Ji Hye Gwak 1 , Su Bin Jeong 2 , Soyoung Juhn 2 , Hyun-A Seong 2† and Soo-Jeong Shin 2,3‡

카르복시메틸 전처리된 셀룰로오스 나노섬유의 세포 독성 연구

곽지혜 ¹ ·정수빈 ² ·전소영 ² ·성현아 ^1† ·신수정 ^2,3‡

접수일(2019년 10월 29일), 수정일(2019년 12월 8일), 채택일(2019년 12월 10일)

Cell Toxicity of Cellulose Nanofibrils Pretreated Carboxymethylation

Ji Hye Gwak ¹ , Su Bin Jeong ² , Soyoung Juhn ² , Hyun-A Seong ^2† and Soo-Jeong Shin ^2,3‡

Received October 29, 2019; Received in revised form December 8, 2019; Accepted December 10, 2019

ABSTRACT

Cellulose is a renewable resource widely investigated for its utility in nanomaterials for various promising applications. To investigate the potential application of cellulose nanofibril in cosmetics or medical devices, cellulose nanofibrils were made by carboxymethylation pretreatment and mechanical fibrillation. Size of cellulose nanofibril were measured by nanoparticle size analyzer and viscoelastic properties were by rheometer. Investigation into the toxicity of different degree of substitution of carboxymethylation revealed minimal influence of cell toxicity to kidney cell, liver cell, and fibroblast cell. The benign toxicity of cellulose nanofibril make it an ideal platform to investigate safer design for human contact nanoparticles.

Keywords: Cellulose nanofibril, cell toxicity, kidney cell, liver cell, fibroblast cell

Printed in Korea http://dx.doi.org/10.7584/JKTAPPI.2019.12.51.6.68

1 충북대학교 생화학과(Department of Biochemistry, Chungbuk National University, Cheongju, Chungbuk, 28644, Repulic of Korea) 2 네이처코스텍(Nature Costech Inc., Cheongju. Chungbuk, 28578, Republic of Korea)

3 충북대학교 목재종이과학과(Department of Wood and Paper Science, Cheongju, Chungbuk, 28644, Republic of Korea)

† 교신저자(Corresponding Author): E-mail: [email protected]

‡ 공동교신저자(Co-corresponding Author): E-mail: [email protected]

1. 서 론

셀룰로오스계 물질은 수 세기 동안 인류가 광범위하게 사용하여 온 물질이다. 셀룰로오스는 지구상에 가장 풍 부한 천연 유기물 자원이다. 셀룰로오스는 전통적으로 면 섬유, 레이온 섬유, 제지 산업에서 활발하게 사용하여

왔다. 박테리아에 의하여 합성된 셀룰로오스는 의료영역

에서 사용 가능성을 확인하기 위하여 인공 피부, 인공 혈

관, 창상 치료제, 인공 장기 등 다양한 분야에서 시도되

었다. 바이오 의료 영역에서 사용하기 위하여, 섬유 형태

학적 특성, 고순도, 수분 유지 능력, 인장 강도, 유동성,

생체 적합성 등이 중요한 요소이다. 셀룰로오스 나노섬

유는 바이오 의료 영역에서 필요로 하는 다양한 특성을 지니고 있는 소재이다.

나노공학에 의한 제품 개발과 생산이 급격하게 증가하 고 있다. 이런 나노물질은 안전 문제를 야기하고 있지만 현재까지도 셀룰로오스 나노섬유에 대한 연구가 충분하 게 이루어지 않고 있다. 입자 크기가 작아지면 비표면적 이 커지고, 전통적인 물질(비 나노물질)보다 단위 면적당 반응성이 증가하게 된다.

천연 섬유(석면)이나 인조 섬유(생분해되지 않는 유리 섬유)의 독성에 대한 연구에서 보면 이것들이 인간의 몸 에서 장기간 노출될 경우 폐 섬유화와 암 유발을 증가시 키는 것으로 보고된 바 있다.

셀룰로오스 섬유를 흡입한 경우 폐 내에서 다양한 생리적 변화(granuloma-육아 종, alveolitis-이물성 폐포염, epithelial hyperplasia- 상피 세포 과 형성, fibrosis-섬유화)가 일어난다.

셀 룰로오스 섬유에 노출될 경우 시험관 수준의 실험에서 쥐의 대식세포(macrophages)에 영향을 미쳐 석면이나 유리섬유보다 염증 유발 물질을 분비시키는 것이 확인되 었다.

셀룰로오스 섬유 물질은 쥐의 폐에서 분해되지 않 고 유지 기간이 길었으며 이로 인하여 호흡기 관련 질병 증상을 야기시켰다.

셀룰로오스 나노섬유를 다양한 산업 분야에서 활발하 게 적용하려는 다양한 시도들이 보고되고 있다.

셀룰로 오스 나노섬유를 사용하는 작업 조건에서 인체에 노출될 수 있다. 겔 상태의 셀룰로오스 나노섬유는 피부 접촉으로 전달이 가능하다. 건조된 상태의 셀룰로오스 나노섬유로 작업할 경우에는 분말이 호흡기를 통하여 폐로 전달될 수 있다. 세포 독성 시험은 독성 물질이 세포 기능에 영향 을 미치는 정도를 시험관 조건에서 평가한다. 체내 방어 기작이 존재하지 않는 조건에서 세포를 배양하여 분리할 수 있을 경우 세포 독성 시험법의 민감도가 높다.

셀룰로오스는 원료 물질과 관계없이 시험관 시험 결과 세포 독성이 매우 낮다.

하지만 셀룰로오스 섬유를 호 흡기로 상당한 농도를 흡입한 경우 세포파괴가 보고되었 다.

이번 연구에서는 셀룰로오스 나노섬유가 피부를 통하 여 피부 내 조직에 전달된 후 간에서의 해독 작용과 신장 에서의 배출과 관련된 세포 시험을 통하여 인체에 미치 는 영향을 탐색하고자 하였다. 피부, 간, 신장 세포를 대 표할 수 있는 3가지 세포를 사용하여 각 부위의 독성 가 능성 여부를 탐색하였다.

2. 재료 및 방법

2.1 재료

M사의 혼합 활엽수 크라프트 펄프를 셀룰로오스 원료로 사용하였다. 또한, 카르복시메틸화 반응에 수산화나트 륨, 염화 아세테이트, 에탄올을 사용하였다.

본 실험에 사용된 인간 섬유아세포주(human skin fibroblast)인 Hs68 세포, 인간 간암 세포주(human hepatoma cell line)인 HepG2 세포와 인간 신장 세포주 (human embryonic kidney cell line)인 HEK293 세포 는 ATCC(American Type Culture Collection, USA)에 서 구입하여 사용하였다.

세포 독성 실험을 위해 사용한 fetal bovine serum(FBS), penicillin/streotomysin(P/S), Dulbecco’s modified Eagle’s(DEMM) 배지는 Gibco/BRL(USA)로부터, 0.25%

trypsin EDTA는 Thermo fisher scientific(USA)에서 구입하였다. 그리고 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide(MTT)는 Sigma Aldrich Co.(USA)에서, 96 well을 포함한 세포 배양 plastic culture dish들은 Nunc Inc.(USA)로부터 구입하여 사용하였다. 그 외의 모든 시약은 1급 또는 특 급을 사용하였으며, 세포 배양에 필요한 기구는 Life Technologies(USA)에서 구입하여 사용하였다.

2.2 방법

2.2.1 카르복시메틸화 전처리

카르복시메틸화 전처리를 위하여 상업용 펄프 100.0 g을 에탄올 용매 1.0 L에 첨가하여 팽윤시킨 후 해리시켰다.

여기에 에탄올 1.0 L에 수산화나트륨 19.7 g을 용해시킨 후 해리된 펄프에 첨가하고 상온에서 2시간 이상 교반하 여 셀룰로오스 내 수산기의 이온화 반응을 유도하였다.

수산기의 이온화가 유도된 셀룰로오스에 염화 아세테이 트를 첨가하여 카르복시메틸화 반응을 유도하였으며, 원하는 치환도에 따라 다른 염화아세테이트 양을 조절 하였다. 70℃에서 두 시간 반응 시킨 후 펄프 내 에탄올을 제거한 후 세척하여 셀룰로오스 나노섬유 제조의 원료로 사용하였다.

2.2.2 셀룰로오스 나노섬유 제조

카르복시메틸화 전처리된 펄프를 2.0%로 희석한 후 고

압균질기(Panda Plus, GEA, Italy)를 사용하여 셀룰로

오스 나노섬유를 제조하였다. 고압균질기를 사용한 1차 처리는 100 bar의 압력으로 펄프의 균질화를 시도하였다.

이후 600 bar로 압력을 높여 7회 통과시켜 셀룰로오스 나노섬유를 제조하였다.

2.2.3 세포 독성 시험

2.2.3.1 세포 배양

Hs68 세포, HepG2 세포, HEK293 세포는 10% fetal bovine serum(FBS)에 P/S penicillin(100 unit/mL), streptomycin(50 μg/mL)를 포함한 DMEM(Dulbeco’s Modified Eagle’s Media) 배지를 사용하여 37°C, 5%

CO

, 95% humid air로 조절된 배양기(Thermo Scien- tific)에서 배양하였다. 세포는 100 mm cell culture dish 바닥에 세포가 80% 정도 자랐을 때 계대 배양하며 유지하였다.

2.2.3.2 세포 독성 시험(MTT assay)

Hs68 세포, HepG2 세포 또는 HEK293 세포를 96- well culture plate에 1×10

cells/well로 분주한 다음, 37°C, 5% CO

에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 이전 배양에 사용된 배지를 제거하고 시료인 셀룰로오스 나노섬유를 각 0.02, 0.2, 1 μg/mL의 농도별로 용해한 배지로 분주하고 37°C, 5% CO

의 배양조건에서 24시간 동안 각각 반응시켰다. 24시간 후 각 well 당 0.2% MTT 용액(5 mg/ml)을 20 μL씩 첨가하여 37°C, 5% CO

배양 기에서 3시간 동안 반응시켰다. 반응 후 상등액을 모두 제거하고 생성된 formazan에 DMSO(dimethyl sulfox- ide) 200 μL씩을 넣어 37°C에서 10분간 모두 용해하고 ELISA reader(Molecular Devices, USA)기기를 이용 하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율 (%)은 다음과 같은 식을 사용하여 나타내었다. 각 실험 은 3번 반복 수행하였으며 흡광도를 측정한 후 세포 생존 율(%)은 다음과 같은 식을 사용하여 나타내었다.

세포`생존율(%)`= ` 처리`시료의`흡광도 무처리`시료의`흡광도 ×100

2.3 분석

2.3.1 나노입도 분석

제조된 셀룰로오스 나노섬유의 폭을 측정하기 위하여 나노입도 분석기(Nano Particle Size, Analyzer,

Nanophox, Sympatec GmbH, Germany)를 사용하 였다. 카르복시메틸화 전처리된 시료를 0.001%로 희석 시켜 분산된 시료를 사용하였다. 나노입도분석기를 사용 하여 30초 동안 10회 반복하여 입자크기의 빈도를 측정 하였다.

2.3.2 유변학적 특성

치환도 변이가 셀룰로오스 나노섬유의 유변학적 성질이 차이를 분석하기 위하여 레오미터(Rheometer, MCR 102, Anton Paar, Austria)를 사용하였다. D-PP 25 부품을 사용하여 측정하였고, 점도 곡선과 진동수, 진폭 에 따른 유변학적 특성을 분석하였다.

3. 결과 및 고찰

3.1 셀룰로오스 나노섬유의 형태

전처리 조건이 셀룰로오스 나노섬유의 폭에 영향을 미 친다. 본 연구에서는 나노입도 분석기를 사용하여 셀룰 로오스 나노섬유의 폭의 분포도를 측정하였다. 카르복시 메틸화 후 치환도는 치환된 셀룰로오스를 산 가수분해 후 단당을 핵자기 공명 분석하여 치환도를 확인하였다.

그라인더 방법으로 작업한 후 고압균질기로 2차 가공하 여 제조한 셀룰로오스 나노섬유의 치환도 0.1로 카르복시 메틸화 전처리된 셀룰로오스 나노섬유의 폭은 41.8 nm 임에 비하여 치환도 0.3이나 0.5로 처리된 시료는 10 nm 이하의 폭으로 확인되었다(Table 1). 치환도가 0.1인 경우 음이온 도입에 의하여 셀룰로오스 나노섬유화의 촉진이 덜 진행되었지만 치환도 0.3 이상인 경우 음이온 도입에 의한 정전기적 반발력에 의한 셀룰로오스 나노단위의 이탈 이 충분하게 진행되어 치환도의 증가가 나노섬유의 폭의 감소로 더 이상 진행되지는 않은 것으로 생각된다.

카르복시메틸화 전처리 조건의 치환도를 낮은 상태,

Table 1. Width of cellulose nanofibril with different carboxymethylation pretreatment Degree of

Substitution

Width (nm) X

X

X

0.1 37.4 41.8 46.4

0.3 8.0 8.7 9.1

0.5 8.6 8.9 9.5

보다 작지만, 도입된 카르복시메틸기에 의한 물과 친화 력 증가에 의하여 점도가 상승하는 것으로 판단된다.

TEMPO-산화 전처리 후 만들어진 셀룰로오스 나노섬유 의 카르복실기 함량이 250-650, 350-700 μmol/g 처 리된 시료의 경우 카르복실기 함량이 높을수록 높은 점 도 값을 보였다.

4차 아민 양이온 전처리된 셀룰로오스 나노섬유의 경우, 치환도 0.3으로 전처리된 후의 나노섬 유가 치환도가 0.1로 전처리된 후 제조된 셀룰로오스 나 노섬유보다 점도 값과 저장탄성계수 및 손실탄성계수가 높아, 전처리에서 도입된 양이온이나 음이온이 만들어진 셀룰로오스 나노섬유의 점탄성 성질에 영향을 미치는 것 으로 생각된다.

카르복시메틸 전처리와 4차 아민 전처 리된 셀룰로오스 나노섬유의 점탄성 성질 비교 결과 카 르복시메틸화 처리된 셀룰로오스 나노섬유가 유사한 치 환도 값에서 4차 아민 전처리로 처리된 셀룰로오스 나노 섬유보다 동일 전단 속도에서 높은 점도 값을 보였다.

셀룰로오스 나노섬유 현탁액의 변형을 증가시키면서 진동 전단 변형(oscillating shear deformation)을 측정 하였다. 전처리 치환도와 관계없이 3가지 시료 모두 비슷 한 경향을 보였다(Fig. 2). 선형 점탄성 구간에서는 저장 탄성계수(G’) 값이 손실탄성계수(G”) 값보다 큰 고체나 겔과 같은 성질을 보였지만 전단 변형이 50%인 영역에 서 저장 탄성계수와 손실탄성계수 값이 같아지며 이후 전단변형이 증가함에 따라 손실탄성계수(G”) 값이 저장 탄성계수(G’) 값보다 커지는 점성물질이나 액체 같은 성 질로 전이됨을 알 수 있다. 셀룰로오스 나노섬유의 전단 변형 증가에 따른 겔에서 액체로의 전이는 다른 연구자 들에 의해서도 보고된 바 있다.

3.3 세포 독성

3.3.1 섬유 아세포 독성

혼합 활엽수 크라프트 펄프를 카르복시메틸화 전처리 시킨 후 만들어진 셀룰로오스 나노섬유의 섬유 아세포 독성을 실시하였다. 배지 내에 전건 셀룰로오스 나노섬유 기준으로 0.02, 0.2, 1.0 mg/L를 첨가하여 세포 독성을 시험하였다. 치환도 0.5로 전처리된 셀룰로오스 나노 섬유의 경우 치환도 0.1이나 0.3로 치환된 셀룰로오스 나노섬유보다 세포 생존율이 높았지만 모든 경우 99%

이상의 세포 생존율을 보이기 때문에 그 차이는 크지 않 다(Fig. 3).

라디에타 소나무로 만든 셀룰로오스 나노섬유, 유칼립 중간 상태로 높은 상태로 처리한 경우 전처리 조건이 미

치는 영향을 분석하였다. 그라인더 방법으로 나노섬유를 제조하고, 전자 현미경으로 폭을 측정한 결과, 전처리하 지 않은 셀룰로오스 나노섬유의 평균 폭은 31.0 nm이었 지만 전처리 정도가 낮은 경우 14.6 nm, 전처리 정도가 중간인 경우 14.7 nm와 전처리로 인한 카르복시기 도입이 높은 경우 12.3 nm로 보고되었다.

4차 아민 양이온화 전처리 후 만든 나노 입도 분석기로 분석한 결과, 치환 도가 0.1로 전처리된 후 제조된 셀룰로오스 나노섬유의 폭은 8.1-14.1 nm 범위로 제조된 반면 치환된 0.3으로 전처리된 후 나노섬유의 폭은 3.9-9.5 nm 범위의 폭 분 포로 치환도가 낮게 처리된 후 만들어진 나노섬유보다 폭이 작아진 것을 보고된 바 있다.

3.2 셀룰로오스 나노섬유의 점탄성

셀룰로오스의 점탄성 성질에 영향을 미치는 두 가지 요 소는 입자의 크기 및 형태와 관련된 특성이고 다른 하나 는 섬유 표면의 전하 상태이다. 섬유의 형태학적 요소는 길이, 폭, 피브릴화 정도, 네트워크 구조에 영향을 받는 다. 표면 전하는 전처리 과정에서 셀룰로오스 나노섬유 의 음이온이나 양이온 작용기를 도입하여 나노화 과정에 서 사용되는 전기적 에너지를 줄이기 위하여 도입된다.

유변학적 성질은 전단응력 조건에서 측정되었으며, 시 료의 농도는 2.0 wt%, 온도 25°C에서 측정하였다. 치환도 0.5로 전처리된 셀룰로오스 나노섬유의 점도가 가장 높았고, 치환도 0.3, 치환도 0.1로 치환된 셀룰로오스 나노섬유 순으로 점도 값을 보였다(Fig. 1). 치환도 0.3 으로 만들어진 셀룰로오스 나노섬유의 폭이 치환도 0.5

Fig. 1. Viscosity as a function of rate for cellu-

lose nanofibrils with differently car-

boxymethylated.

투스로 만든 셀룰로오스 나노섬유, 전처리를 거치지 않 고 만든 것이나 TEMPO-산화 처리 후 만들어진 셀룰로 오스 나노섬유, 건조하지 않은 것이나 동결 건조 후 다시 겔로 만든 셀룰로오스 나노섬유 등 다양한 셀룰로오스

나노섬유의 3T3 fibroblast cell을 이용한 세포 독성 시 험에서 모두 세포 독성이 없음이 보고되었다.

하지만 셀룰로오스 나노섬유와 polyethyleneimine(PEI)와 가 교 결합 또는 cetyl trimethylammonium bromodie (CTAB) 계면활성제와 가교결합된 것들은 세포 독성을 보였다.

음이온이나 양이온으로 전처리한 후 만들어진 셀룰로 오스 나노섬유를 인간피부 섬유아세포(HDF)로 실시한 세포 독성 시험을 AB와 LDH 두 가지 방법으로 assay한 결과, 24시간 셀룰로오스 나노섬유 처리 후 손상 평가에 서 3가지 시료 모두 세포 멤브레인의 손상을 가져오지 않 았을 뿐 아니라 세포형태의 변화도 관찰되지 않았다고 보고되었다.

섬유 아세포 L 929세포를 사용한 또 다른 세포 독성 연구에서 셀룰로오스 나노섬유는 세포 독성이 없고 산화스트레스도 유발하지 않는다고 보고되었다.

또한 TEMPO-산화 전처리와 카르복시메틸화 전처리로 만들 셀룰로오스 나노섬유의 L929 cell line에 의한 세포 독성 시험 결과 원형질 막에서 LDH의 유출로 평가한 세 포 독성 시험 결과 세포 독성이 없음이 보고되었다.

3.3.2 간세포 독성

혼합 활엽수 크라프트 펄프를 카르복시메틸화 전처리 시킨 후 만들어진 셀룰로오스 나노섬유의 간 세포 독성 을 실시하였다. 배지 내에 전건 셀룰로오스 나노섬유 기 준으로 0.02, 0.2, 1.0 mg/L를 첨가하여 세포 독성을 시 험하였다. 치환도 0.5로 전처리된 셀룰로오스 나노섬유 의 경우 치환도 0.1이나 0.3으로 치환된 셀룰로오스 나 노섬유보다 간 세포 생존율이 높았지만 모든 경우 99%

Fig. 3. Cell viability of Hs68 fibroblast cell cul- tured with cellulose nanofibrils.

Fig. 2. Storage modulus and loss modulus as a

function of shear rate for cellulose

nanofibrils with differently carboxy

methylated.

이상의 세포 생존율을 보이기 때문에 그 차이는 크지 않 다(Fig. 4).

셀룰로오스 나노섬유로 두 가지 세포주를 배양한 결과 태생기 전능세포(pluripotent cell)와 간암세포주(human hepatocellular carcinoma cell line, HepG2)의 경우, 형태나 유전자의 변형없이 잘 배양시킬 수 있음을 확인 하였다.

셀룰로오스 나노섬유의 주입 후 3차원 지지체 에 적합한 점탄성 성질을 가지며 세포 생체치환성도 높고 간세포 성분은 HepG2세포의 성장에 영향을 미치지 않았 다.

따라서 활엽수 크라프트를 카르복시메틸화 전처리 후 만든 셀룰로오스 나노섬유는 0.02-1.0 μg/mL 농도로 는 간세포에 독성을 끼치지 않는 것으로 생각된다.

3.3.3 신장 세포 독성

혼합 활엽수 크라프트 펄프를 카르복시메틸화 전처리 후 만들어진 셀룰로오스 나노섬유의 신장 세포 독성을 실시하였다. 배지 내에 전건 셀룰로오스 나노섬유 기준 으로 0.02, 0.2, 1.0 mg/L를 첨가하여 세포 독성을 시험 하였다. 치환도 0.5로 전처리된 셀룰로오스 나노섬유의 경우 치환도 0.1이나 0.3으로 치환된 셀룰로오스 나노섬 유보다 신장 세포 생존율이 높았지만 모든 경우 99%

이상의 세포 생존율을 보이기 때문에 그 차이는 크지 않 다(Fig. 5). 신장 세포에 대한 셀룰로오스 나노섬유의 세포 독성 관련 연구는 거의 없다. 셀룰로오스 나노결정을 가 지고 인간배아 신장 세포에(human embryonic kidney cells(HEK 293)) 배양한 결과 셀룰로오스 나노결정 물질 (아마 효소 처리 후 셀룰로오스 나노결정물 제조 시료)는 0.1 mg/mL의 농도에서 신장 세포 독성을 보이지 않았

다.

본 연구와 인용연구 결과를 기반으로 저농도에서 셀룰로오스 나노물질(나노섬유와 나노결정)은 신장세포 의 독성이 낮거나 없는 것으로 예상된다.

4. 결 론

카르복시메틸화 치환도를 다르게 하여 만든 세 가지 셀 룰로오스 나노섬유는 치환도가 증가함에 따라 폭이 감소 하였다. 점탄성 성질은 치환도를 달리하여 만들어진 셀 룰로오스 나노섬유는 크기와 점탄성 성질이 달랐지만, 간세포, 신장 세포, 섬유아세포 독성 시험에서 셀룰로오 스 나노섬유가 1 μg/mL 범위에서 세포 독성이 없었다.

이는 셀룰로오스 나노섬유 기반 제품이 직접적인 인체 주입이 아닌 경우 세포 독성이 없을 것으로 판단된다.

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Fig. 4. Cell viability of HepG2 liver cell cul- tured with cellulose nanofibrils.

Fig. 5. Cell viability of HEK293 kidney cell

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