홍어 껍질 유래 콜라겐의 지방대사 조절을 통한 간 조직 지질축적 억제 효과
이현정1․우민지1․송영옥1․노정숙2
1부산대학교 식품영양학과 및 김치연구소
2동명대학교 식품영양학과
Inhibitory Effect of Skate Skin Collagen on Hepatic Lipid Accumulation through Regulation of Lipid Metabolism
Hyun-Jung Lee1, Minji Woo1, Yeong Ok Song1, and Jeong Sook Noh2
1Department of Food Science and Nutrition & Kimchi Research Institute, Pusan National University
2Department of Food Science and Nutrition, Tongmyong University
ABSTRACT Skate is a benthic animal found in the deep sea. Skate byproducts (skin, cartilage, and bone) are generated in large amounts and disposed of as waste during processing. Skate skin contains a high level of collagen, but few studies have investigated the health benefits of collagen beyond those on skin function. Therefore, this study was conducted to investigate the effects of collagen derived from skate skin on lipid metabolism in the liver using an obese animal model. To accomplish this, mice were divided into three experimental groups, Normal (m/m mice), Control (vehicle-treated db/db mice), and Collagen (200 mg/kg body weight collagen-treated db/db mice). Distilled water as the vehicle or collagen was orally administered to mice daily for eight weeks. Plasma and hepatic lipid levels were examined and the expression of hepatic proteins related to lipid metabolism were evaluated by western blotting analysis.
Plasma and hepatic triglyceride and total cholesterol levels were significantly lower in the Collagen group (P<0.05), but were similar to those in the Normal group when compared to the Control. Additionally, expression of hepatic proteins associated with fatty acid synthesis (sterol regulatory element-binding proteins-1, fatty acid synthase, and acetyl-CoA carboxylase α) were decreased in the Collagen group, whereas phospho-activated protein kinase and beta-oxi- dation-related protein (peroxisome proliferator-activated receptor α and acetyl-CoA oxidase 1) were increased (P<0.05).
Moreover, expression of proteins involved in cholesterol synthesis (sterol regulatory element-binding proteins-2) were decreased in collagen-treated mice, but those of the cytochrome P450 family 7 subfamily A member 1, which are involved in cholesterol export, increased (P<0.05). Our findings indicate that collagen derived from skate skin effectively suppressed hepatic lipid accumulation through down-regulation of fatty acid and cholesterol synthesis and up-regulation of beta-oxidation and cholesterol export.
Key words: skate, collagen, fatty acid synthesis, cholesterol synthesis, fatty acid oxidation
Received 16 October 2017; Accepted 6 March 2018
Corresponding author: Jeong Sook Noh, Department of Food Sci- ence and Nutrition, Tongmyong University, Busan 48520, Korea E-mail: [email protected], Phone: +82-51-629-1716
서 론
다량의 지방(>5%)이 비정상적으로 간에 축적된 상태를 지방간이라 하며, 과도한 알코올 섭취, 당뇨병, 고지혈증 및 비만이 주요 위험요인으로 알코올 섭취 없이도 동물성 지방 을 과다하게 섭취하고 운동량이 감소하여 과량의 에너지 섭 취 및 체지방 축적인 경우 또한 비알코올성 지방간(non-al- coholic fatty liver disease, NAFLD)이 유발될 수 있다(1, 2). 2012년 식품의약품안전처 조사연구에 따르면 비알코올 성 지방간의 유병률은 2004년 11.5%에서 2013년 23.6%로 가파른 상승세를 보인다(3). 비알코올성 지방간은 고지혈증
또는 고콜레스테롤혈증과 같은 이상 지질대사와 밀접한 관 련성을 가지기 때문에, 간지방증(steatosis)은 심혈관계질 환 및 대사증후군의 발생에 영향을 미친다(4,5). 또한, 지방 간은 지방간염(steatohepatitis) 및 간경변증, 간암 등으로 까지 이어질 수 있다(6). 따라서 지방간 또는 지방 축적에 의한 간 기능 손상을 방지하기 위해 간 조직에서의 지방대사 조절이 가능한 여러 기능성 물질 또는 식품 등에 대한 탐색 이 요구되고 있다(7).
지방합성 및 대사작용은 주로 간에서 이루어지고 이를 조 절하는 핵심인자로 sterol regulatory element-binding protein(SREBP)은 fatty acid synthase(FAS), acetyl- coenzyme A carboxylase(ACC), 3-hydroxy-3-meth- ylglutaryl CoA reductase(HMGCR) 등 중성지방과 콜레스 테롤 합성에 관련된 효소들의 발현에 관여한다(8). 한편 에 너지 생산계의 하나인 베타산화에서 carnitine palmitoyl-
transferase 1(CPT-1)은 미토콘드리아 내부로 지방산의 이동에 관여하고, peroxisome proliferator activated re- ceptor α(PPARα)에 의해 발현이 증가함으로써 지방산의 베 타산화 경로를 촉진해 세포 내 지방축적을 억제한다(9). 유 전자 변형에 의한 비만 유도 실험동물이나 고지방식이에 의 한 비만 실험모델에서 간의 이상 지질대사에 의한 지방간 상태가 나타난다(10). 이는 간에서 중성지방 및 콜레스테롤 합성이 지나치게 항진되거나, 간으로 식이지방 또는 지방조 직으로부터의 지질대사체 등의 유입이 증가 또는 간이나 다 른 신체조직에서의 지질로부터 에너지 생산이용 감소 때문 이다.
해양생물 유래 콜라겐과 콜라겐 펩타이드는 인체 콜라겐 의 구조와 유사하고 안전성이 검증되었으며, 위장 내벽에 대한 높은 bioavailability가 있고 여러 생리학적 가능성 때 문에 기능성 식품 또는 식이보충제로서 다양하게 사용되고 있다(11-14). 주로 어류 껍질의 효소적 가수분해를 통한 콜 라겐 가수분해물 또는 콜라겐 펩타이드 형태이며, 이는 흡수 율이 낮은 젤라틴 형태에서 흡수율을 높이기 위한 가공단계 이다. 콜라겐의 생체흡수율에 대한 연구로서 14C-label된 콜라겐(분자량 2.5~15 kD)의 투여 결과 혈액과 조직에서 192시간 동안 검출되었으며(15), 생체 대상 실험으로 대구 어피 콜라겐(분자량 1~5 kD)의 체중당 30.8~384.6 mg 단 회 경구 투여 시 투여 1시간에 혈액에서 hydroxyproline의 최대농도를 나타내었다(16). 콜라겐은 피부의 주요 기질 단 백질로서 대부분 피부 기능 개선에 대해 보고되어 있다(17, 18). 또한, 몇 가지 대사적 기능성에 대하여 인체 대상 적용 시험에서 2형 당뇨환자 대상으로 당과 지질 대사에 긍정적 인 영향(19), 비만인의 지질대사 개선(20), 초기 알코올성 간 장애의 개선(21), 그리고 항고혈압 효과(22) 등이 보고되 어 있다. 일부 rat에 지질과 콜라겐을 동시에 경구 투여하여 지질의 흡수 및 혈액의 지질 농도에 미치는 영향에 대한 연 구도 있다(23). 그러나 콜라겐의 지질대사에 미치는 구체적 인 기전에 대해서는 밝혀지지 않았다. 따라서 본 연구에서는 홍어 껍질 유래 콜라겐이 비만 유발 마우스의 간 조직에서 지질합성 및 분해와 관련된 대사작용에 미치는 영향을 살펴 보고자 하였다.
재료 및 방법
재료
본 연구에 사용된 홍어 껍질 콜라겐은 (주)영산홍어(Naju, Korea)에서 공급받아 이용하였다. 제조과정을 간단히 언급 하면 홍어 껍질을 열수 추출한 다음 단백질 가수분해 효소 alcalase와 flavourzyme(Novozyme, Bagsvaerd, Den- mark)을 이용하여 가수분해한 후, 여과 및 농축을 거쳐 동결 건조(SFDSM06, Samwon Co., Seoul, Korea)하여 실험에 사용하였다(24). 홍어 껍질 콜라겐의 분자량은 gel perme- ation chromatography(Shimadzu, Kyoto, Japan)를 이용
하여 측정하였으며, 평균 분자량은 1 kD 정도였다.
실험동물 및 실험식이
본 연구에 사용한 C57BL/KsJ m/m 마우스 및 db/db 마 우스는 7주령 수컷으로 Japan SLC Inc.(Shizuoka, Japan) 에서 생산하여 중앙실험동물(주)(Seoul, Korea)를 통하여 공급받았다. 1주일간의 적응 기간 후 m/m 마우스는 정상대 조군(Normal group)으로, db/db 마우스는 체중과 혈당을 측정하여 난괴법에 의해 비만대조군(Control group), col- lagen 투여군(Collagen group)으로 나누어 8주간 사육하였 다. 일반 고형식이(Envigo Korea Co., Seoul, Korea)를 모 든 실험동물에게 공급하였으며, 그 조성은 탄수화물 44.2%, 조단백질 18.6%, 지방 6.2%였다. 정상대조군과 비만대조군 에는 vehicle로 증류수를 투여하였고, 콜라겐 투여군은 콜 라겐을 체중당 200 mg을 증류수에 녹여 8주 동안 1일 1회 경구 투여하였다. 물과 식이는 제한 없이 공급하였고 사육실 온도는 18±2°C로 유지하였으며, 조명은 12시간 주기로 조 절하였다. 실험 기간 동안 실험동물의 체중은 주 1회 일정한 시간에 측정하였고, 식이섭취량은 2일 간격으로 측정하였 다. 본 연구에서의 모든 동물실험은 부산대학교 동물실험윤 리위원회의 승인 하에 수행되었다(PNU-2016-1354).
채혈 및 장기 무게 측정
실험동물은 희생 전 12시간 동안 절식 후 CO2 가스로 마 취하고 개복하여 심장에서 채혈하였다. 혈액은 30분 정도 실온 방치 후 바로 원심분리(3,000 rpm, 20 min) 하여 혈청 을 분리하였으며 혈당 및 혈장지질, alanine aminotrans- ferase(ALT), aspartate aminotransferase(AST) 농도는 당일 바로 측정하였다. 혈액 채취 후 즉시 간을 적출하고 차가운 생리식염수에 세척한 다음 여과지로 여분의 물기를 제거하여 무게를 측정하였다. 채취한 간은 액체질소로 급속 냉동시킨 후 -70°C에 보관하였다.
혈액 및 간 조직 지질 분석
혈장 중성지질 및 총콜레스테롤 함량은 분석 kit(Asan Co., Seoul, Korea)을 이용하여 측정하였다. 간 조직 내의 지질은 Folch 등(25)의 방법으로 추출하였다. 즉 1 g의 간 조직을 생리식염수 3 mL에 넣고 균질화시킨 후 추출용액 (chloroform : methanol, 2:1, v/v)을 9 mL 넣고 균질화하 였다. 균질액은 3,000 rpm에서 10분간 원심분리 하고 아래 층을 취하여 증발시켜 지질을 추출하였으며, 다시 에탄올에 용해한 측정용 kit(Asan Co.)을 이용하여 총콜레스테롤과 중성지방 함량을 측정하였다.
Western blot
Western blot assay 시료로 whole cell 추출물을 사용하 였다. 즉 간 조직에 nonidet-P40(NP40) lysis buffer[50 mM Tris(pH 8.0), 5 mM ethylenediaminetertraacetic
Table 1. Antibodies used in western blot analysis
Primary antibody Secondary antibody
FAS p-AMPK
Fatty acid synthase (ab22759; Abcam Inc., Cambridge, UK)
Phospho-activated protein kinase (#2535, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA)
Rabbit Anti-Mouse IgG H&L (HRP) (ab6728, Abcam Inc.) SREBP-1
ACCα PPAR-α CPT-1 ACOX-1 SREBP-2 HMGCR CYP7A1 α-Tubulin
Sterol regulatory element-binding proteins-1 (sc-366; Santa Cruz Biotech., Santa Cruz, CA, USA)
Acetyl-CoA carboxylase alpha (sc-26817; Santa Cruz Biotech.)
Peroxisome proliferator-activated receptor alpha (sc-9000; Santa Cruz Biotech.) Carnitine palmitoyltransferase 1 (sc-139482; Santa Cruz Biotech.)
Acetyl-CoA oxidase 1 (sc-98499; Santa Cruz Biotech)
Sterol regulatory element-binding proteins-2 (sc-5603; Santa Cruz Biotech.) 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase (sc-33827; Santa Cruz Biotech.) Cytochrome P450 family 7 subfamily A member 1 (sc-25536; Santa Cruz Biotech.) α-Tubulin (EP1332Y) (ab52866, Abcam Inc.)
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) (ab6802, Abcam Inc.)
Table 2. Effect of skate skin collagen on body weight and food intake of obese db/db mice
Group1) Body weight (g) Food intake (g/d) Initial Final
Normal Control Collagen
25.3±0.8***
45.0±3.0 44.2±2.3
27.3±0.8***
53.3±3.0 49.7±3.5*
3.8±0.1***
6.1±0.5 6.4±0.7
1)Normal, m/m mice; Control, vehicle-treated db/db mice; Colla- gen, collagen derived from skate skin-treated db/db mice (200 mg/kg bw/d).
Date are mean±SD (n=10 each group).
*P<0.05, ***P<0.001 compared to the control group using Dun- nett’s post-hoc test.
acid(pH 8.0), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM D,L-di- thiothreitol, 1 mM phenylmethylsufonyl fluoride]와 pro- tease inhibitor cocktail(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA, 100:1, v/v)을 혼합하여 첨가한 후 균질화하였 다. 균질액을 1시간 동안 얼음에 보관한 후 4°C에서 12,000 rpm으로 20분간 원심분리 하여 얻은 상층액을 조직 단백질 추출액으로 사용하였다. 추출물의 단백질 농도는 단백질 정 량 시약(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)으로 측정하였으며, 동량의 단백질을 함유하도록 희석하고 Laemmli sample buffer(Bio-Rad)와 β-mercaptoethanol을 섞어 western blot 분석용 시료로 제조하였다.
단백질 발현을 확인하기 위하여 시료를 8% sodium do- decyl sulphate-polyacrylamide gel(SDS-PAGE)에 load- ing 한 후 90 V 전압으로 2시간 동안 전기영동(SDS Elec- trophoresis, Power Pac300, Bio-Rad)하여 단백질을 분 리하였다. 분리된 단백질은 nitrocellulose membrane(0.45 μm pore size, Whatman, Dassel, Germany)으로 이동시킨 후 5% skim milk(w/v)에서 1시간 동안 blocking 하였다.
1차 항체인 SREBP-1, SREBP-2, FAS, ACCα, phospho- activated protein kinase(p-AMPK), HMGCR, cyto- chrome P450 family 7 subfamily A member 1(CYP7A1), PPARα, CPT-1, acetyl-CoA oxidase 1(ACOX-1), α- tubulin(Table 1)을 5% skim milk에 희석한 후 membrane 에 분주하여 4°C에서 over-night 시킨 후 TBST buffer를 이용하여 세척하고, 2차 항체를 반응시킨 후 다시 세척하였 다. 도출된 밴드의 동정은 enhanced chemiluminescence 용액으로 발색시켜 CAS-400SM(Davinch-K, Seoul, Korea) 으로 촬영하였다. 단백질 발현은 Image J software(Image J, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 측정하였고, 단백질의 발현 정도는 α-tubulin에 대한 비율로 보정하여 표시하였다.
통계처리
모든 실험결과는 SPSS/PC package 20(IBM, New York,
NY, USA)을 사용하여 평균과 표준편차를 구하였으며, one- way ANOVA analysis를 실시한 후 Dunnett’s post-hoc test로 P<0.05 수준에서 유의차를 검증하였다.
결과 및 고찰
홍어 껍질 유래 콜라겐의 체중 및 사료섭취량에 미치는 영향
C57BL/KsJ db/db mice는 시상하부에 존재하는 비만 호 르몬 leptin 수용체의 유전적 돌연변이로 시상하부에서 leptin의 신호전달과정에 결함이 생겨 과도한 식이 섭취 및 고혈당, 지방축적으로 간에서 당대사 및 지질대사 이상이 나타나고 비만, 2형 당뇨 등의 특징을 나타내는 실험동물이 다(26). 본 연구에서도 비만대조군인 db/db mice의 체중 및 사료섭취량은 정상군인 m/m mice보다 유의적으로 높게 나타났으나, 8주간의 콜라겐 섭취군에서 사료섭취량은 대조 군과 유의적 차이를 나타내지 않았지만 체중에서 6.7% 정도 유의적인 감소가 나타났다(Table 2). 고혈당의 특징을 나타 내는 db/db mice에서 사육 기간 동안 혈액 중의 glucose 농도를 측정한 결과, 정상군보다 비만대조군에서 혈당이 유 의적으로 상승하였으나, 콜라겐 투여로 인한 유의적인 변화 는 관찰되지 않았다(data not shown).
Table 3. Effect of skate skin collagen on plasma AST and ALT levels
Group1) AST(IU/L) ALT(IU/L) Normal
Control Collagen
26.3±9.2***
98.8±31.5 61.6±16.1**
15.9±1.4***
283.2±58.9 127.6±41.7*
1)Normal, m/m mice; Control, vehicle-treated db/db mice; Colla- gen, collagen derived from skate skin-treated db/db mice (200 mg/kg bw/d).
Date are mean±SD (n=10 each group).
*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared to the control group using Dunnett’s post-hoc test.
A B
C D
Fig. 1. Effect of skate skin collagen on plasma and hepatic lipid levels. Normal, m/m mice; Control, vehicle-treated db/db mice;
Collagen, collagen derived from skate skin-treated db/db mice (200 mg/kg bw/d). Date are mean±SD (n=10 each group). *P<0.05,
**P<0.01, ***P<0.001 compared to the control group using Dunnett’s post-hoc test.
홍어 껍질 유래 콜라겐의 혈장 AST 및 ALT에 미치는 영향 db/db mice 혈장의 AST 및 ALT 농도는 정상대조군인 m/m mice보다 유의적으로 각각 약 4배 및 18배 정도 급격 히 상승하였다(Table 3). 그러나 홍어 껍질 유래 콜라겐을 8주간 투여한 결과 비만대조군에 비해 AST 및 ALT 모두 유의적으로 각각 37.7%와 54.9% 낮아졌다. 이는 콜라겐이 비만 또는 간에서의 지방대사 이상에 의한 간 조직 기능 손 상에 대한 보호 효과가 있을 것으로 생각한다. 여러 연구에 의하면 비만 및 2형 당뇨 유발 동물모델인 db/db mice에서 간 손상지표인 AST 및 ALT의 농도가 정상군보다 크게 높 아짐을 보고하였으며, 이는 본 연구와 일치하였다(27,28).
AST 또는 ALT는 간세포에 존재하는 효소로 고지방식이, 또는 기타 여러 요인에 의해 간세포에 장애가 발생하여 간세 포가 파괴되면 혈액 중으로 방출이 항진되어 나타나는 것으
로 알려져 있다(29).
홍어 껍질 유래 콜라겐의 혈장 및 간 조직 중성지방 및 총콜레스테롤 농도에 미치는 영향
혈액과 간 조직의 지질 농도를 측정한 결과는 Fig. 1과 같다. 중성지방과 총콜레스테롤 농도는 혈액과 간 조직 모두 에서 정상군보다 비만대조군에서 유의적으로 증가하였다.
이렇게 증가한 지질 농도는 콜라겐을 투여한 군에서 모두 유의적으로 감소하였다.
간은 중성지방과 콜레스테롤의 주요 생합성 장소이고 대 사가 이루어지는 장기이다. 간에서 합성된 중성지방이나 콜 레스테롤 등이 정상적으로 대사되지 못하고 축적되면 지방 간이 유발된다. 간 조직 내에 축적된 중성지방 함량이 간 무게의 5~10% 정도일 때 비알코올성 지방간이라 하고, 이 는 과도한 식이지방의 섭취, 백색지방조직에서의 지방분해 증가, 특히 free fatty acid의 증가, 그리고 간 조직 내의 de novo lipogenesis에 기인한다(30). 본 실험에서 간 조직 내의 중성지방의 농도는 control군에서 간 무게 대비 약 4%
정도였다. 따라서 비만대조군의 간의 병리학적 특성은 비알 코올성 지방간 직전의 상태인 간지방증인 것으로 생각한다.
그러나 콜라겐을 200 mg/kg 경구 투여한 db/db mice의 간 조직 내 중성지방의 함량은 정상군과 유사한 정도로 낮아 졌다. 유사한 연구결과로는 닭 유래 콜라겐을 동맥경화모델 마우스에 급여한 결과 혈중 콜레스테롤과 간 조직의 총지질 및 중성지질 함량이 낮아졌다(31). 이로써 콜라겐 급여는
Fig. 2. Effect of skate skin collagen on hepatic protein expression related to fatty acid synthesis. Normal, m/m mice; Control, vehicle-treated db/db mice; Collagen, collagen derived from skate skin-treated db/db mice (200 mg/kg bw/d). Date are mean±SD (n=10 each group). *P<0.05, **P<0.01 compared to the control group using Dunnett’s post-hoc test.
db/db mice의 혈중 지질 농도를 낮추고 간 조직에서 지방축 적을 효과적으로 억제하는 것으로 보이며, 이는 중성지방 농도에 영향을 미치는 지방산 대사, 즉 지방산 합성의 억제 나 분해에 관여할 것으로 생각한다.
홍어 껍질 유래 콜라겐의 지방산 합성에 미치는 영향 비만대조군인 db/db mice의 간 조직에서 지방산 합성과 관련된 단백질의 발현을 측정한 결과 정상대조군에 비해 SREBP-1의 전구체(precursor) 대비 활성형(mature) 발현 이 거의 2배 정도 증가하였고, 지방산 합성 효소인 FAS 및 ACCα의 발현도 각각 5배 및 2배 정도 크게 증가하였다(Fig.
2). 또한, 지방산 합성 효소의 억제작용이 있는 것으로 알려 진 p-AMPK는 정상군보다 비만대조군에서 유의적으로 58.8% 감소하였다. 그러나 비만대조군과 비교하였을 때 콜 라겐 투여군에서 SREBP-1 발현은 44.2%, FAS 59.5%, ACCα 57.5% 감소했지만, p-AMPK는 82.5% 유의적으로 증가하였다. 최근 발표된 연구에 따르면 참치 껍질 유래 콜 라겐을 palmitate로 lipogenesis를 유도한 간세포(HepG2 cell)에 처리한 결과, 세포 내 지방축적이 억제되었으며 지방 세포(3T3-L1 cell)에서도 같은 결과를 나타내었다(32). 이 러한 결과를 종합하여 살펴보았을 때, 홍어 껍질 유래 콜라겐 이 지방산 합성 관련 핵 전사인자의 활성을 억제하고 그 타 깃 인자인 지방산 합성 효소를 제어하여 간 조직 내의 중성 지방 함량이 감소한 결과에 영향을 미치는 것으로 생각한다.
비만 상태가 되면 지방조직의 과도한 증가가 일어나고, 지방조직에서 혈중으로 유리지방산의 방출이 늘어난다(33).
혈중 유리지방산의 증가는 간으로의 유리지방산 유입이 증 가하는 것과 밀접한 관련이 있으며, 이러한 현상은 간에서 중성지방의 합성을 촉진한다(34). 간에서 지방산 및 중성지 방 합성과 관련이 깊은 핵 전사인자인 SREBP-1은 비알코 올성 지방간 상태에서 유전자 발현이 증가한다. 그에 따라 acetyl-CoA에서 malonyl-CoA로의 합성을 촉매하는 효소
인 ACC 및 탄소골격에 계속 acetyl-CoA를 추가해서 지방 산 사슬을 연장하는 효소인 FAS 모두 그 발현이 증가한다.
또한, 에너지 대사에서 AMPK는 인산화가 되어 활성화되며 당과 지방산을 이용한 ATP 생성을 촉진하게 된다. 그리고 활성화된 p-AMPK는 ACC에 대해 대사적 저해작용을 나타 내는데, p-AMPK의 발현 증가는 직접 간에서의 지방합성이 억제됨을 나타낸다(35). 따라서 비만 또는 지방간 상태에서 홍어 껍질 유래 콜라겐의 투여는 SREBP-1과 지방산 합성 효소의 억제 및 AMPK의 활성화를 촉진하고 효과적으로 지 방산 합성을 억제하여 간에서의 중성지방 농도 및 축적을 저해한 것으로 생각한다.
홍어 껍질 유래 콜라겐의 콜레스테롤 대사에 미치는 영향 간 조직 내에서 콜레스테롤 대사를 조절하는 핵 전사인자 인 SREBP-2의 발현 증가는 콜레스테롤 합성 효소인 HMGCR 을 증가시키고, 담즙산 합성 효소인 CYP7A1을 감소시킨다 (36). 비만이 유발된 db/db mice 간 조직에서 콜레스테롤 대사 관련 단백질 발현을 측정한 결과 정상군과 비교하였을 때, SREBP-2(mature/precursor)와 HMGCR의 발현은 각 각 2.5배 정도 유의적으로 증가하였고 CYP7A1은 70% 유 의적으로 감소하였다(Fig. 3). 그러나 비만대조군보다 콜라 겐 투여군에서 SREBP-2는 53% 유의적으로 감소하였고, HMGCR의 발현은 유의적이지 않지만 53% 감소하였다. 또 한, CYP7A1의 발현은 대조군보다 100% 유의적인 증가를 나타내었다. 이러한 결과는 비만 상태일 때 간에서 콜레스테 롤 합성 대사가 증가하고, 그에 따라 간 조직 및 혈중 콜레스 테롤 농도가 높아지게 되어 중성지방의 합성과 연관되어 지 방간으로 진행될 것으로 생각한다. 그러나 콜라겐을 8주간 db/db mice에 경구 투여한 결과 간 조직 및 혈액의 콜레스 테롤 농도를 낮추었는데, 이는 콜레스테롤 합성을 조절하는 SREBP-2를 억제하고 콜레스테롤로부터 담즙산으로의 합 성을 촉진하는 기전을 조절하는 것으로 생각한다.
Fig. 3. Effect of skate skin collagen on hepatic protein expression related to cholesterol metabolism. Normal, m/m mice; Control, vehicle-treated db/db mice; Collagen, collagen derived from skate skin-treated db/db mice (200 mg/kg bw/d). Date are mean±SD (n=10 each group). *P<0.05, **P<0.01 compared to the control group using Dunnett’s post-hoc test.
Fig. 4. Effect of skate skin collagen on hepatic protein expression related to fatty acid oxidation. Normal, m/m mice; Control, vehicle-treated db/db mice; Collagen, collagen derived from skate skin-treated db/db mice (200 mg/kg bw/d). Date are mean±SD (n=10 each group). *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared to the control group using Dunnett’s post-hoc test.
SREBP-2는 간에서 주로 발현되며, 콜레스테롤 대사와 깊은 관련이 있다. 고지방식이에 의한 비만동물모델의 간 조직에서 그 발현이 증가하며, downstream target gene인 콜레스테롤 합성 효소 HMGCR의 발현이 증가한다(37,38).
따라서 비만 또는 지방간 상태에서 콜레스테롤의 합성이 증 가하며, 이는 간에 축적되거나 혈액으로의 방출이 증가하고 고콜레스테롤혈증 유발과 관련이 깊다. CYP7A1은 콜레스 테롤을 담즙산으로 전환하는 속도제한 효소이다. 고지방식 이 유발 비만동물모델의 간에서 CYP7A1의 발현이 증가하 는 것으로 보고되고 있는데(39), 유전자변형에 의한 비만동 물모델인 db/db mice에서는 그 발현이 감소하는 것으로 보 고된 바 있다(40). 본 연구에서도 db/db mice의 CYP7A1의 발현이 m/m mice보다 감소하였고, 이는 콜레스테롤의 담즙 산으로의 합성이 감소함과 동시에 콜레스테롤 생합성이 증 가하여 조직 내 축적이 더욱 촉진될 것으로 여겨진다. 이와 는 반대로 콜라겐을 섭취한 db/db mice에서 CYP7A1의 발
현이 현저히 증가한 결과는 간 조직 내의 콜레스테롤의 농도 를 낮추는 데 기여하는 하나의 요인이 될 수 있을 것이다.
홍어 껍질 유래 콜라겐의 지방산 베타산화에 미치는 영향 간세포에서 지방산 산화와 관련된 인자로 PPARα, CPT- 1, ACOX-1 발현을 측정하였다(Fig. 4). 지방산의 베타산화 를 통해 에너지 생산과 관련된 인자 모두 정상군보다 비만대 조군에서 유의적으로 감소하였다. 그러나 콜라겐 투여군에 서 측정한 결과 비만대조군에 비해 PPARα가 97%, ACOX- 1이 78% 정도 유의적으로 증가하였고, CPT-1 또한 유의적 이지 않지만 75% 증가하였다. 간의 지질대사 조절과 관련 깊은 중요한 핵 전사인자로 PPARα가 있는데, 이는 지방산 의 베타산화에 관여한다. 지방산의 베타산화 과정은 미토콘 드리아와 퍼옥시좀(peroxisome)에서 일어나며, CPT-1은 미토콘드리아 베타산화의 속도제한 효소이며, ACOX-1은 퍼옥시좀 베타산화 과정에 중요한 효소이다(41,42). 본 연
구결과 유전자변형 비만 유발 동물에서는 정상 마우스에 비 해 간에서의 지방산을 이용한 에너지 생성 대사과정이 저하 되어, 그 결과 간 조직 내 지방 축적이 더욱 촉진되는 것으로 보인다. 그러나 홍어 껍질 유래 콜라겐을 8주간 투여한 결과 콜라겐은 지방산 산화 대사과정을 촉진하는데, 이는 핵 전사 인자인 PPARα의 발현을 증가시킴으로써 간에서의 지방산 이용률을 높여 간의 지질축적을 효과적으로 억제하는 것으 로 생각한다.
본 연구에서는 db/db mice를 사용하여 비만과 2형 당뇨 가 유발되면서 동시에 간 조직에 비정상적인 지방대사와 그 로 인한 과도한 지방축적에 미치는 홍어 유래 콜라겐의 영향 을 살펴보고자 하였다. db/db mice의 특징으로 고인슐린혈 증과 이상지질혈증이 유발되며, 간에서 지방합성 대사가 항 진되었고, 에너지 생성과 관련된 지방산의 베타산화는 감소 하였다. 그러나 이에 대해 콜라겐을 8주간 경구 투여한 결과 간에서의 지질 관련 대사장애는 단기간 효과이긴 하지만 어 느 정도 개선된 것으로 생각한다. 다만 wild type mice에서 의 콜라겐 보충투여에 대한 안전성 검증과 간 조직에서의 대사조절 메커니즘 규명에 대해 유전자 수준에서의 결과검 증이 다소 미흡한 것으로 생각된다. 또한, 홍어 콜라겐의 흡 수율, 혈중 함량 분석, 콜라겐 유래 효능 추정 성분 등에 대한 연구가 더 필요할 것이다.
요 약
홍어의 가공과정 중 발생하는 부산물인 껍질에서 추출된 콜 라겐의 비만 쥐에서 지질대사에 미치는 영향에 대해 알아보 고자 하였다. 랩틴 수용체의 유전적 결핍으로 사육 기간에 따라 비만 및 당뇨가 유발되는 동물모델인 db/db mice에 홍어 껍질 유래 콜라겐을 200 mg/kg bw/d로 8주 동안 경구 투여하였고(콜라겐 투여군), 그 효과를 정상군(m/m mice) 및 비만대조군(db/db mice)과 비교하였다. 실험 8주의 비만 쥐의 체중은 정상군보다 유의적으로 증가하였고, 콜라겐 투 여군에서 비만 쥐에 비해 48.8% 감소하였다. 그러나 비만군 과 콜라겐군 사이의 식이섭취량의 차이는 나타나지 않았다.
혈액의 중성지질과 총콜레스테롤의 농도는 비만군에서 정 상군보다 증가하였는데, 콜라겐을 경구 투여한 결과 혈중 지질의 농도는 각각 24.1% 및 29.3% 유의적으로 감소하였 다. 또한, 간 조직의 중성지질과 총콜레스테롤의 함량을 측 정한 결과도 혈액에서의 결과와 유사한 경향을 나타내었다.
콜라겐을 급여한 결과 비만대조군에 비해 중성지질과 총콜 레스테롤의 농도는 각각 26.0% 및 8.5% 감소하였다. 간에 서 홍어 껍질 유래 콜라겐의 지질합성 및 분해와 관련된 대 사작용에 미치는 영향을 western blotting 방법을 통해 확 인하였다. 지방합성 및 대사작용의 핵심 인자인 SREBP-1, SREBP-2, FAS, ACCα 등이 정상 쥐보다 비만 쥐의 간 조직 에서 단백질 발현이 유의적으로 증가하였고, 콜라겐을 투여 한 군에서 감소하였다. 또한, 에너지 생산계의 하나인 지방
산 베타산화 인자인 PPARα와 ACOX-1은 반대로 비만 쥐의 간 조직에서의 발현이 정상 쥐보다 감소하였는데, 콜라겐 투여군에서 유의적으로 증가하였다. 따라서 본 연구의 결과 로 살펴보았을 때, 효소적 가수분해를 통해 얻은 홍어 껍질 유래 콜라겐을 비만 쥐에 경구 투여하였을 때 체중증가를 억제하고, 혈액과 간의 지질 농도를 감소시켰다. 이는 콜라 겐이 간에서의 지질합성 관련 인자의 억제 및 지방산 분해를 촉진하는 대사과정을 조절하여 비만에서 지질대사를 개선 할 것으로 생각한다.
감사의 글
본 연구는 중소기업청의 기술혁신개발사업의 일환으로 수 행하였음(S2409860, 홍어 껍질 유래 저분자 콜라겐 펩타이 드의 전임상 및 인체적용실험을 통한 체지방 감소 기능성 원료 개발 및 산업화).
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