흰쥐 경골의 신연 골형성술에서 염증성 싸이토카인의 발현

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목 적: 본 연구의 목적은 신연 골형성술에서의 염증성 싸이토카인의 발현 양상을 일반 골절 치유 과정과 비교하는 것이다.

대상 및 방법: 흰쥐 경골의 단순 골절 치유 모델과 신연 골형성술 모델을 대상으로 3주에 걸쳐서 단계적으로 골 조직을 채 취하였다. 총 리보핵산을 추출하고 각종 염증성 싸이토카인 발현의 시간적 변화를 검사하였다. 수술 후 7일과 9일째에 조 직에서 면역조직화학 검사를 통해서 IL-6의 공간적 발현 양상을 조사하였다.

결 과: IL-1 , IL-6는 단순 골절 치유 과정에서 수술 후 1일째에 발현이 절정에 달하였다가 3일째부터 발현이 감소하여 수 술 전 상태로 회복되었다. IL-1 는 신연 골형성술 중 신연 기간에도 발현의 변화가 없었으나 IL-6은 신연을 시작함에 따라 다시 발현이 증가하는 양상을 보였다. 면역조직화학 검사상 IL-6은 골수 세포 뿐 아니라 연골세포, 골모세포 그리고 신연 간격의 미성숙 간엽세포에서 발현이 확인되었다.

결 론: 신연 변형력에 의한 IL-6의 발현이 유도되는 것을 확인하였으며, 이는 조절된 염증 반응이 신연 골형성술 과정에서 신생골 형성에 부분적으로 기여할 가능성을 시사하는 것으로 생각된다

색인 단어: 신연 골형성술, 염증성 싸이토카인, IL-6

Department of Orthopaedic Surgery, Seoul National University College of Medicine, Seoul, Korea

Expression of Pro-inflammatory Cytokines during Distraction Osteogenesis of the Rat Tibia

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흰쥐 경골의 신연 골형성술에서 염증성 싸이토카인의 발현

황일웅ㆍ조태준ㆍ최인호ㆍ정진엽ㆍ유원준ㆍ김은희

서울대학교 의과대학 정형외과학교실

81 81 통신저자 : 조 태 준

서울시 종로구 연건동 28 서울대학교 어린이병원 정형외과 TEL: 02-760-2878∙FAX: 02-745-3367

E-mail: [email protected]

*본 연구는 한국학술진흥재단(KRF-2001-041-F00203)의 지원에 의한 것임.

Address reprint requests to Tae-Joon Cho, M.D.

Department of Orthopaedic Surgery, Seoul National University Children’s Hospital, 28 Yongon-dong, Chongno-gu, Seoul 110-744, Korea Tel: +82.2-760-2878, Fax: +82.2-745-33677

E-mail: [email protected]

Il Ung Hwang, M.D., Tae-Joon Cho, M.D., In Ho Choi, M.D., Chin Youb Chung, M.D., Won Joon Yoo, M.D., and Eun Hee Kim, M.S.

Purpose: The purposes of this study were to investigate the expression pattern of pro-inflammatory cyto- kines during distraction osteogenesis and to compare these with expression during simple fracture healing.

Materials and Methods: Regenerated bones from the rat tibia subjected distraction osteogenesis and simple fracture healing models were harvested over three-week periods. Temporal expressions of mRNA of pro-inflammatory cytokines were investigated by RNase protection assay. Immunohistochemical studies for IL-6 were performed in postoperative day 7 and 9 tissue section specimens.

Results: IL-1 and IL-6 produced detectable signals, while IL-1 , TNF and TNF did not. The mRNA expressions of IL-1 and IL-6 were markedly upregulated on postoperative day 1 and then subsided to the preoperative level. IL-1 mRNA expression remained the same even when distraction began. However, IL-6 mRNA expression was reactivated during the distraction phase. Immunohistochemical study revealed the expressions of IL-6 not only at the transitional zone of the transchondroid ossification, in young oste- oblasts lining newly formed trabeculae and in hematopoietic cells in the marrow but also in primitive mes- enchymal cells at the distraction gap.

Conclusion: Distraction strain re-induced IL-6 expression during distraction osteogenesis, which suggests that well-controlled inflammatory reaction might contribute to active new bone formation in distraction osteogenesis.

Key Words: Distraction osteogenesis, Pro-inflammatory cytokine, IL-6

신연 골형성술은 신연 변형에 의해서 신생골 형성을 유 도하는 독특한 과정이다. 이미 임상적으로는 골 연장술이 나 골 이동술(bone transport)를 통해서 사지 재건술의 중요한 수단으로 널리 사용되고 있다. 그러나 신연 변형 이 어떠한 기전에 의해서 신생골 형성을 유도하는지는 아 직 완전히 규명되어 있지 않다. 신연 골형성술에서는 골 형성 단백(BMP)6,22,30,32), TGF , IGF¹²⁾, VEGF (vas- culoendothelial growth factor)⁷⁾ 등의 발현 양상에 대해서 보고되었다. 이들의 발현이 항진됨으로써 혈관 신생과 신생골 형성이 촉진된다고 생각되고 있으나 신연 변형이 직접적으로 이들의 발현을 항진시키는지, 아니면 다른 기전을 통해서 간접적으로 이러한 성장인자의 발현 을 촉진하는지는 분명하지 않다.

신연 골형성술을 독특한 형태의 골절 치유로 간주한다 면, 골절 치유와 같이 염증기, 재생기 및 재형성기로 구 분할 수 있다. 피질골 절골술 후 일정 기간 경과하는 것 은 염증기가 지나고 나서 신연 변형이 시작되는 것으로 볼 수 있으며, 신연 기간은 일종의 재생기로 볼 수 있다.

신연이 끝나고 나서 외고정 장치를 제거할 때까지의 강화 기는 재생기와 재형성기의 복합적인 과정으로 생각된다.

단순 골절 치유에서 염증기에 발현이 항진되는 염증성 싸이토카인들로는 IL-1 , TNF , IL-6 등이 대표적이 다²¹⁾. 이들 염증성 싸이토카인들은 조혈계와 면역계에서 의 조절 역할 뿐 아니라 파골세포의 분화와 활성화, 그리 고 골모세포의 초기 recruitment와 분화에도 작용하는 것으로 알려져 있다⁷⁾. 따라서, 이들 염증성 싸이토카인들 이 신연 골형성술에서 골 형성에 일부 기여할 가능성이 있다고 생각된다. 본 연구의 목적은 이들 염증성 싸이토 카인들의 발현이 단순 골절 치유와 신연 골형성술에서 어 떻게 차이나는 지를 확인하고자 하는 것이다.

연구대상 및 방법

1. 실험동물 및 수술

체중이 250-300 gm인 Sprague-Dawley계 흰쥐 (Rattus novergicus)에서 이미 발표된 방법에 따라^6,7) 신연 골형성술을 시행하였다. 간단히 기술하면, 전신 마 취 하에 흰쥐의 좌측 경골에 4개의 K-강선을 경골 장축 에 수직이 되도록 골간부에 삽입하고 피부와 골막을 한 꺼번에 종적으로 절개하여 골간부를 노출하였다. K-강 선으로 3개 이상의 천공을 하고, 미세 가위로 경골을 중

앙 골간부에서 절골하였다. 식염수 관류 후 흰쥐용 양측 성 골 외고정 기구를 부착하고 창상을 봉합하였다. 신연 골형성술 군에서는 7일간의 휴지기 후 수술 후 7일째부터 13일까지 7일간 하루 0.5 mm를 두번에 나누어서 절골 편을 신연하였으며 수술 후 21일까지는 더 이상의 신연 없이 골 외고정 기구를 유지하였다. 단순 골절 치유군에 서는 수술 후 더 이상의 조작 없이 방치하였다.

2. 조직 채취 및 처리

수술 전과 수술 후 1일, 3일, 5일, 7일(신연 시작 직전) 까지는 두 실험군에서 공통적으로 조직을 채취하였다. 여 기에 신연 골형성술군에는 수술 후 9일, 14일, 21일에 채 취한 조직이 추가되었고, 단순 골절 치유 군에는 수술 후 9일, 14일, 21일에 채취한 조직이 추가되었다. 골막만을 남기고 연부조직을 제거한 후 양쪽 골편을 약 3-4 mm 포함하여 신연 간격의 골 조직을 채취하고 총 리보핵산 (total RNA)을 추출하였다. 골-가골 조직에서 총 리보 핵산의 추출은 Chomcynski와 Sacchi의 방법을¹¹⁾응용 하여 이미 보고된 방법에 의해서 시행하였다^6,7). 이를 간 단히 기술하면, 채취한 시료를 액체 질소에 보관하였다가 guanidium thiocyanate 4 M, sodium acetate 25 mM, sarcosyl 0.5% 용액(용액-D)에 혼합하여 6700 Freezer/Mill (Spex, Edison, NJ, USA)을 이용하여 분쇄하였다. 상온에서 원심분리하여 불용성 부분을 제거 한 후, 2 M sodium acetate pH 4.0를 0.1배 첨가하고 산성 phenol (Sigma, St. Louis, MO, USA)로 추출 하였다. 수용액 층을 분리하여 isopropanol로 침전시키 고, 이 과정을 반복하여 얻은 침전물을 총 리보핵산의 농 도가 0.9-1.1 g/L이 되도록 희석하였다.

면역조직화학 검사를 위한 조직은 신연 직전인 수술 후 7일과 신연 중인 수술 후 9일째 조직에서 시행하였다.

조직 절편의 제작은 이미 발표된 바와 같이 시행하였다⁷⁾. 골막과 극히 일부분의 심부 근육층만을 남기고 연부조직 을 제거한 후 외고정 장치를 유지한 채 경골을 4% para- formaldehyde buffer에 16시간 이상 고정한 후, 10%

EDTA-Tris (pH7.4)로 3주간 탈회시키고 통상적인 방 법으로 파라핀에 포매하였다.

3. 리보핵산 발현 검사

IL-1 , IL-1 , IL-6, TNF , TNF , 그리고hou-

sekeeping genes (L32 and GAPDH)의 리보핵산 발현은 RiboQuant (Pharmingen, San Diego, CA, USA)를 사용하여 리보핵산 분해효소 보호 검사법(RNa- se protection assay)으로⁹⁾ 검사하였다. 염증성 싸이 토카인의 탐식자는 Pharmingen 사의 플라즈미드 세트 (rCK1 multiprobe template set, Pharmingen, San Diego, CA, USA)를 구입하여 제작하였다.

리보핵산 분해효소 보호 검사법(RNase protection assay)을 간단히 기술하면, 검사하고자 하는 유전자들의 탐식자 template (rCK1 multiprobe template set, Pharmingen, San Diego, CA, USA)에³²P-uridine triphosphate를 첨가하여 in-vitro transcription을 시행함으로써 일정한 크기의 방사성 보합 리보핵산 탐식 자를 제작하였다. 탐식자를 시료에서 추출한 총 리보핵산 과 보합반응시키고 리보핵산 분해효소로 처리하여 보합 반응에 참가하지 않은 탐식자와 시료 리보핵산을 모두 분 해하였다. 보합반응에 참가하여 double stranded RNA 를 형성하고 있는 부분은 알코올 침전시키고 이들을 6%

denaturing PAGE 겔에 전기영동시켜 탐식자의 크기 에 따라서 분리하였다. 각 유전자에 해당하는 크기의 탐 식자들이 형성한 띠의 농도를 측정하고 이를 L32 리보 핵산에 의한 띠의 농도로 표준화하였다.

4. 면역조직화학 검사

리보핵산 발현 검사상 독특한 발현 양상을 보인 IL-6 에 대해서 이미 발표된 방법에 따라⁷⁾면역조직화학 검사 를 시행하였다. 일차 항체는 IL-6에 특이한 단일클론 항

체(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)를 사용하였고, LSAB-2 Rat System (DAKO, Carpinteria, CA, USA)을 이용하여 ABC 방법으로 시행하였다.

결 과

1. 염증성 싸이토카인 유전자 리보핵산의 발현 리보핵산 분해효소 보호 검사(RNase protection as- say)에서 IL-1 , TNF 및 TNF 의 리보핵산 발현은 전 실험 기간에 걸쳐서 검출되지 않았다. 반면, IL-1 와 IL-6는 수술 1일째에 발현이 급격히 항진하였다. IL-1 리보핵산의 발현은 수술 후 3일째에 수술 전 수준으로 감 소하여 단순 골절 치유군과 신연 골형성술군 모두에서 수 술 후 21일째까지 비슷한 수준을 유지하였다. IL-6 역시 수술 후 3일째에 리보핵산 발현이 감소하여 단순 골절 치 유군에서는 수술 후 21일째까지 수술 전 수준으로 계속 유지된 반면, 신연 골형성술군에서는 신연을 시작한 9일 째에 발현이 다시 항진되어 되었다가, 신연이 중단된 14 일째부터는 발현이 수술 전 상태로 감소하였다(Fig. 1).

2. IL-6의 공간적 발현 양상

IL-6 단백질 발현을 면역조직화학 검사로 조사하였다.

신연이 시작되기 직전인 수술 후 7일째 조직에서 IL-6 단백질 발현은 정상 골수 내 조혈세포, 신생 골소주를 둘 러싸고 있는 골모세포에서 관찰되었다. 절골 부위 주변 에는 일부 연골 가골이 형성되었으며 transchondroid ossification의 소견이 관찰되었다. 이런 부분에서 연골 세포에서 골모세포로 이행되는 부분에서 IL-6가 강하게 발현하는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 2). 수술 후 9일째, 2일간 신연한 조직에서는 신연 간격에 섬유성 중간대가 형성되면서 신생 골소주가 생성되는 양상이 관찰되었다.

이 시기에도 정상 골수 내의 조혈계세포에서 IL-6의 발 현이 관찰되었고, 신생 골소주를 둘러싸고 있는 골모세 포에의 발현도 관찰되었다. 그뿐 아니라 섬유성 중간대 에 있는 미분화 간엽세포에서도 IL-6의 발현이 관찰되 었다(Fig. 3).

고 찰

신연 골형성술(distraction osteogenesis)은 1980년 서방에 소개되면서¹⁷⁾널리 보급되어 사지 연장술, 복잡한 IL-1

IL-6

FH

0 1d 3d 5d 7d 9d 14d 21d

DO FH DO

GAPDH FH DO

Fig. 1.Result of RNase protection assay for IL-1 and IL-6 during fracture healing (FH) and during distraction osteogenesis (DO).

Samples were similar until postoperative day 7. IL-6 mRNA ex- pression was distinctively induced on day 9 by distraction strain.

Fig. 2.In the area of the transchondroid ossification in the postoperative day 7 specimens, cells at the interface between cartilage and osseous tissue showed strong immunoreactivity for IL-6 (arrows) (A) Hematoxylin and eosin staining, ×100. (B) Immunohistchemical study for IL-6, ×100.

B A

Fig. 3.Postoperative 9 day specimen. (A) Two osteotomy fragments were separated by gradual distraction. Hematoxylin and eosin staining, ×25. (B) IL-6 immunoreactivity of the hematopoietic cells of the intact bone marrow (arrow). (C) IL-6 immunoreactivity was found in active osteoblasts lining the newly formed trabeculae (arrows), ×100. (D) IL-6 immunoreactivity was also observed in primi- tive mesenchymal cells in the fibrous interzone (arrows), ×100.

B

D A

C C D

B

사지 변형의 교정, 광범위 골결손에 대한 골 이동술 등의 표준적인 술식으로 자리를 잡게 되었다. 신연 골형성술 은 독특한 조직학적 양상을 보이면서 대단히 빠른 속도로 신생골을 형성하며4,5,17,28,33,34), 국소뿐 아니라 전신적으 로도 골형성을 활성화하는 것으로 보고되었다¹⁵⁾.

골절 치료에 있어서 압박력이 골절 유합을 촉진하고 신 연력 또는 전단력은 불유합을 초래한다는 믿음이 지배적 이었으나, 신연 골형성술의 임상적 결과는 절골편을 안정 되게 고정하고 적절한 속도로 신연력을 가하면 오히려 더 왕성한 신생골 형성을 유도할 수 있다는 것을 보여주었다.

그러나, 신연력이라는 역학적 환경이 어떠한 기전을 통 해서 신생골 유도라는 생물학적 현상을 초래하게 되는지 그 기전은 아직 분명히 밝혀져 있지 않다. 그간의 연구에 의하면 신연 골형성술 과정에서 활발한 혈관 신생이 이루 어지며, 이 신생 혈관들은 골편으로부터 중간대를 향하여 신연 방향과 평행하게 자라들어 온다^3,10). 한편, 간엽세포 에서 골모세포로 분화를 촉진하고 골 형성을 유도하는 성 장인자들이 신연 골형성술에 따라 그 발현이 항진되고 기 간이 연장되는 것으로 보고되었다6,22,30,32). 그러나, 기존 연구들의 문제점은 발현이 항진된 BMP와 같은 성장인 자들이 미성숙 골모세포(young osteoblast)에서 주로 발현되기 때문에 신연력에 의해서 이들의 발현이 항진되 는지 아니면 다른 경로를 통해서 신생골 생성이 촉진되고 그 결과 이들 성장인자를 발현하는 미성숙 골모세포의 수 가 조직 내에서 증가하기 때문에 이들 성장인자의 발현이 증가된 것으로 보이는지가 분명하지 않다는 것이다.

골절이 초래하는 외상 또는 절골술에 따른 수술적 외상 직후에는 연부조직 외상과 동일하게 일단 염증성 반응이 나타나며, 이 때에 TNF , IL-1 , IL-6 등 염증성 싸이 토카인의 발현이 극적으로 항진된다²⁰⁾. 골절 치유는 초기 에 염증 반응을 거친다는 점에서 태아 발생 과정이나 골 성장판에서 이루어지는 연골내 골화 또는 골막하에서 이 루어지는 막내 골화 현상과는 다르다.

염증성 싸이토카인들 중에서 골절 직후 그 발현이 항진 되는 IL-1 , IL-6, TNF 등은 골다공증의 발생 과정 에서 골 흡수를 촉진하는 중요한 인자라는 것은 오래 전 부터 알려져 왔으며8,19,20,29), 골절 치유 과정 중 골 재형성 과정에 작용할 것으로 생각되어 왔다. 그러나 이는 골 재 형성과 관계없는 초기 염증기에도 일정한 역할이 있을 것 으로 생각된다. TNF는 미성숙 골모세포 또는 미성숙 간

엽세포의 증식을 촉진하는 반면 골모세포의 분화된 기능 의 발현은 억제하며^14,25)연골세포의 아포프토시스(apop- tosis)를 유발하는 것으로 보고되었다²⁾.

IL-1 역시 골절 치유의 염증기에만 특이적으로 발현 이 유도되는 싸이토카인이다(Fig. 1). IL-1 는 IL-6와 같은 다른 싸이토카인의 분비를 유도하기 때문에¹⁶⁾, 골 절 치유 초기에 발현되는 IL-1 는 골절 치유 과정 중에 일어나는 순차적인 현상들을 시작하는 역할을 할 것으로 생각된다. IL-1 는 골절 치유 과정 중에 골모세포의 증 식과 아포프토시스를 조절하는 것으로 알려져 있고²⁷⁾, 골 대사의 중요한 조절인자인 PGE2를 생산하는 과정에 필 수적인 효소들인 prostaglandin G/H synthase-2와 cyclooxygenase-2을 유도하는 것으로 보고되어 있다

23,24). 이상의 결과들에 의하면, IL-1 는 골절 치유 과정

을 시작하는 역할을 하며 골모세포를 증식시키며 신생골 합성의 중요한 조절인자로 작용할 것으로 생각된다.

IL-6은 T-림프구, B-림프구, 형질세포(plasmocyte) 등 면역 조절계 세포뿐 아니라 골모세포, 연골세포, 파골 세포 등 골격계 세포에서도 발현되며, 다양한 기능을 가 지고 있는 싸이토카인으로 알려져 있다^18,31). 생쥐 경골 골 절 모델에서는 골절 1일째에 최대 발현을 보였고 3일째 부터 다시 골절 전 상태로 발현이 줄어드는 양상을 보여 서²⁰⁾, 골절 치유의 염증기에 특이적으로 발현하는 대표적 인 싸이토카인이라고 할 수 있다. 이는 파골세포에 대한 작용과 폐경기 후 골다공증을 매개하는 작용¹³⁾이외에도 골모세포의 분화, 생존 그리고 염기성 인산분해효소와 오 스테오칼신의 생산을 매개하는 것으로 알려져 있다¹⁾. 또, IL-6 유전자 파괴 생쥐는 항원-유도 관절염 모델에서 관 절 연골 파괴 정도가 덜 심해서 관절 연골 파괴에도 IL-6 가 작용할 것으로 생각된다²⁶⁾. 이상의 결과에 의하면 IL- 6는 골절 치유의 염증기에 골모세포를 분화하여 신생골 생성의 토대를 마련하면서 동시에 파골세포의 활성화에 도 기여할 것으로 생각된다.

염증성 싸이토카인들이 신연 골형성술이라는 독특한 골 치유 과정에서 어떠한 역할을 하는지에 대해서는 아직 보고된 바 없다. 신연 골형성술에서는 절골술을 시행하였 을 때에 골절에서와 같이 염증기가 시작될 것으로 생각된 다. 휴지기 동안에 이러한 염증기는 가라앉고 신생골 형 성이 시작될 무렵 골편에 신연 변형력이 가해져서 두 절 골편의 간격은 벌어지고 그 사이에 형성된 가골 또는 육

아조직에는 신연 변형이 지속적으로 생기게 된다. 이러한 신연 변형에 대한 반응으로 신생골이 형성되는바, 조사한 여러가지 염증성 싸이토카인들 중에서 IL-6가 신연 변형 력에 대해서 가장 뚜렷한 반응을 보였다. 또한 조직학적 검사 상 신연 간격에 있는 미성숙 간엽세포에서 발현되는 것으로 보아 신연 변형력에 의하여 그 발현이 항진되는 것으로 생각된다. 기존의 알려진 IL-6의 골모세포에 대 한 효과를 고려하면 신연 변형력에 의한 IL-6의 발현이 신연 골형성술에서 신생골 형성에 일정부분 기여할 개연 성이 있을 것으로 생각된다. 즉, 신연 골형성술은 골절 치 유 조직에‘‘잘 조절된 미세 염증성 반응’’을 지속적으로 유지하여 신생골을 유도하는 것으로 보인다. 이는 만성 또는 아급성 골수염에서 심한 염증 반응은 골 형성을 방 해하고 골 흡수를 촉진하지만, 균력(virulence)이 약한 세균에 의한 약한 염증 반응이 지속되는 경우는 오히려 신 생골 형성을 촉진하는 현상과도 일맥상통하는 것으로 생 각된다. 이를 입증하기 위해서는 IL-6가 골모세포계에 미치는 영향에 대한 보다 깊이있는 연구가 필요할 것이다.

결 론

본 연구에서는 흰쥐 경골의 신연 골형성술(distraction osteogenesis) 모델에서 여러 가지 염증성 싸이토카인 의 시간적 발현 양상을 조사하였고, 그 중 IL-6가 신연 변형력에 의해서 발현이 유도되는 것과 발현 세포의 공간 적 분포 양상을 확인하였다. 이러한 결과는 신연 골형성 술 과정에서 염증성 반응이 어느 정도 유지됨으로써 신생 골 형성을 촉진할 가능성을 시사한다고 하겠다. 이를 입 증하기 위해서는 골모세포에 대한 IL-6의 역할을 보다 깊이있게 규명하는 연구가 필요할 것이다.

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