4) 통계학적 분석 통계분석은 Statistical Package for the Social Science (SPSS) 11.0 (Systat, Chicago, USA) 통계 프로그램을 이용하 였고, Spearman's correlation coefficient (kappa)에 의하여 발.

(3) 김지연 외：유방암종에서의 HER-2/neu 유전자 검색을 위한 발색제자리부합화에 관한 연구. 449. ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ. A. B. C. D. Fig. 1. Immunohistochemical detection of HER-2/neu protein in breast carcinoma. (A) A 0-score carcinoma shows no staining. (B) A 1+carcinoma shows faint/barely perceptible membrane staining. (C) A 2+carcinoma shows weak to moderate complete membrane staining. (D) A 3+carcinoma shows strong, complete membrane staining (×400).. 색제자리부합화와 면역조직화학염색 결과의 일치성에 대 한 상관관계를 구하였다. Kappa 계수가 1에 근접할수록 완 전한 일치에 가깝고 0.4 이하는 불량한 일치로 보았다.. 결. 경우 4예 중 1예는 면역조직화학염색상 음성(1+)이었으나 발색제자리부합화 결과에서 유전자 증폭을 보였고, 3예는 면역조직화학염색상 양성(2+)이었으나 발색제자리부합화 결과에서 유전자 증폭이 관찰되지 않았다(Table 1).. 과 고. 발색제자리부합화 시행 결과 HER-2/neu 유전자가 5개 이 하의 유전자 복제수를 보이는 경우 유전자 증폭이 없다고 하였고(Fig. 2A), 6개 이상인 경우 또는 큰 유전자 복제 무리 가 관찰될 때 유전자 증폭이 있다고 하였는데(Fig. 2B), 일 부 간질 섬유모세포, 혈관내피세포 또는 림프구에서 각 핵 당 한 개 또는 두개의 부합화 신호를 보였다. 38예에서 발색제자리부합화 시행 시 유전자 증폭이 관찰 되었고, 면역조직화학염색 결과와 일치를 보인 경우는 76 예(일치율: 95%)였으며, kappa 계수는 0.901이었다. 발색제 자리부합화와 면역조직화학염색의 결과가 일치하지 않은. 찰. HER-2/neu 유전자는 유방암종에 있어 독립적이고 강력 한 예후인자요소로서의 가치와 함께 항암 치료의 표적이 되므로,(4-6) 유방암종 조직에서 HER-2/neu 변화 검색에 대 한 실험적, 임상적 관심은 매우 크다. HER-2/neu 변화를 보기 위한 여러 가지 검사 방법 중 면 역조직화학염색법은 간편하고 경제적이어서 널리 이용되 TM 고 있고, HercepTest (Dako, Carpinteria, CA, USA)는 항 HER-2/neu 치료 대상을 찾는 데 있어 진단적 가치가 있는 검사로 미국 FDA의 승인을 받았다.(12) 그러나 면역조직화.

(4) 450. 대한외과학회지：제 66 권 제 6 호 2004. ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ. A. B. Fig. 2. Chromogenic in situ hybridization (CISH) detection of the HER-2/neu oncogene in breast carcinoma. (A) A carcinoma with no amplification show a few gene copies (＜5) per nucleus (×400). (B) A carcinomas with HER-2/ neu gene amplification show numerous gene copies (≥6) per nucleus. Inset: large gene copy clusters in nucleus (× 1,000).. Table 1. Correlation between results of CISH and IHC for the detection of HER-2/neu amplification and overexpression in breast carcinomas ꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚ IHC Total CISH ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ 0 +1 +2 +3 ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ No amplification 20 19 3 0 42 Amplification 0 1 17 20 38 Total 20 20 20 20 80 ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ CISH = chromogenic in situ hybridization; IHC = immunohistochemistry.. 학염색은 사용되는 항체의 종류에 따라 민감도와 특이도가 차이를 보이고, 판정 기준에 따라 다른 결과를 보이는 문제 점이 있다.(9-16) 무엇보다도 HER-2/neu 유전자의 경우 단 백질의 과발현보다는 유전자의 증폭이 항암제에 대한 효과 와 예후를 더 정확히 예측할 수 있는 지표가 된다는 점에서 (13) HER-2/neu 유전자의 증폭 여부를 확인하는 것이 중요 하다. 면역조직화학염색 시 다클론성 항체를 사용하면 단 클론성 항체를 사용할 때보다 과발현율이 높게 나타나고 위양성률로 높게 보인다.(12,13,16) 실제 항암 치료 적용의 보고에 의하면, 면역조직화학염색 결과를 토대로 항HER-2/ neu 치료대상을 선택했을 때 2+ 점수를 보이는 환자의 경 우 치료 효과가 기대만큼 좋지 않았던 예가 있고, 면역조직 화학염색에서 다클론성 항체를 사용하는 것보다 단클론성 항체 사용 시 결과가 치료 효과와 더 잘 일치했다.(10,13) 또한 형광제자리부합화 양성, 면역조직화학염색 음성인 예 들의 예후가 형광제자리부합화와 면역조직화학염색에서. 모두 양성인 예들과 유사하고, 형광제자리부합화 음성인 예들은 면역조직화학염색상 양성소견을 보이더라도 생존 율은 형광제자리부합화와 면역조직화학염색에서 모두 음 성인 예들과 다르지 않았다.(13) 따라서 HER-2/neu 단백질 의 과발현을 판단하기 위한 면역조직화학염색의 표준화와 더불어 이를 보완 또는 대체할 수 있는 방법에 대한 연구가 이어지고 있으며, HER-2/neu 유전자의 증폭을 직접 확인할 수 있는 방법이 필요하다. HER-2/neu 유전자의 증폭 여부를 검색하는 방법은 다양 하지만, 그 중 제자리부합화가 가장 민감도와 특이도가 좋 다.(9,10) 현재는 형광제자리부합화(INFORM from Oncor/ Ventana and PathVysion from Vysis)가 미국 FDA의 승인을 받았지만,(16,20) 아직까지 고가의 시약 및 장비 때문에 일 반화되지 못하고 있는 가운데, 많은 병리학자들이 일반적 인 광학 현미경으로 볼 수 있는 방법으로의 변형을 모색하 고 있다.(20) 본 연구는 포르말린 고정 파라핀 포매 조직에.

(5) 김지연 외：유방암종에서의 HER-2/neu 유전자 검색을 위한 발색제자리부합화에 관한 연구. 451. ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ. 서 HER-2/neu 유전자 증폭을 검사하는 데 있어 과산화효소 (peroxidase)를 기본으로 하는 효소적 검색 방법이면서 일반 적인 광학 현미경으로 관찰할 수 있는 발색제자리부합화의 유용성을 알고자 하는 것이다. 발색제자리부합화는 digoxigenin 표지 탐색자를 사용하고 여기에 항digoxigenin 형광 물질과 항형광물질과산화효소를 단계적으로 붙이는 방식 으로 형광제자리부합화와 면역조직화학염색 유사 반응을 연결한 것이다.(16,20,24) 형광을 이용한 검색 방법이 좀 더 유용하게 여겨져 왔던 주된 이유는 형광 현미경을 사용하여 관찰 시 부합화 신호 의 신호 대 잡음 비율(signal-to-noise ratio)이 높다는 이점 때 문이었고, 효소를 이용하고 광학 현미경으로 관찰하는 발 색제자리부합화는 상대적으로 민감도가 낮고 광학 현미경 으로 관찰하기에 충분한 정도의 부합화 신호를 얻기가 어 렵다는 단점이 지적되어 왔다. 그러나 좀 더 특이적인 부합 화 반응을 일으킬 수 있는 변형된 탐색자의 개발(예; Alu and LINE elements 제거), 마이크로파를 이용한 전처치와 소 화 효소 처리, 그리고 기존의 직접적인 면역검출법(antidigoxigenin perosidase와 diaminobenzidine을 사용)을 보완한 삼단계 검출 방법의 개발(anti-digoxigenin-fluorescein, antifluorescein peroxidase, 그리고 diaminobenzidine chromogen을 사용) 등 기술적인 보완을 이루어 신호를 증폭시키게 되었 다.(16,18,20,24-26) 또한 발색제자리부합화는 형광제자리부 합화에 비해 많은 장점을 가지고 있다.(14,16,18-23) 첫째, 헤마톡실린 또는 메칠그린을 이용하여 대조염색을 하므로 유전자 증폭 여부를 조직병리소견과 함께 관찰할 수 있어 서 형광제자리부합화 시행 시 생길 수 있는 표본 오차(sampling error)를 방지할 수 있다. 다시 말하면, 형광제자리부합 화 방법을 시행할 때 H&E 슬라이드에서 침윤관암종 부위 를 함께 평가해야 하는 번거로움을 피할 수 있다. 둘째, 발 색제자리부합화는 통상의 광학 현미경으로 검색이 가능하 여 형광 현미경이 필요하지 않다. 형광 현미경은 고가일 뿐 아니라 검사의 판독을 시행하는 병리의사에게 익숙하지 못 한 단점도 있다. 셋째, 발색제자리부합화의 신호는 영구적 이다. 형광제자리부합화의 형광 신호는 일반적으로 길어야 o 수주 정도 유지되고 이후 소실될 뿐 아니라 보관도 4 C 이 하에서 이루어져야 한다. 넷째, 발색제자리부합화는 검사 방법이 더 쉽고 시간이 적게 걸리며, 결과의 판독이 형광제 자리부합화보다 빠르다. 마지막으로 발색제자리부합화의 탐색자와 검출 키트(detection kit)가 더 저렴하므로 경제적 이다. 현재 몇몇 연구에서 발색제자리부합화와 형광제자리 부합화 검출 방법의 일치도가 100%에 가깝다고 보고되 고,(18,20-23) 면역조직화학염색과의 비교에서도 좋은 일치 도를 보여 주고 있다.(14,19-21) 본 연구의 결과에서도 검사 의 일치율이 95%이며, kappa 계수가 0.901이다. 발색제자리부합화는 판독 시 다섯 개 이하의 유전자 복 제수를 보일 때는 유전자 증폭이 없는 것으로 보는데, 이것. 은 진정한 유전자 증폭과 뭇염색체(polysomy)를 감별하기 위해서이다. 실제 침윤관암종에서 17번 염색체의 뭇염색체 를 보일 경우가 31%이고, HER-2/neu 유전자 증폭을 가진 침윤관암종의 경우 뭇염색체의 비율이 67%라고 보고되었 다.(16) 발색제자리부합화를 좀 더 정확하게 판단하기 위해 형광제자리부합화에서와 같이 HER-2/neu 유전자 탐색자와 기준 유전자 탐색자(reference gene probe), 즉 17번 유전자 중심절을 함께 사용하자는 주장이 있다. 그러나 이러한 방 법론은 좀 더 기술적 뒷받침이 필요하고 아직까지 큰 이점 이 밝혀지지 않았으며 오히려 결과판독에 시간이 더 걸리 게 만들 수 있다.(16,18-20) 현재 HER-2/neu 변화 검색 방법에 대한 임상적 적용 체계 (algorithm)는 면역조직화학염색결과가 2+인 경우 형광제 자리부합화를 시행하는 것을 기본으로 하고 있다. 즉, 면역 조직화학염색결과에서 3+인 예는 거의 100% 유전자 증폭 을 보여주지만, 2+인 경우 일부에서 유전자 증폭을 보여주 지 않는 경우가 있다.(13,17,19,21) 유전자 증폭 없이 HER-2/ neu 단백의 과발현이 나타나는 경우가 2∼6% 정도 보고되 는데, 이는 전사단계 등에서 유전자 증폭없이 변화를 보이 는 경우일 수 있고, 또한 제자리부합화로 검출되지 않는 낮 은 수준의 유전자 증폭 때문이다.(9,13,16) 본 연구에서도 면 역조직화학염색상 3+인 경우는 20예 모두 유전자 증폭을 보여주었으나, 2+인 경우 중 3예(15%)에서 유전자 증폭을 보이지 않았다. 적절한 임상적 적용 체계 마련을 위한 연구에서 Sapino 등(14)은 두 가지 단클론성 항체를 이용하여 면역조직화학 염색을 시행하고 이중 점수 방식(double scoring system)을 적용하여 그 합으로 이용하여 선별검사를 하자고 주장하였 다. 즉 HER-2/neu 단백의 세포내 영역과 세포외 영역을 각 각 인식하는 단클론성 항체를 사용하여 각각에 0에서 3+ 까지 평가하는 이중 점수 방식에서 합이 0∼2+인 경우 유 전자 증폭이 없고 6+인 경우 모두 유전자 증폭을 보여 이 들을 제외한 경우에 추가적인 제자리부합화검사를 시행하 자고 하였다. 이 때 민감도가 100%를 나타내어 선별 검사로 서 시행할 가치가 있다고 주장하였다. Falo 등(15)은 민감도 가 높아 음성예측률이 좋은 다클론성 항체와 특이도가 높 은 단클론성 항체를 이용하여 단클론성 항체에 양성을 보 이는 경우 유전자 증폭을 보일 것으로 판단하여 일차적으 로 형광제자리부합화 검사를 시행하지 않는 것으로 선별해 내고, 단클론성 항체에 음성인 경우 다클론성 항체를 적용 하여 음성이면 이번에는 유전자 증폭이 없을 것으로 판단 하여 형광제자리부합화 검사를 시행하지 않는 것이 좋겠다 고 주장하였다. 즉, 단클론성 항체 음성이고 다클론성 항체 양성인 경우에 형광제자리부합화 검사를 시행할 대상으로 삼을 것을 주장하였다. 한편 병리조직학적 소견 중 유전자 증폭을 시사하는 소견을 밝혀내어 불필요한 추가적인 검사 를 방지하려는 노력이 있는데, 암종이 저등급이거나 또는.

(6) 452. 대한외과학회지：제 66 권 제 6 호 2004. ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ. 침윤성소엽암종인 경우 유전자 증폭이 나타나지 않는다는 보고가 있지만 아직 정립되지는 못하였다.(14) 본 연구의 결과는 발색제자리부합화가 형광제자리부합 화와 면역조직화학염색의 기술적이고 실제적인 제한점을 극복할 수 있어 앞으로 HER-2/neu 변화를 검색하는데 새로 운 접근 방법으로 강력하게 제시될 수 있는 가능성을 보여 준다. 그러나 저자들의 경험에 의하면, 발색제자리부합화 결과 판독 시 부합화 신호의 강도가 최근의 기술적 보완에 도 불구하고 형광제자리부합화 검사에 비하여 아직 충분하 지 못하여 개선이 필요하겠고, 추가적으로 많은 증례들의 발색제자리부합화와 형광제자리부합화 결과를 비교 검토 하여 검사의 신뢰성을 확보하여야 하겠다. HER-2/neu vaccines의 치료 대상 선택에 있어 유전자 증폭을 확인하는 것 이 더 정확한 지표가 된다는 점과, 이를 위한 형광제자리부 합화가 경제적으로 면역조직화학염색을 대체하기 어렵기 때문에 최근 복잡한 임상적 적용 체계 정립에 대한 고민이 이어지고 있는 점을 고려한다면, 발색제자리부합화는 면역 조직화학염색에 대한 보조적인 검사로서뿐만이 아니라 대 체 검사로서 추천될 만큼 정확하고 간편하며 경제적인 검 사 방법이다.. 결. 론. HER-2/neu 면역조직화학염색의 결과가 0, 1+, 2+, 3+ 인 침윤관암종 조직을 각각 20예씩 선택하여 총 80예에서 HER-2/neu 유전자에 대한 발색제자리부합화를 시행하였다. 38예에서 발색제자리부합화 시행 시 유전자 증폭이 관찰 되었고, 면역조직화학염색 결과와 일치를 보인 경우는 76 예(일치율: 95%)였으며, kappa 계수는 0.901이었다. 발색제 자리부합화와 면역조직화학염색의 결과가 일치하지 않은 경우 4예 중 1예는 면역조직화학염색상 음성(+1)이었으나 발색제자리부합화 결과에서 유전자 증폭을 보였고, 3예는 면역조직화학염색상 양성(+2)이었으나 발색제자리부합화 결과에서 유전자 증폭이 관찰되지 않았다. 본 연구의 결과는 HER-2/neu 유전자 증폭을 검출하는 데 있어 발색제자리부합화가 정확하고 간편하며 경제적인 검 사 방법임을 보여주므로 향후 HER-2/neu vaccines의 치료 대상 선택에 면역조직화학염색에 보조적인 검사로 추천하 고, 나아가 대체 검사로서의 가능성을 제시한다.. REFERENCES 1) Shih C, Padhy LC, Murray M, Weinberg RA. Transforming genes of carcinomas and neuroblastoma introduced into mouse fibroblasts. Nature 1981;290:261-4. 2) Lohrisch C, Piccart M. An overview of HER2. Semin Oncol 2001;28:3-11.. 3) Slamon DJ, Clark GM, Wong SG, Levin WJ, Ullrich A, McGuire WL. Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene. Science 1987;235:177-82. 4) Carlomango C, Perrone F, Gallo C, De Laurentis M, Lauria R, Marabito A, et al. c-erbB-2 overexpression decreases the benifit of adjuvant tamoxifen in early stage breast cancer without axillary lymph node metastases. J Clin Oncol 1996;14:2702-8. 5) Houston SJ, Plunkett TA, Barnes DM, Smith T, Rubens RD, Miles DW. Over expression of c-erbB-2 is an independent marker of resistance to endocrine therapy in advanced breast cancer. Br J Cancer 1999;79:1220-6. 6) Park SY, Lim MK, Kang SH, Bae YK, Kim DS, Kwun KB, et al. C-erbB-2 expression predicts tamoxifen efficacy in breast cancer patients. J Korean Surg Soc 2003;65:95-100. 7) Vogel CL, Cobleigh MA, Tripathy D, Gutheil JC, Harris LN, Fehrenbacher L, et al. Efficacy and safety of Trastuzumab as a single agent in first-line treatment of HER-2 overexpressing metastatic breast cancer. J Clin Oncol 2002;20:719-26. 8) Vogel CL, Franco SX. Clinical experience with trastuzumab (herceptin). Breast J 2003;9:452-62. 9) Pauletti G, Godolphin W, Press MF, Salmon DJ. Detection and quantitation of HER-2/neu gene amplification in human breast cancer archival material fluorescence in situ hybridization. Oncogene 1996;13:63-72. 10) Bartlett JMS, Mallon E, Cooke T. Molecular diagnostics for determination of HER2 status in breast cancer. Curr Diag Pathol 2003;9:48-55. 11) Merkelbach-Bruse S, Wardelmann E, Behrens P, Losen I, Buettner R, Friedrichs N. Current diagnostic methods of HER2/neu detection in breast cancer with special regard to realtime PCR. Am J Surg Pathol 2003;27:1565-70. 12) Jacobs TW, Bown AM, Yaziji H, Barnes MJ, Shinitt SJ. Specificity of HerceptTest in determining HER-2/neu status of breast cancers using the United States Food and Drus Administration-approved scoring system. J Clin Oncol 1999;17: 1983-7. 13) Pauletti G, Dandekar, Rong H, Ramos L, Peng H, Seshadri R, et al. Assessment of methods for tissue-based detection of the HER-2/neu alteration in human breast cancer: A direct comparison of fluorescence in situ hybridization and immunohistochemistry. J Clin Oncol 2000;18:3651-64. 14) Sapino A, Coccorullo Z, Cassoni P, Ghisolfi G, Gugliotta P, Bongiovanni M, et al. Which breast carcinomas need HER-2/ neu gene study after immunohistochemical analysis? Results of combined use of antibodies against different c-erbB2 protein domains. Histopathology 2003;43:354-62. 15) Falo C, Moreno A, Lloveras B, Figueras A, Varela M, Escobedo A. Algorithm for the diagnosis of HER-2/neu status in breast infitrating carcinomas. Am J Clin Oncol 2003; 26:465-70..

(7) 김지연 외：유방암종에서의 HER-2/neu 유전자 검색을 위한 발색제자리부합화에 관한 연구. 453. ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ 16) Zhao J, Wu R, Au A, Marquez A, Yu Y, Shi Z. Determination of HER2 gene amplification by chromogenic in situ hybridization (CISH) in archival breast carcinoma. Mod Pathol 2002;15:657-65. 17) Park K, Kim J, Lim S. Comparing fluorescence in situ hybridization and immunohistochemistry to determinate the HER-2/neu status in breast carcinoma. Kor J Pathol 2003;36: 243-8. 18) Tanner M, Gancberg D, Di Leo A, Larsimont D, Rouas G, Piccart MJ, et al. Chromogenic in situ hybridization: a practical alternative for fluorescence in situ hybridization to detect HER-2/neu oncogene amplification in archival breast cancer samples. Am J Pathol 2000;157:1467-72. 19) Kumamoto H, Sasano H, Taniguchi T, Suzuki T, Moriya T, Ichinohasam R. Chromogenic in situ hybridization analysis of HER-2/neu status in breast carcinoma: application in screening of patients for trastuzumab (HerceptinⓇ) therapy. Pathol Int 2001;51:579-84. 20) Dandachi N, Dietze O, Hause-Kronberger C. Chromogenic in situ hybridization: a novel approach to a practical and sensitive method for the detection of HER2 oncogene in archival human breast carcinoma. Lab Invest 2002;82:1007-14. 21) Arnould L, Denoux Y, MacGrogan G, Penault-Lolrca F, Fiche. 22). 23). 24). 25). 26). M, Treilleux I, et al. Agreement between chromogenic in situ hybridization (CISH) and FISH in the determination of HER2 status in breast cancer. Br J Cancer 2003;88:1587-91. Gupta D, Middleton LP, Whitaker MJ, Abrams J. Comparison of fluorescence and chromogenic in situ hybridization for detection of HER-2/neu oncogene in breast cancer. Am J Clin Pathol 2003;119:381-7. Park K, Kim J, Lim S, Han S, Lee JY. Comparing fluorescence in situ hybridization and chromogenic in situ hybridization methods to determine the HER2/neu status in primary breast carcinoma using tissue microarray. Mod Pathol 2003;16: 937-43. Hopman AH, Claessen S, Speel EJ. Multi-colour brightfield in situ hybridization on tissue sections. Histochem Cell Biol 1997;108:291-8. Davison JM, Morgan TW, Hsi BL, Xiao S, Fletcher JA. Substracted, unique-sequence, in situ hybridization: experimental and diagnostic applications. Am J Pathol 1998;153: 1401-9. Bull JH, Harnden P. Efficient nuclear FISH on paraffinembedded tissue sections using microwave pretreatment. Biotechniques 1999;26:416-8, 422..

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