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이학 석사학위 논문
당뇨병성 근육 감소증의 기작 연구 및 치료 약물 모색
아 주 대 학 교 대 학 원
의생명과학과/분자의학전공
송 민 우
당뇨병성 근육 감소증의 기작 연구 및 치료 약물 모색
지도교수 이 관 우
이 논문을 이학 석사학위 논문으로 제출함.
2021년 2월
아 주 대 학 교 대 학 원
의생명과학과/분자의학전공
송 민 우
송민우의 이학 석사학위 논문을 인준함.
심사위원장 이 관 우 인
심 사 위 원 강 엽 인
심 사 위 원 최 성 이 인
아 주 대 학 교 대 학 원
2020년 12월 17일
I
국문요약
현대에 이르러 과도한 영양 섭취와 불규칙적인 생활로 인한 대사 불균형 이 많아지고 비만이 증가하고 이로 인하여 당뇨병 발병이 증가하는 추세이 다. 많은 당뇨병 환자들에게는 심근경색, 심혈관 질환, 근육 감소증 등의 합 병증이 발생한다. 최근 당뇨합병증에 중요한 병증으로 대두되고 있는 당뇨병 성 근육 감소증은 대사인자에 의한 근육감소가 그 원인이고 근육 조직은 혈 중 혈당의 흡수에 매우 중요한 역할을 수행하고 있다. 당뇨병 환자에게 있어 서 근육 감소증은 인슐린 저항성 증가로 인한 당뇨병의 악화로 이어진다. 그 러므로 근육 감소증의 억제는 대사 질환을 완화하고 삶의 질을 높일 수 있 다. 본 연구에서는 분화된 C2C12 세포를 이용하여 PA에 의한 세포사멸과 근간 소실을 확인하였으며 세포 사멸 억제 효과를 가진 약물을 모색한 결과 DFO 약물을 선별하였다. 또한 DFO 약물을 이용하여 당뇨병성 동물 모델인 db/db mice에 15주간 복강 주사한 후 근 소실 회복을 조사하였다. 그 결과 db/db mice에 DFO 약물 투여 시 체중 증가, 인슐린 저항성 개선, 포도당 내성 장애를 개선하였고 근육 소실을 억제하였다. MRI로 hindlimb의 근육 mass와 지방 축적을 조사한 결과 DFO가 지방 축적을 줄이고 근육 소실을 개선하는 것을 확인하였고, 조직학적인 분석을 통하여 Gastrocnemius(GA), Tibialis anterior(TA) muscle의 근 위축이 개선됨을 확인하였다. DFO는 TA muscle에서 antioxidant enzyme 유전자인 Catalase, SOD1의 발현을 증가시켰다. 또한 GA muscle에서 근육 소실 유도 인자로 알려진 FoxO1의 인산화가 증가되었고 MuRF1, procaspase, LC3βⅠ,Ⅱ 단백질 발현을 감소 시켰다. 그리고 P62, Glutathione reductase의 발현을 회복시켰다. 따라서 DFO는 당뇨병성 근육 감소증을 개선하며 이외에도 여러 대사적 질환을 개 선하는 약물로서 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
핵심 단어: DFO, Deferoxamine, 당뇨, 근육 감소증, db/db, C2C12
II
차 례
국문요약 ... Ⅰ 차 례 ... Ⅱ 그림 차례 ... Ⅴ 도표 ... Ⅶ 약어 ... Ⅸ
Ⅰ. 서론 ... 1
Ⅱ. 연구 재료 및 방법 ... 6
A. 연구 재료 ... 6
B. 연구 방법 ... 6
1. 세포주 및 세포배양 ... 6
2. Preparation PA ... 7
3. Preparation DFO ... 7
4. Animal studies ... 7
5. Immunoblotting ... 7
6. Reverse transcriptase-polymerase chain reaction ... 8
7. Glucose, insulin tolerance test ... 8
8. Grip strength test ... 9
9. Mice 혈액 샘플 분석 ... 9
10. MTT 를 이용한 세포 생존 분석 ... 9
11. 통계 분석 ... 9
Ⅲ. 결과 ... 10
A. db/db 의 특징 조사 ... 10
1. db/db mice 에서의 포도당 내성 장애 및 지방간 발생 ... 10
III
2. db/db mice 에서 인슐린 저항성 및 근력 감소 ... 12
3. db/db mice 의 Gastrocenemius muscle 의 소실 확인 ... 12
(A) db/db mice 의 gastrocnemius 의 muscle cell mass 감소 ... 12
(B) Gastrocnemius muscle 에서 근육 감소 인자 증가 ... 12
B. 분화된 C2C12 의 근간소실 억제 약물 조사 ... 15
1. 분화된 C2C12의 근간소실 억제 약물 조사 ... 15
2. 팔미트산에 의한 C2C12의 세포사멸 억제 약물 조사 ... 15
C. db/db mice 에서 DFO 투여시 근육소실 억제 효과 조사 ... 19
1. db/db mice에 DFO 처리시 체중 감소 및 당 내성 개선 ... 19
2. db/db mice 에 DFO 처리시 지방간 개선 및 지방 조직 지방 세포 크기 감소 ... 19
3. db/db mice에 DFO 투여 시 혈중 대사인자들 개선효과 조사 ... 21
D. db/db mice 에서 DFO 처리시 근육소실 억제 효과 조사 ... 21
1. DFO 투여시 db/db mice에서 인슐린 저항성 개선 ... 21
2. DFO 투여시 db/db mice근육 소실 개선 효과 조사 ... 25
3. DFO 투여시 db/db mice에서 muscle mass 개선효과 ... 25
4. DFO 투여시 db/db mice에서 GA muscle mass 개선 ... 28
5. DFO 투여시 db/db mice에서 TA muscle mass 개선 ... 28
6. 근육 감소는 세포죽음, 오토파지, 단백질합성저해, 단백질분해에의해 유도 ... 28
7. DFO 투여시 db/db mice 에서 근육 감소 인자 및 오토파지 신호 감소 ... 28
8. DFO 투여시 db/db mice에서 활성산소의 감소 ... 32
9. 분화된 C2C12의 근간소실 억제 약물 조사 ... 32
10. DFO투여시 db/db mice에서 철 대사 인자 발현 개선 미비 ... 36
11. DFO투여시 db/db mice에서 TNFα, F4/80의 발현 감소 ... 36
Ⅳ 고찰 ... 39
IV
Ⅴ 결론 ... 42 참고문헌 ... 44 영문요약 ... 49
V
그림 차례
그림 1. Protein synthesis signal ... 3
그림 2. In db/db mice, glucose tolerance was increased and steatosis was developed ... 11
그림 3. In db/db mice, glucose tolerance and body weight was increased and grip strength was decreased ... 13
그림 4. In db/db mice, muscle mass was decreased. ... 14
그림 5. Differentiated C2C12 cell was decreased ... 16
그림 6. DFO effectively inhibited PA-induced death in differentiated ... 17
그림 7. Palmitate induced C2C12 myotubes were decreased,but were improved by DFO ... 18
그림 8. DFO injection db/db mice were decreased body weight and glucose tolerance than normal saline injection db/db mice ... 20
그림 9. DFO reduced fat in the liver and reduced adipose tissue size... 22
그림 10. DFO improved the increased FFA, TG, and ALT in db/db mice ... 23
그림 11. DFO improved insulin resistance in db/db mice ... 24
그림 12. DFO injection suppressed muscle loss in db/db mice ... 26
그림 13 DFO reduced fat and inhibited muscle loss in db/db mice ... 27
그림 14. db/db mice were improved GA muscle fiber size by DFO ... 29
그림 15. db/db mice were improved TA muscle fiber size by DFO ... 30
그림 16. Muscle atrophy related signal ... 31
그림 17. DFO inhibited the expression of muscle atrophy related proteins... 33
그림 18. DFO injection in db/db mice GA muscle inhibited the secretion of active oxygen ... 34
그림 19. When DFO was administered to db/db mice, the expression of antioxidant enzyme was increased ... 35
그림 20. DFO administered db/db mice decreased iron metabolism related protein expression in GA muscle ... 37
VI
그림 21. In the TA muscle of db/db mice administered with DFO, the expressionof inflammatory response related genes tended to be suppressed ... 38
VII
도표
도표 1. Quantitative real time-PCR에 사용한 Primer 서열과 목록
유전자 GenBank Accession No
Forward (5'-3') Reverse (5'-3')
DMT1 NM_001146161.1 TACCCATCCTCACGTTCACA CAGACGATCAGGACCAGGAT
FPN NM_016917.2 TCCAACATCCGTGAACTTGA TAGGAGACCCATCCATCTCG
FTH1 NM_010239.2 TGGTTCTGCAGCTTCATCAG GACCGAGATGATGTGGCTCT
Tfr1 NM_001357298.1 AGTGCAATAGCTGCAAAGCA TGGCTGCAGATGAAGAAGAA
Catalase NM_009804.2 TTGACAGAGAGCGGATTCCT TCTGGTGATATCGTGGGTGA
SOD1 NM_011434.1 CCAGTGCAGGACCTCATTTT AGTCACATTGCCCAGGTCTC
SOD2 NM_013671.3 CCAAAGGAGAGTTGCTGGAG GAACCTTGGACTCCCACAGA
Tnf-α NM_001278601.1 AGCCCCCAGTCTGTATCCTT GGTCACTGTCCCAGCATCTT
F4/80 NM_001355722.1 CCCGTGTTGTTGGTGGCACT GCTTTGGCTGGATGTGCTGG
VIII 도표 2. Immunoblotting에서 사용한 항체 목록
항체 회사명 카탈로그 번호
Pro caspase 3
Cell Signaling Technology
(Beverly, MA, USA)
9662
phospho-AKT 9271
total AKT 9272
phospho-FoxO1 #9461S
Total-FoxO1 #9454S
LC3β #2775S
P62 #5114
FTH1 #3998S
Glutathione
reductase ABcam (Eugene, OR, USA)
ab16801
FPN1 ab85370
MuRF1
ECM
Biosciences(Versailles, KY, USA)
#MP3401
actin
Bethyl
laboratories(Montgomer y, TX, USA)
A300-491A
tubulin Santa Cruz
Biotechnology (Dallas, TX, USA)
sc-5286
Ubiiquitin sc-8017
MYH sc-376157
IX
약어
PA Palmitic acid DFO Deferoxamine
GA Gastrocnemius TA Tibialis anterior SOL Soleus
EDL Extensor Digitorum Longus
1
Ⅰ.서론
현대에 이르러 과도한 영양 섭취와 불규칙적인 생활로 인한 대사 불균형 이 많아지고 비만이 증가하여 많은 사람에게서 당뇨병 발병이 증가하는 추 세이다. 또한 꾸준한 비만 인구의 증가 역시 당뇨병이 발병의 매우 중요한 원인 중 하나로 보고되어 있다(Ogurtsova et al., 2017), (West et al., 1966).
당뇨병 환자들에게는 여러 합병증이 발생하는데 심근경색, 심혈관 질환, 근 육 감소증 등이 이에 해당된다(Norhammar et al., 2002)(Cohen et al., 2015). 최근 당뇨합병증에 중요한 병증으로 대두되고 있는 근감소증 환자는 근육 감소로 신체적 활동이 어려워지고 삶의 질이 떨어지고, 여러 대사적 질 환에 더욱이 취약해질 수 있다. 또한 활동 능력의 감소로 인해 생존률이 떨 어지고 일상에서 여러 사고의 위험에 노출될 수 있다고 보고되었다(Lynch et al., 2001).
근육 조직은 신체내 혈당의 70%를 흡수하며 이는 체내 혈당조절에 매우 중요한 역할을 하고 있으며 이는 당뇨병 환자들의 고혈당을 조절하는데 있 어 중요한 역할을 하며 이러한 근육이 감소하면 당뇨병이 더욱 심각해질 수 있다. 이러한 근감소증은 1989년 Irwin Rosenberg에 의하여 개념이 확립되 었다(Rosenberg et al., 1989). 근감소증의 측정지표는 사지 근육량을 신장 의 제곱으로 나눈 값으로 많이 진단하고 있으며 이 수치가 20~40세 젊은 남녀의 평균값보다 -2 표준편차 미만으로 감소한 경우 금감소증으로 정의 한다(Baumagartner et al., 1998). 근육은 인슐린 저항성이 낮고 비만과 무 관하게 당뇨병의 위험을 낮춰주는 것으로 알려져 있으며 당뇨병의 악화를 개선해 줄 수 있을 것이다(Srikanthan et al., 2010) (Srikanthan et al., 2011).
근육은 정상적인 상황에서는 근육단백질들의 합성과 분해가 균형적으로 조절되고 있다. 그러나 단백질 합성과 분해의 균형이 깨어지면 단백질 합성
2
의 감소와 단백질 분해의 증가는 골격근의 단백질 손실이 발생하게 된다. 즉 근육 소실은 단백질 합성률 감소, 분해률 증가 이 두가지의 과정이 복합적으 로 작용하여 발생할 수 있다(Breen et al., 2011). 근육 감소증은 단백질 합 성과 분해의 균형의 깨어짐에 따라 AKT 경로가 억제되고 합성 기전의 활 성이 떨어지고 분해 기전의 활성으로 Caspase, Calpain, 오토파지의 과발현, 프로테아좀의 활성이 유도된다. 이러한 경로로 인해 근육 조직의 세포들의 단백질이 분해되어 근육 소실이 발생한다(Kim et al., 2019). 또한 근육 감 소는 FoxO의 발현을 통해 E3 ligase 로 알려진 Atrogin-1, MuRF1의 발현 으로 근섬유 단백질이 분해되어 유도되는 것으로 보고 되어있다(Gomes et al., 2001)(Bodine et al., 2001). Atrogin-1은 ubiquitin-proteasome system의 핵심 인자로 근육 소실 관련 전사 인자인 FoxO1 과 FoxO3a에 의해 활성 된다(Mammucari et al., 2008)(Sandri et al., 2004)(Zhao et al., 2007). 이러한 Foxo의 발현은 당뇨 병성 근육 감소증 환자들에게서 확인되 었고 그로 인해 근육 감소증이 일어 나는 것으로 보고되어 있다(Perry et al., 2016).
3
그림 1. Protein synthesis signal(Lecker et al., 2006).
또한 당뇨병성 근육 감소증은 주로 mTOR 경로의 활성화의 감소를 통해 발생한다(Bassil et al., 2013). 당뇨병 환자의 근육에서는 TNFα의 수치가 증가되어 있으며 NF-κB억제 인자가 감소해 있고 또한 NF-κB 그리고 JNK Pathway의 수치가 증가되어 있으며 이는 IRS1을 억제하여 인슐린 저항성을 유도하며 이로 인해 단백질 합성 신호의 핵심 인자인 mTOR과 AKT의 활성이 저해된다(Andreasen et al., 2011). 근육 감소증에서는 FoxO의 발현 또한 많이 관찰되어 지며 Akt에 의해 억제 되어 지는 것으로 보고되어 있다(stitt et al., 2004). 당뇨병 환자는 인슐린 저항성이 유발되어 있는 경우가 많고 그로 인하여 Akt의 인산화가 줄어 FoxO를 인산화
4
시키지 못하게 되고 그로 인하여 FoxO가 활성화되어 MuRF1 과 Atrogin1의 발현이 높아져 근육 감소증이 유도된다(Sandri et al., 2013).
당뇨병에서 인슐린 저항성을 개선하여 Akt의 인산화를 증폭시킨다면 FoxO의 발현이 떨어지고 근육 감소를 억제할 수 있을 것이다.
근육 감소의 원인으로는 신경계 및 호르몬 변화, 영양상태의 불균형, 신체활동의 감소, 대사의 불균형, 만성염증의 지속 등이 알려져 있다(Dreyer et al., 2005). 최근에 비만 및 노화로 근육 내의 지방 축적되고 이로 인해 염증성 사이토카인 분비가 과도하게 일어나고 단백질 대사에 악영향을 주어 근육 감소를 더욱 촉진시킴이 보고되었다(Jones et al., 2009). 특히 당뇨병 환자들의 근육 감소는 인슐린 저항성의 증가로 인한 동화 작용의 저해와 항염증 반응이 저해되어 지방 조직에서 고도로 발현되는 tumor necrosis factor-α가 interleukin-6를 유도하여 근육 조직의 분화를 억제하여 근육 감소를 유도하거나 근육 섬유 조성의 변화 와 근육의 노화로 인한 미토콘드리아의 기능 저하가 주 원인으로 근감소증이 발생한다(Cleasby et al., 2016)(Lang et al., 2002).
근육의 철 대사 균형이 깨지면 근육소실을 유발할 수 있다. 즉 과도한 철의 축적으로 인해 심각한 산화 스트레스가 발생하여 근육에 손상을 주어 근육 위축이 일어나며(Xu et al., 2012) 이와 같이 철대사로 인한 산화 스트레스는 활성산소의 축적으로도 발생하며 이는 세포막을 비롯한 세포 소기관에 손상을 주며 단백질을 변형 및 DNA의 손상을 유도하며 세포의 노화를 촉진하여 근육 감소를 유발한다(Gomes et al., 2012). tfR1을 통해 유입되는 철은 장세포에 DMT1에 의해 외부에서 흡수가 되어 ferroportin을 통해 체내를 순환하며 과도한 영양분 섭취로 인한 철분을 흡수하게 되면 세포내 철분 흡수가 높아지고 이로 인해 활성 산소가 생성이 되고 결과적으로 DNA, 세포막의 지질 단백질을 손상시키며 세포사멸을 유도한다(Latunde et al., 2017). 인슐린 저항성이 유발된 당뇨병성
5
근육조직에서는 철의 유입을 조절하는 tfR1의 발현이 증가되어있음이 보고되었고, 대표적인 불포화 지방산 중 하나인 팔미트산은 tfR1 증가를 통해 세포내로 철을 유입하여 인슐린 저항성을 유발한다고 보고되었다(Cui et al., 2019).
과도한 영양분 섭취는 체내 FFA, TG 등의 농도가 높아지며 이로 인한 복합작용으로 근육내 고농도의 활성산소를 발생시킨다는 보고가 많이 있다(Gomes et al., 2012). 대사이상에 의한 활성산소의 발생은 과도한 철 대사 이상과 함께 세포 내의 활성산소를 생성하고 근육 세포의 손상을 유발하고 근육 소실이 유도될 것으로 예상된다.
본 연구에서는 당뇨병 유도 동물 모델에서 당뇨병성 근육 감소증이 유발되는지 조사하였다. 또한 분화시킨 C2C12 세포를 이용하여 in vitro 근육소실 확인 시스템을 구축하였고 근 소실을 억제하는 약물을 조사하였다.
당뇨병 치료제 및 여러 ER stress, inflammation inhibitor, 당뇨병 치료제 등 여러 약물들이 팔미트산에 의한 죽음을 억제하는 실험을 진행한 결과 그 중 iron chelator Deferoxamine(DFO)약물이 가장 효과적으로 세포사멸과 분화된 C2C12 근간소실을 억제하였다. 본 연구에서는 DFO 를 이용하여 db/db 마우스에서 발생하는 근육 감소증에 대한 개선 연구를 진행하였다.
6
Ⅱ.
연구 재료 및 방법
A. 연구 재료이 연구에서 사용된 DFO (Deferoxamine), bovine serum albumin (BSA;
2207008), PA (P5585), 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5- diphenyltetrazoilium bromide (MTT), glucose 및 insulin (I9278)을 포함한 시약은 Sigma-Aldrich (Burlington, MA, USA)에서 구입하였다.
immunobloting 에서 사용된 항체 anti-phospho-FoxO1, anti-total- FoxO1, anti-phospho-AKT, anti-total-AKR, anti-LC3β, anti-P62 는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)에서 구입하였다. anti- lamin, anti-Atrogin1, anti-Gulthation reductase 는 ABcam (Eugene, OR, USA)에서 구입하였으며 anti MuRF1 은 ECM Biosciences(Versailles, KY, USA)에서 구매하였고 Anti-actin 은 Bethyl laboratories(Montgomery, TX, USA)에서 구매하였다.
B. 연구 방법
1. 세포주 및 세포배양
Myoblast C2C12 를 American Type Culture Collection(ATCC)를 통하여 구매한 뒤 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM-high glucose)에 fetal bovine serum (FBS)를 10% 항생제 (10 µg/mL streptomycin and 100 IU/mL penicillin)를 첨가하여 37℃의 온도와 5%
CO2 의 incubator 에서 배양하였다. 이후 myotube 로 differentiation 하기 위해 horse serum 2% 첨가한 DMEM-high glucose 를 3-5 일간 매일 배지를 교환해주었다.
7
2. preparation of PA
PBS 20ml 에 20mM 이 되도록 0.1024g 의 PA 를 70℃에서 30 분간 녹인 후 Palmitate(PA)가 녹아 있는 PBS 에 1M NaOH 를 200ul 넣어 비누화 과정을 30 분간 진행하였다. 비누화 과정이 끝난 PA 에 Bovine serum albumin(BSA)를 PA 와 3:1 의 비율로 합성해 사용하였다.
3. preparation of DFO
Normal saline 에 DFO(Sigma-ardrich)를 50mg/Kg 만큼 용해시킨다.
4. Animal studies
6 주령 C57BL/6J mice 는 Japan SLC Inc(Shizuoka Ken, Japan)을 통하여 주문하였으며 22 ± 2℃의 온도로 유지하며 12 시간 간격 light/dark cycle 의 환경에서 사육하였다. 본 연구에서는 db/+ mice 5 마리 db/db mice 10 마리로 3 개의 그룹으로[1. 대조군 : db/+
일반사료(D12450B; Research Diets Inc)와 normal saline 복강 주사, 2.
db/db 일반사료(D12450B; Research Diets Inc) normal saline 복강 주사, 3. db/db 일반사료(D12450B; Research Diets Inc) Deferoxamine 100mg/Kg 복강 주사] 나누어 15 주동안 주 3 회 약물을 투여 몸무게 주 1 회 측정하였다. 혈당 측정은 꼬리의 정맥에서 Accu-check (korea Roche Diagnostics, Seoul, Korea)를 이용하여 혈액을 채취해 측정하였다.
5. Immunoblotting
근육세포인 C2C12 및 mouse Gastrocnemius muscle 를 RIPA buffer(1%
triton X-100m 1% sodium deoxcolate, 50mM NaCl2, 50mM tris-HCl, 1mM sodium vanadate, 2mM PMSF, protease inhibitor cocktail(Roche Applied Science))로 용해시켜 단백질을 정제한 후 정량 과정을 밟은 뒤 sample
8
buffer(50 mmol/l Tris-HCl at pH 6.8, 2% SDS, 100 mmol/l DL-dithiothreitol, 10% glycerol)에 희석하여 5 분간 끓이다. 이후 단백질을 8~12 % 폴리아크릴아미드로 분리된 SDS 샘플버퍼에 (50mM Tris-Cl at pH 6.8, 2%
SDS, 100 mM DL-dithiothreitol (DTT), 10% glycerol), 8-12 % SDS- polyacrylamid gel 에서 전기영동하여 전기영동이 완료된 단백질을 PVDF membrane 으로 transfer 한뒤 5% skim milk 롤 blocking 장겁을 한다. 이후 각각 primary antibody 를 반응시킨 후 조건에 맞는 secondary antibody 를 반응시켜 enhanced chemiluminescence system (Pierce, Rockford, IL, USA)를 이용 각각의 밴드를 확이한다.
6. Reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) RNAiso Plus 시약(Takara Bio, Shiga, Japan)을 사용하여 세포 및 mouse Gastrocnemius muscel 과 Tibialis Anterior muscle 에서 총 RNA 를 정제하였다. cDNA 는 TaKaRa RNA PCR Kit (버전 3.0; TaKaRa Bio, Shiga, Japan)와 함께 제공된 AMV 역전사 효소 및 Random 9-mer 를 사용하여 합성되었다. PCR 증폭을 위한 primer set 는 Table 1 에 나열되어 있으며 TaKaRa TP-815 기기를 사용하여 SYBR Green (TaKaRa Bio)으로 qRT- PCR 을 수행하였다. 증폭된 DNA 의 상대적인 양은 TP-815 기기와 함께 번들로 제공되는 소프트웨어를 사용하여 분석되었고 마우스 36B4 mRNA 수준으로 정량되었다.
7. Glucose, Insulin tolerance test
mice 를 overnight 동안 공복시킨 후 꼬리쪽 정맥을 이용하여 공복 혈당을 측정 이후 포도당 2g/Kg, 인슐린 0.7g/Kg 를 복강주사하여 각 조건의 시간에서 Accu-chck(Korea Roche Diagnostics, Seoul, Korea)를 이용하여 측정한다.
9
8. Grip strength test
BIOSEB grip strength test machie 을 이용 하여 각 조건의 실험 쥐들의 뒷다리를 기계에 연결된 그물망에 걸어 그물을 뒷다리로 잡은 쥐가 그물을 놓칠 때까지 천천히 잡아당기며 grip strength 를 측정한다.
9. mice 혈액 샘플 분석
mice 를 희생시킨 후 심장으로부터 혈액을 채취하여 채취한 혈액을 4℃에서 3000g 로 10 분간 원심분리 하여 혈장을 얻는다. 이후 채취한 혈장애서 TG, total cholesterol, AST, ALT 등을 autochemical analyzer(Cobas c111, Roche, Germany)를 이용하여 확인한다.
10. MTT 를 이용한 세포 생존 분석
96well plate 에 분화된 mice muscle cell C2C12 에 조건에 맞는 약물을 처리한 후 MTT(0.5mg/ml)의 농도를 각 well 에 처리한다 이후 37℃에서 1 시간동안 반응 이후 상등액을 모두 제거한 뒤 100μl 의 isopropanol 을 각 well 에 넣어준다. isopropanol 을 넣어준 상태에서 상온에서 30 분가 반응시킨 뒤 570nm 에서 microplate reader(MOLECULAR DEVICES, SpectraMax, CA, USA)를 이용하여 흡광도를 측정한다.
11. 통계 분석
본 연구에서 시행된 모든 실험은 3 번 반복 실험을 진행하여 통계처리 하였으며 data 는 SE 값으로 오차를 나타냈으며 두 데이터 그룹은 Student’s t test 를 이용하여 통계처리 하였다.
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Ⅲ.결과
A. db/db mice 특징 조사
1. db/db mice 에서의 포도당 내성 장애 및 지방간 발생
당뇨병 동물 모델인 db/db mice 는 leptin receptor 유전자에 point mutation 을 가져 정상적인 leptin 의 기능이 일어나지 않아 식욕억제가 불가능 하며 과도한 영양분 섭취로 인해 당뇨병이 발생하는 모델로 알려져 있다. 본 연구에서는 출생 후 6 주가 경과된 db/db mice 와 db/+ mice 구입하여 6 주간 사육하며 간, 지방에서 db/db 의 특징이 잘 나타나는지 GTT(glucose tolerance test)를 실시하였다. 또한 db/+ mice 와 db/db mice 를 희생 후 지방간 발생을 H&E(Haemotoxylin and Eosin) 염색으로 확인하였으며 혈액 검사를 통해 AST, ALT, Cholesterol total 의 증가를 확인하였다. db/db mice 생쥐는 포도당 부하 검사에서 정상의 쥐와는 달리 포도당 내성 장애가 생겼고 지방간이 발생하였으며, 혈중에 FFA(free fatty acid), TG(triacylg lycerol), Cholesterol total, ALT(alanine amicotransferase), AST(asparate aminotransferase) 등이 정상군에 비해 현저히 증가되었음을 확인하였다 (그림 2).
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그림 2. In db/db mice, glucose tolerance was increased and steatosis was developed. A. db/db mice and db/+ mice was measured glucose tolerance test before 1 week. In last day, db/db mice and db/+ mice was sacrificed and observed liver. B. db/db mice and db/+ mice was measured AST, ALT, cholesterol, TG and FFA.
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2. db/db mice 에서 인슐린 저항성 및 근력 감소
6 주령 db/+, db/db mice 무게를 6 주간 측정 하였고 11 주차에 인슐린 저항성 테스트 ITT(insulin tolerance test)와 근력 테스트 grip strength test 를 진행 하였다. 6 주간 db/db mice 는 db/+ mice 보다 더 몸무게가 유의하게 증가하였으나 증가한 근력이 감소해 있음을 확인하였다. 또한 인슐린 저항성은 db/+ mice 에 비하여 db/db mice 에서 현저히 증가하는 것을 확인 하였다 (그림 3).
3. db/db mice 의 Gastrocnemius muscle 의 소실 확인
A. db/db mice 의 Gastrocnemius 의 muscle cell mass 감소
db/db mice 의 근력약화의 원인을 조사하기 위하여 12 주차가 경과된 db/+
mice 와 db/db mice 의 다리 뒤쪽 근육인 gastrocnemius(GA) muscle 을 적출하고 동결 박절하여 laminin 염색을 형광으로 진행하여 muscle mass 를 image J 로 측정하였다. 그 결과 db/+ mice 보다 db/db mice 의 gastrocnemius muscle 을 구성하는 세포들은 크기가 작은 세포가 많았으며 큰 세포의 비율이 낮음을 알 수 있었다. 즉 db/db mice 의 muscle mass 가 db/+
mice 의 근육에 비해 유의성 있게 줄어든 것을 확인하였다 (그림 4. A).
B. Gastrocnemius muscle 에서 근육 감소 인자 증가
앞선 실험에서 적출한 Gastrocnemius muscle 에서 db/+ mice 와 db/db mice 의 근육 감소가 일어나는지 근육 감소 인자로 알려진 MuRF1 과 phospho-Foxo1 을 western blot 을 통하여 조사하였다. 그 결과 db/db mice 에서 MuRF1 의 발현이 증가하였고 phospho-Foxo1 의 인산화는 db/db mice 에서 감소된 것이 관찰되었다. 이를 통해 db/db mice 에서 근육 감소가 일어나고 있음을 확인하였다 (그림 4. B).
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그림 3. In db/db mice, glucose tolerance and body weight was increased and grip strength was decreased. A. db/db mice and db/+ mice was measured glucose tolerance test after 11 weeks. B. db/db mice and db/+ mice was measured each day for 6~12 weeks. (C)db/db mice and db/+ mice was measured grip strength through grip strength test machine. *P<0.05 vs db/+
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그림 4. In db/db mice, muscle mass was decreased. A. db/db mice and db/+ mice was measured muscle size by tissue staining. B. db/db mice and db/+ mice tissues were measured P-Foxo1 and MuRF1 by western blotting. **p<0.01 vs db/+
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B. 분화된 C2C12 의 근간소실 억제 약물 조사
1. 분화된 C2C12 의 근간 소실 인자 조사
당뇨병성 근육 소실을 유도하는 인자를 조사하기 위해 mice muscle cell 로 알려진 C2C12 를 분화를 유도하였고 근육 소실을 유발하는 인자들 (TNF 𝛼, 팔미트산, Dexamethasone)을 처리하고 근육 소실을 Phalloidin 과 DAPI 형광염색을 통해 조사하였다. 그 결과 Dex 투여시 근간의 지름의 감소가 관찰되었으며 팔미트산 투여시 근간의 소실이 뚜렸하게 나타난 것을 확인하였다. 그러나 TNF 𝛼 처리한 군에서는 근간의 소실이 뚜렷하게 나타나지 않았다 (그림 5). 분화된 C2C12 의 근간을 효과적으로 감소시키는 인자는 팔미트산이였고 앞으로 진행할 근간 억제 약물 조사는 팔미트산을 이용하기로 하였다.
2.팔미트산에 의한 C2C12 의 세포사멸 억제 약물 조사
분화된 C2C12 에 팔미트산을 처리한 경우 세포의 근육소실을 유발하고 결국 세포를 죽음으로 유도하였다. 본 연구자는 근간을 보존하는 여러 약물을 전처리하고 팔미트산을 처리하여 근간을 억제하고 세포 사멸을 억제하는 약물을 조사하였다. 그 결과 철 킬레이터인 DFO 가 매우 효과적으로 근간 소실을 억제하고 세포사를 감소시켰다 (그림 6,7).
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그림 5. Differentiated C2C12 cell was decreased. C2C12 cell were completely differentiated for 5 days. Differentiated C2C12 cell were treated with PA(500μM), DEX(20 μM) and TNF- α(10ng/ml) for 24h and staining was performed with DAPI and Phalloidin. After, it was analyzed using a confocal microscope.
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그림 6. DFO effectively inhibited PA-induced death in differentiated C2C12. Each drug was treated according to the conditions, and MTT analysis was performed after 18 hours. ***P<0.001, **P<0.01 vs con
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그림 7. Palmitate induced C2C12 myotubes were decreased, but were improved by DFO. C2C12 cell were completely differentiated for 5 days.
Differentiated C2C12 myotubes were treated with palmitate and DFO.
Then, Phalloidin and DAPI staining was performed. After, it was analyzed using a confocal microscope.
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C. db/db mice 에서 DFO 효과 조사
1. db/db mice 에 DFO 처리시 체중 감소 및 당 내성 개선
6 주령의 db/+ mice 5 마리를 대조군으로 사용하였고 같은 주령의 db/db mice 를 각각 5 마리씩 두 군으로 나누어 생리식염수 또는 DFO(100 mg/kg)를 15 주간 복강주사 하며 무게를 측정하였다. 14 주차에 포도당 부하 검사를 진행하였고 15 주차에는 쥐를 희생하여 각 조직의 무게를 측정하고 RNA 및 단백질을 분리하였다. db/db mice 는 db/+ mice 보다 무게가 월등하게 증가하는 경향을 나타냈다. 그러나 DFO 를 투여한 db/db mice 는 약물처리 6 주차부터 체중 증가량이 줄고 8 주차부터 서서히 감소하기 시작하였다. 포도당 부하 검사 결과 db/db mice 는 포도당 내성장애가 유발 하였으며 DFO 를 투여한 db/db mice 는 생리식염수 투여한 db/db mice 보다 포도당 내성장애가 완화 된 것을 확인하였다. 또한 db/db mice 의 간, 백색 지방조직, 갈색 지방조직 무게는 db/+ mice 보다 증가한 경향을 나타내었으나 DFO 를 투여한 db/db mice 는 무게가 감소하는 경향이 나타났다 (그림 8).
2. db/db mice 에 DFO 투여시 지방간 개선 및 지방 조직 지방 세포 크기 감소
실험동물들은 희생시킨 뒤 간, 백색 지방조직, 갈색 지방조직을 4%
formaldehyde 고정시킨 후 H&E staining 을 통하여 DFO 를 통하여 각 조직들의 손상의 개선 정도를 조사하였다. 간 조직의 경우 db/db mice 에서 많은 지방이 보여 지며 DFO 를 투여한 db/db mice 에서는 조직내에 지방이 현저하게 감소된 것을 확인하였다. 간의 지방축적을 좀더 확인하기 위해서 Oil red O 염색을 진행한 결과, db/db mice 에 지방이 많이 끼어 있는 것이 보여 지며 DFO 투여 db/db mice 에서는 그 정도가 감소한 것을
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그림 8. DFO injection db/db mice were decreased body weight and glucose tolerance than normal saline injection db/db mice. A. db/+, db/db and DFO injection db/db mice were measured body weight once a week for 15 weeks. B. GTT(Glucose Tolerance Test) was administered at week 14 and after 15 weeks, the tissue weight of each mice were measured. *P<0.05, **P<0.01 vs DFO injection db/db mice
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확인하였다. 백색 지방조직의 경우 db/db mice 에서 해당 조직의 세포들이 크기가 커진 것을 관찰하였으며 DFO 를 투여한 db/db mice 에서는 그 크기가 감소된 것을 확인하였다. 갈색 지방조직의 경우 db/db mice 에서 완전히 백색 지방조직 같이 변화되었으나 DFO 를 투여한 db/db mice 에서 그 크기는 더 작은 것으로 확인되었다 (그림 9).
3. db/db mice 에 DFO 투여 시 혈중 대사인자들 개선효과 조사
실험동물들을 희생시킨 뒤 혈액을 채취하여 혈장을 분리해 혈액 검사를 실시하여 혈중에 증가된 Triglyceride (TG), Free Fatty Acid (FFA), Total cholesterol, ALT, AST 등의 개선 정도를 조사하였다. db/db mice 의 TG 와 FFA 는 db/+ mice 보다 혈중 수치가 증가하는 경향이 나타났으며 DFO 를 투여한 db/db mice 는 TG, FFA, ALT 는 유의성 있게 줄어드는 경향이 나타났다 (그림 10). 그러나 Total cholesterol 과 AST 에서는 크게 차이가 없었다.
D. db/db mice 에서 DFO 처리시 근육소실 억제 효과 조사
1. DFO 투여시 db/db mice 에서 인슐린 저항성 개선.
6 주령의 db/+ mice5 마리를 대조군으로 사용하였고 같은 주령의 db/db mice 를 각각 5 마리씩 두 군으로 나누어 생리식염수 또는 DFO(100 mg/kg)를 15 주간 복강주사 하였다. 14 주차에 포도당 부하 검사(IPGTT) 와 인슐린 저항성(IPITT)을 조사하였다. 생리식염수를 투여한 db/+
mice 의 경우 인슐린 투여 시 혈중 포도당이 시간이 지날수록 매우 낮은 수치까지 떨어지나 생리식염수를 투여한 db/db mice 의 경우 db/+ 보다
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높은 혈당수치를 유지하는 것을 확인하였다. DFO 를 투여한 db/db mice 는 생리식염수를 투여한 db/db mice 보다 유의성 있게 낮은 혈당 수치를
그림 9. DFO reduced fat in the liver and reduced adipose tissue size.
All tissues were obtained from db/db mice and db/+ mice. A. The obtained liver tissue was stained with H&E and Oil Red O. B. Epididymal adipose tissue and Brown adipose tissue were stained with H&E.
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그림 10. DFO improved the increased FFA, TG, and ALT in db/db mice blood serum. A. B. Blood was collected and analyzed from db/db mice and db/+ mice injected with DFO and NS for 15 weeks. *P<0.05, **P<0.01
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그림 11. DFO improved insulin resistance in db/db mice. Blood was collected from the tail veins of db/db mice and db/+ mice treated with DFO and NS for 14 weeks and ITT was performed. *P<0.05
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나타냈다. 이러한 결과는 DFO 가 인슐린 저항성을 개선시킨 것으로 생각된다 (그림 11)
2. DFO 투여시 db/db mice 근육 소실 개선 효과 조사
DFO 는 db/db mice 에서 인슐린 저항성을 개선시켰다. 이러한 원인이 근육 mass 의 변화와 관련이 있는지 hindlimb 의 각 부위별 근육을 적출하여 크기 비교 및 무게를 측정하였다. db/+ mice, db/db mice 에서 TA(Tibialis Anterior) 근육, EDL(Extensor Digitorum Longus) 근육, Soleus(SOL) 근육, GA(Gastrocnemius) 근육 적출하여 크기를 비교한 결과, db/db mice 근육 근육들은 db/+ mice 의 근육보다 크기가 감소됨이 관찰되었고, GA 근육의 경우 지방이 근육에 많이 붙어 있는 것을 확인하였다.
이는 근육 소실이 진행된 부위에 지방이 축적이 된 것으로 생각된다.
반면 DFO 투여한 db/db mice 의 TA 와 GA 근육은 db/db mice 근육에 비해 크기가 증가함을 알 수 있었다(그림 12).
3. DFO 투여시 db/db mice 에서 muscle mass 개선효과
DFO 를 db/db mice 에 14 주간 투여 후 mice hindlimb 를 MRI(Magnetic Resonance Imaging)를 이용하여 촬영 한 후 image J 를 이용하여 muscle 를 측정 하였다. db/db mice 는 db/+ mice 보다 근육 mass 가 크게 감소하였으나 DFO 를 투여 한 db/db mice 의 근육 mass 는 감소하지 않았다.
또한 근육주의에 존재하는 lipid mass 도 DFO 를 투여 받은 db/db mice 에서 작아져 있음을 확인하였다 (그림 13).
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그림 12. DFO injection suppressed muscle loss in db/db mice. A. Muscles picture were obtained from db/db mice and db/+ mice injected with DFO and NS for 15 weeks. B. The weight of the extracted muscles was measured.
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그림 13. DFO reduced fat and inhibited muscle loss in db/db mice hindlimb. A. MRI images were obtained of the hindlimb of db/db mice and db/+ mice. B. MRI images were quantified using the image J program.
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4. DFO 투여시 db/db mice 에서 GA muscle mass 개선
15 주간 DFO 를 투여한 db/db mice 에서 GA muscle 을 적출하여 H&E 염색하고 근육세포 이미지를 image J 로 수치화하여 근육 감소 개선 정도를 조사하였다. db/db GA 의 근육세포들은 db/+ 에 비하여 세포 크기가 감소되었고, DFO 를 투여한 db/db mice GA 는 근육세포의 크기가 큰 세포들이 많음을 확인하였다 (그림 14).
5. DFO 투여시 db/db mice 에서 TA muscle mass 개선
15 주간 DFO 를 투여한 db/db mice 에서 TA muscle 을 적출하여 H&E 염색하고 근육세포 이미지를 image J 로 수치화하여 근육 감소 개선 정도를 조사하였다. db/db TA 의 근육세포들은 db/+ 에 비하여 세포 크기가 감소되었고, DFO 를 투여한 db/db mice TA 는 근육세포의 크기가 큰 세포들이 많음을 확인하였다 (그림 15).
6. 근육 감소는 세포죽음, 오토파지, 단백질합성저해, 단백질분해에의해 유도 근육 감소증은 상당히 많은 복합적인 요인들이 관련되어 있다. insulin resistance 에 의해 단백질 합성 신호가 저해되면 그로 인한 오토파지 과발현의 연쇄 작용이 일어나기도 하며 노화로 인한 caspase 의 발현 또는 외부 인자로 인한 세포 죽음신호의 활성 또는 E3 ligase 들의 활성으로 인한 단백질 분해 유도 등의 원인이 있다. 이 모든 기작 들은 서로 연관되어 있다.
7. DFO 투여시 db/db mice 에서 근육 감소 인자 및 오토파지 신호 감소 15 주간 DFO 처리한 db/db mice 에서 GA muscle 을 적출하여 단백질 정량을 거쳐 immunoblotting 을 진행하였다. DFO 를 투여한 db/db mice 에서 FoxO1 는 인산화가 증가하였고 FoxO1 를 인산화 하는 AKT 는
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그림 14. db/db mice were improved GA muscle fiber size by DFO. A. GA muscle obtained from db/db mice and db/+ mice were H&E stained. B.
The size of the muscle tissue of the GA muscle subjected to H&E staining was measured with the image J program.
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그림 15. db/db mice were improved TA muscle fiber size by DFO. A. TA muscle obtained from db/db mice and db/+ mice were H&E stained. B.
The size of the muscle tissue of the TA muscle subjected to H&E staining was measured with the image J program.
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그림 16. Muscle atrophy related signal(Arch Biochem Biophys. 2019 Feb 15;662:49-60).
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발현이 올라갔으며 FoxO1 에 의해 발현되는 MuRF1 은 발현량이 줄었다.
또한 단백질을 분해하는 오토파지의 활성과 관련되어 있는 LC3β의 발현은 감소하였다. db/db mice 에서 유비퀴틴의 발현이 올라 갔으나 DFO 를 투여한 db/db 에서는 통계적으로 유의하지는 않지만 발현이 감소하였다. 그리고 procaspase 의 발현은 db/db mice 에서 발현량이 증가하였으며 DFO 를 투여한 db/db mice 에서는 그 정도가 감소하였다 (그림 17).
8. DFO 투여시 db/db mice 에서 활성산소의 감소
DFO 를 투여한 db/db mice 와 NS 를 투여한 db/db mice 의 GA muscle 에서의 활성 산소 발생 정도를 DCF-DA 형광 염색을 통하여 측정하였다. 그 결과 db/db mcie 의 GA muscle 에서는 활성 산소가 많이 발생 한 것을 확인 하였으며 db/+ mice 와 DFO 투여 db/db mice 에서는 활성 산소의 발생이 아주 낮은 것을 확인하였다 (그림 18).
9. DFO 투여시 db/db mice 에서 antioxidant enzyme 의 증가
DFO 를 투여한 db/db mice 에서 근육 감소 인자의 증가로 하더라도 근육 감소증이 개선되어 GA muscle 로부터 만든 cDNA 를 이용하여 또다른 관련 기작인 ROS 기작에서 ROS 를 줄여주는 antioxidant enzyme 으로 알려진 catalase, SOD1, SOD2 의 발현을 조사하였다. db/db mice 에서 catalase 는 db/+ 에 비하여 변화가 거의 없으며 SOD1, SOD2 는 감소하는 경향을 나타내었다. 그러나 DFO 를 투여한 db/db mice 에서는 NS 를 투여한 db/db mice 뿐만이 아닌 db/+ mice 보다 더 catalase 의 발현이 올라갔으며 SOD1, SOD2 는 NS 투여 db/db mice 보다 많은 발현이 확인되었다. 이후 진행한 immunoblotting 에서는 antioxidant enzyme 중 하나인 Glutathione reductase 의 발현이 NS 투여 db/db mice 에서 감소하고 DFO 투여 db/db mice 에서 증가하는 경향이 나타났다 (그림 19).
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그림 17. DFO inhibited the expression of muscle atrophy related proteins.
A.B. In the left panel, proteins were extracted from the GA muscle and immunoblotting was performed, and in the right panel, quantification was performed using image J. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 vs NS injection db/db. #P<0.05, ##P<0.01 vs db/+
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그림 18. DFO injection in db/db mice GA muscle inhibited the secretion of active oxygen. GA muscle was obtained from db/db mice and db/+
mice, and fluorescence staining was performed using DCF-DA and DAPI.
After, it was analyzed using a confocal microscope.
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그림 19. When DFO was administered to db/db mice, the expression of antioxidant enzyme was increased. A-C. Antioxidant enzyme related gene expression was measured using TA muscle obtained from db/db mice and db/+ mice. D. Immunoblotting was performed using GA muscle obtained from db/db mice and db/+ mice. E. The immunoblotting of glutathione reductase was quantified using image J. *P<0.05, **P<0.01,
###P<0.001
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10. DFO 투여시 db/db mice 에서 철 대사 인자 발현 조사
DFO 의 잘 알려진 기능 중 하나는 Iron 킬레이터이다. DFO 를 db/db mice 에 투여하고 GA muscle 에서 철 대사 인자들의 발현의 변화를 조사 하기 위해 DMT1, FTH1, FPN, Tfr1 등의 유전자 발현을 RNA 와 단백질 수준에서 조사하였다. db/db mice 에서 DMT1, FTH1, Tfr1 의 유전자 발현은 db/+ mice 보다 감소하였으나 db/db mice 에서 DFO 를 투여에 따라 변화가 없었다. 그러나 FTH 와 FPN 의 경우 단백질 수준에서 db/db mice 에서 발현이 증가하였고 DFO 를 처리한 경우 감소하는 것으로 나타났다 (그림 20).
11. DFO 투여시 db/db mice 에서 TNFα, F4/80 의 발현 감소
근감소증의 원인 중 대표적인 인자는 TNF-a 같은 염증성 사이토카인과 근육조직으로 대식세포의 유입이 있다. db/db mice 에 DFO 를 투여한 경우 GA muscle 에서의 염증이 개선되는지 조사하기 위해 TNFα와 F4/80 의 발현을 조사하였다. db/db mice GA 근육에서는 대조군에 비해서 TNFα와 F4/80 의 발현이 증가해 있었으나 DFO 를 투여한 db/db mice 에서 그 발현량이 감소하는 경향을 보였다. DFO 의 염증 개선은 근육 소실을 억제할 가능성이 있다 (그림 21).
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그림 20. DFO administered db/db mice decreased iron metabolism related protein expression in GA muscle. A-DThe expression of genes related to iron metabolism was measured from TA muscle obtained from db/db mice and db/+ mice. E. Proteins related to iron metabolism were measured from GA muscles of the same mice. F-G. Protein expression measured by immunoblotting was quantified using the image J program.
*P<0.05, ***P<0.001,#P<0.01
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그림 21. In the TA muscle of db/db mice administered with DFO, the expression of inflammatory response related genes tended to be suppressed. A-B. TA muscle obtained from db/db mice and db/+ mice was measure for gene expression using qRT-PCR
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Ⅳ. 고찰
당뇨병은 전세계적으로 발병률이 높아 지는 추세이다. 따라서 당뇨병발병과함께 당뇨병의 합병증중 하나인 당뇨병성 근육 감소증이 많이 보고되고 있다. 근육 감소증은 당뇨병뿐만 아니라 여러 요인에 의해 발생되는 경우가 많다. 근육의 소실은 당뇨 환자에게서 당뇨병을 더 심각하게 할 수 있을 뿐만 아니라 다른 여러 대사질환에 취약해질 수 있으며 당뇨병이 발병하지 않은 사람에게서 근육의 소실이 일어나 근육이 감소하게 되면 당뇨병의 발병률 또한 높아진다. 심각한 당뇨병으로의 발전을 억제하기 위해 근육 소실을 막는 것이 중요하며 당뇨병성 근육 감소증은 과도한 철분(Xu et al., 2012), 활성 산소(Gomes et al., 2012), 과도한 지방이 원인이라 생각되며(Zhu et al., 2019) 지방에 의해 유도되는 세포 사멸에 보호 효과를 보인 DFO 약물을 이용하여(Cui et al., 2019) 근육 감소증의 개선하는 방향을 제시하고자 연구를 시작하였다.
먼저, db/+ mice 와 db/db mice 를 이용하여 db/db mice 에서 여러 대사질환의 발생을 확인하였으며 근육의 소실을 확인하였다. 이후 mice muscle cell 인 C2C12 에서 PA 에 의해 유도되는 죽음 신호를 여러 약물들을 투여하여 개선하는 약물을 모색하였고 그중 DFO 약물을 선별하였다. 선별한 약물인 DFO 를 db/db mice 에 복강 주사하였을 때 여러 대사징후와 근육의 면적이 개선되는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과를 통하여 DFO 가 당뇨병성 근육 감소증을 억제하여 당뇨병에서 여러 대사 징후를 개선시킬 것으로 생각된다.
당뇨병 유도 mice 인 db/db mice 에서 근육 감소 인자 MuRF1 의 증가를 확인할 수 있었고(Kim et al., 2019) 여러 대사적 손상을 확인할 수 있었다.
이후 MuRF1 의 발현이 DFO 를 복강주사한 db/db mice 그룹에서 근육 소실의 억제 및 주변 지방조직의 감소를 MRI 촬영을 통해 확인할 수 있었으며 H&E staining 을 통하여 GA muscle 과 TA muscle 의 muscle
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cell 의 크기를 분석하였으며 DFO 를 투여한 db/db mice 에서 muscle cell 들이 크기가 큰 cell 들이 많은 것을 확인하였다. 이후 혈액검사에서 FFA, TG, ALT 의 수치들이 개선된 것을 확인하였다. 또한 db/db mice 의 체중을 감량시키고 비대해진 조직들의 무게가 감소된 것을 확인하였다. 이는 DFO 가 db/db mice 에서 지방을 감소시켜 근육 소실을 감소시킨 것으로 생각하였다(Zhu et al., 2019).
DFO 는 Iron chelator 로 알려져 있으며 DFO 를 db/db mice 에 주사하였을 때 체내의 철 이온 농도를 조절하여 과도한 철로 인한 근육 조직의 소실을 막을 것이라 생각했다. 그래서 DFO 를 주사한 db/db mice 의 TA muscle 을 이용하여 철 대사 관련 유전자의 발현을 확인하였고 db/db mice 에서 관련 유전자들의 발현이 떨어지는 것을 확인 DFO 를 투여한 db/db mice 에서도 큰 변화 없이 발현이 올라가지 않았으나 이후 GA muscle 의 immunobloting 을 통하여 FTH1 과 FPN1 의 단백질 발현은 오히려 db/db mice 에서 올라가고 DFO 투여 db/db mice 에서는 떨어진 것을 확인하였다. 이는 db/db 의 GA muscle 에서 DFO 가 철 이온을 조절하여 근육 감소증 개선에 도움을 준 것으로 생각하였다.
활성 산소는 세포막을 비롯한 세포 소기관에 손상을 주기 때문에 근육 세포를 손상시켜 근육 소실을 일으킬 것이라 생각하였다(Gomes et al., 2012). db/db mice 의 TA muscle 을 이용하여 antioxidant enzyme 유전자의 발현을 조사하였고 DFO 를 투여한 그룹에서 antioxidant enzyme 의 발현이 증가한 것을 확인하였으며 GA muscle 을 통하여 antioxidant enzyme 인 Glutathione reductase 의 단백질 발현증가를 확인하였다. 이는 DFO 에 의해 db/db mice muscle 의 활성 산소 수치가 낮아져 근육 조직의 cell 들의 손상이 줄어들어 근육 소실이 개선된 것으로 생각하였다.
당뇨병성 근육 감소증은 주로 insulin resistance 로 인한 단백질 합성 신호의 저해로 인해 발생한다(Andreasen et al., 2011). DFO 를 투여한
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db/db mice 의 GA muscle 에서 NS 를 투여한 db/db mice 의 GA muscle 에서 보다 P-AKT 의 발현의 증가가 확인되었고 이는 DFO 가 insulin resistance 를 개선하여 근육 조직의 단백질 합성 신호를 활성화시켜 근육 소실을 억제해 근육 감소증을 완화시키는 것으로 생각된다.
지금까지의 결과에서 DFO 는 db/db mice 에서 체중을 감소시키며 혈액내 FFA, TG, ALT 의 수치를 낮춰 개선시켜 주며 지방조직이 감소하였고 철 대사 관련 단백질들의 발현이 줄고 antioxidant enzyme 의 유전자 발현과 단백질 발현이 증가하였다. 이러한 복합적인 요인을 통하여 DFO 는 db/db mice 에서 근육 감소증을 개선하는 것으로 생각하였다. 하지만 DFO 로 인하여 지방 조직의 감소, 철 이온의 조절, antioxidant enzyme 의 증가, insulin resistance 의 개선등의 상당히 광범위한 회복 기전을 나타내고 있어 정확히 어떠한 기전이 근육 감소증을 직접적으로 개선하는지에 대한 연구의 진행이 필요하다.
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Ⅴ. 결론
이 연구에서의 목적은 당뇨병성 근육 감소증의 기전을 조사하고 근육 감소증을 개선하는 약물을 모색하여 그 효과를 입증하는 것이다.
당뇨병 모델 mice 인 db/db mice 를 db/+ mice 를 대조군으로 사용하여 당뇨병 유도 mice 에서 근육 감소의 정도와 여러 대사적 인자들을 조사하였고 당뇨병 유도 mice 인 db/db mice 에서 부정적인 대사적 징후를 확인하였으며 근육의 감소를 확인하였다. 이후 분자적인 분석을 통해 db/db mice 의 GA muscle 에서 근윤 감소 유도 인자인 MuRF1 의 발현을 확인하였다.
db/db mice 에서 근육 감소를 확인한 후 근육 감소증 치료 약물을 모색하기위해 mice muscle cell C2C12 를 이용하였다. 당뇨병과 관련이 있는 약물들을 처리하여 분화된 C2C12 의 근간의 소실 정도를 조사 가장 효과 있었던 팔미트산을 이용하여 근간 소실을 유도하였고 근육 감소증의 개선이 기대가 되는 여러 약물들을 처리하여 팔미트산에 의해 유도되는 죽음 신호 억제가 가장 효과적인 약물인 DFO 를 근육 감소증 치료 약물로 선정하였다.
이후 db/db mice 를 이용하여 15 주간 DFO 약물을 주 3 회 복강주사 하였을 때 NS 투여 db/db mice 보다 DFO 투여 db/db mice 의 체중이 감소하는 경향이 나타났으며 이후 진행한 혈액 검사에서 FFA, TG, ALT 의 수치가 감소하였고 근육의 감소가 NS 투여 군보다 DFO 투여군에서 더 적은 것을 확인하였다. 또한 GA muscle 과 TA muscle 을 이용하여 진행한 H&E staining 과 형광 염색을 통해 각 근육 조직의 세포의 크기가 DFO 투여 군이 NS 투여 군보다 더욱 큰 경향을 확인하였고 분자적인 분석에서 근육 감소 관련 인자들의 발현이 줄어든 것을 확인하였다.
지금까지의 결과를 종합하면 DFO 는 db/db mice 에서 오토파지, 단백질 분해, 단백질 합성, 세포 죽음 신호등에 복합적으로 작용하여 근육 소실을
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개선하고 근육 감소증의 진행을 억제한다. 이는 당뇨병성 근육 감소증에서 DFO 약물을 이용한 치료 및 연구의 방향을 제시할 것으로 생각된다.
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