수박 열수 추출물의 Tyrosinase 저해능과 신경세포 보호효과
⁃연구노트⁃
허다정․김수정․최애란․박해룡․이승철† 경남대학교 식품생명학과
Tyrosinase Inhibitory Activity and Neuronal Cell Protection of Hydrothermal Extracts from Watermelons
Da-jeong Heo, Su-Jung Kim, Ae-Ran Choi, Hae-Ryong Park, and Seung-Cheol Lee
† Dept. of Food Science and Biotechnology, Kyungnam University, Gyeongnam 631-701, KoreaABSTRACT In our study, each part (flesh, white rind, and green rind) of watermelon was extracted using hydrothermal extraction method at temperatures ranging from 100 to 300°C at the intervals of 10, 30, and 60 min. We found that hydrothermal treatment has a significant bearing not only on tyrosinase inhibitory activity but also on neuronal cell protection of watermelon parts. The peak tyrosinase inhibitory activity (about 93%) was observed in both the flesh and green rind extracts at 300°C for 60 min. In addition, we observed that hydrothermal extracts of watermelon parts at 300°C for 60 min also evidenced significant protection effect for neuronal cell against H
2O
2in a concentration- dependent manner. The results of this study confirm that hydrothermal treatment may be an efficient processing method for the purpose of obtaining potent bioactive substances from watermelon.
Key words: watermelon, hydrothermal extraction, tyrosinase inhibitory activity, neuronal cell protection
Received 4 June 2013; Accepted 27 July 2013
†Corresponding author.
E-mail: [email protected], Phone: 82-55-249-2684
서 론
수박(
Citrullus lanatus
)은 많은 나라에서 흔히 소비되는 과일로서 수분 함량이 높고 체내에 흡수가 잘 되는 포도당과 과당을 다량 함유하고 있어 피로회복에 도움을 준다. 수박은 약선학에서 즙으로 만들어 열증, 갈증, 불면 치료에 사용되 었고 여름철의 청열해서에 많이 사용한다(1). 또한 비타민과 미네랄, citrulline과 arginine 같은 amino acid와 β-car- otene, lycopene을 함유하고 있으며 이런 성분들로 인해 항 산화 효과가 있다고 보고되어 있다(2,3). 수박에 관련된 국 내의 연구를 살펴보면 품종별 이화학적 특성(4), 수박을 이 용한 와인의 제조 및 특성(5), 부위별 유리당 함량 분포(6), 수박 주스의 알콜 발효에 관한 연구(7) 등이 있다. 한편, 해 외에서는 수박으로부터 유용 물질을 회수하기 위하여 초임 계 유체(8), 이산화탄소와 열처리(9), 가열초음파(10) 등의 다양한 시도가 있었다.식품에 함유된 유용물질을 효과적으로 회수하는 데는 가 열, 원적외선 처리 등의 여러 다양한 방법들이 있다. 그중에 서 열수 추출(hydrothermal extraction)은 100°C에서 374
°C(물의 임계점) 사이의 고온, 고압의 물 존재 하에서 추출 하는 방법을 뜻하는데, 이 조건에서 물 분자 사이의 수소결
합이 약해지거나 파괴되어 극성이 약해지며, 이로 인해 다양 한 유기 화합물의 용해도가 높아진다. 또한 ester 결합이나 ether 결합을 분해하여 다른 분자들과 결합된 유용 물질을 회수하는데 기여하며 유전 상수가 낮아져서 소수성 물질을 용해하는 능력이 향상되어 활용성이 높은 환경친화적 방법 이다(11). 이런 이점으로 인해 canola meal(12), red grape skin(13), 흑미강(14) 등으로부터 열수 처리로 항산화물질 을 추출한 연구가 보고되어 있다. 저자들은 지난 연구에서 수박의 열수 처리가 항산화력을 크게 증진시킨다고 보고한 바 있다(15). 본 연구에서는 수박을 과육, 내피, 외피의 3부 위로 구분하여 각각을 100~300°C의 고온에서 열수 추출하 여 tyrosinase 저해활성과 신경 세포주에 대한 보호효과를 분석하였다.
재료 및 방법
재료
본 연구에 사용된 수박은 경남 창원의 마트에서 구입하였 다. Mushroom tyrosinase, tyrosine, 3-(4,5-dimethyl- thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) 는 Sigma-Aldrich Co.(St Louis, MO, USA)에서 구입하였 다. 신경 세포주의 배양을 위해 필요한 RPMI1640 medium 과 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM), fetal bovine serum(FBS) 및 penicillin-streptomycin 등은 Gibco-BRL(Grand Island, NY, USA)에서 구입하였다. 그
외의 연구에 사용된 여러 가지 용매 및 시약은 모두 일급 이상의 등급을 사용하였다.
수박 추출물
수박은 과육, 내피, 외피로 구분하여 사용하였다. 과육은 내피로부터 약 3 cm 떨어진 중심부를 사용하였다. 내피는 같은 양의 물과 섞어서 사용하였고, 외피는 얇게 벗겨내어 10배의 물과 섞어서 사용하였다. 열수 추출물은 추출을 위 해 15 cm 길이의 스테인리스 용기로 반응관을 만들었다.
부위별 수박(10 mL)을 반응관에 넣고 스테인리스 뚜껑을 잘 닫은 후 muffle fumace(Daeil Engineering, Seoul, Korea)에 둔다. 수박의 각 부위는 100°C, 150°C, 200°C, 250°C, 300°C의 온도에서 각각 10분, 30분, 60분간 추출되 었다. 추출이 완료되면 즉시 furnace에서 꺼내 상온에서 30 분간 식혔다. 열수 추출물은 Whatman No.3 filter paper (Advantec MFS Inc., Dublin, CA, USA)로 여과 후 deep freezer(Operon Co., Seoul, Korea)에서 -70°C로 보관되 었다. 대조구인 열수 무처리구는 열을 가하지 않고 What- man No.3 filter paper(Advantec MFS Inc.)로 여과 후 사 용하였다.
Tyrosinase 저해능
Tyrosinase 저해능은 Vanni 등(16)의 방법을 변형하여 분석하였다. 각 추출물(100 μL)과 140 μL의 0.05 mM so- dium phosphate buffer(pH 6.8)를 96-well plate에 넣고, 40 μL의 1.5 mM L-tyrosine solution과 20 μL의 mush- room tyrosinase(1,500 units/mL)를 첨가하였다. 혼합액 (300 μL)을 잘 섞은 후 37°C에서 15분 동안 반응시킨다.
흡광도는 492 nm에서 multiplate reader(Sunrise RC/TS/
TS Color TC/TW/BC/6Filter, Tecan Austria GmbH, Grödig, Austria)로 측정하였다.
세포주 및 배양
본 실험에 사용된 신경 세포주 rat pheochromocytoma PC12는 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)으로부터 분양받아 사용하였다. PC12의 세포배양을 위해 RPMI1640 medium에 10% FBS, DMEM medium에 10% FBS, 5%
horse serum(HS) 및 100 unit/mL의 penicillin, 100 mg/
mL의 streptomycin을 첨가하여 사용하였고, 95%의 습도가 유지되는 37°C, 5% CO2 incubator(MOC-18 AIC, Sanyo Electric Biomedical Co., Ltd., Osaka, Japan)에서 배양하 였다.
MTT reduction assay를 통한 신경세포 보호효과 측정
수박 추출물의 신경세포 보호효과를 확인하기 위해 MTT reduction assay를 실시하였다. PC12 세포주(1×105 cells/mL)를 96-well plate에 100 μL씩 첨가하여 37°C, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양하였다. 수박 추출물(300°C, 60
분)을 각각 10, 50, 100, 500 μg/mL의 농도로 처리하여 24시간 배양한 후 0.1 mM H2O2를 처리하고 2시간 배양하 였다. 각 well에 PBS 완충용액에 녹인 MTT(5 mg/mL) 용 액을 10 μL씩 첨가하여 다시 1시간 동안 배양하였다. For- mazan 형성을 관찰한 후, 배지를 완전히 제거하고 well 바 닥에 형성된 formazan을 녹이기 위해 DMSO 100 μL씩 첨 가한 후, ELISA reader(Model 680, BioRad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 흡광도 540 nm에서 측정하였다. 추 출물을 처리하지 않은 세포를 대조군을 100%로 하였을 때 의 상대적인 세포생존율을 구하였다.
통계처리
모든 실험은 3회 반복으로 이루어졌으며, SPSS soft- ware(Windows용 SPSS, Version 14.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 사용하여
P
<0.05 수준에서 각 시료간 의 유의적 차이를 검증하였다.결과 및 고찰
Tyrosinase 저해능
Tyrosinase는 tyrosine의 산화를 촉진하여 melanin을 생합성하기 위한 주 효소로서 피부 표피층의 melanocyte의 melanosome에서 합성된다. Tyrosine이 산화와 중합반응 을 하면 3,4-dihydroxyphenylalanine(DOPA) 또는 DOPA quinone이 되고, melanin이 합성된다. Tyrosinase 저해제 는 미백 기능성과 깊은 연관이 있으며, 식품과 화장품 산업 에서 많은 주목을 받는다(17). 수박을 3 부위로 나누어 100
~300°C에서 10, 30, 60분간 열수 추출하여 tyrosinase 저 해능을 측정하여 Table 1에 나타내었다. 부위별로 살펴보 면, 과육과 외피의 경우 열수 무처리구가 3.37%와 3.83%의 tyrosinase 저해능을 보인 것에 비해 300°C에서 60분 처리 한 추출물에서는 각각 93.70%와 93.95%로 크게 tyrosi- nase 저해능이 증가하였다. 내피에서는 300°C에서 30분간 추출한 추출물에서 79.04%로 가장 높은 tyrosinase 저해활 성을 보였으나, 과육이나 외피에 비해 약한 저해활성을 보였 다. 이상의 결과로서 수박 추출물의 tyrosinase 저해활성이 열수 추출 온도와 시간에 상당한 영향을 받는다는 것을 알 수 있었다.
여러 연구에서 tyrosinase 저해 활성이 페놀 화합물의 함 량과 매우 높은 상관성이 있는 것으로 보고되었다(17,18).
열수 추출은 유용물질을 추출하는데 효율적인데, 어성초 (19)의 경우 100°C에서 10분간 추출한 조건보다 300°C에 서 30분간 추출했을 때 약 3배 높은 페놀 함량을 보였으며, 차가버섯(20)의 경우 같은 추출조건에서 약 5.6배 높은 페 놀 함량을 보였다. Kim 등(15)은 열수 처리에 의해 수박의 모든 부위에서 lycopene은 감소하였으나 페놀 화합물의 함 량이 크게 증가하였으며, 이는 항산화능의 증가를 유발한다 고 보고하였다.
Table 1. Effect of hydrothermal extracts from watermelons on tyrosinase inhibitory activity
Parts Time (min) Temperature (°C)
Untreated
100 150 200 250 300
Flesh
10 30 60
5.16±1.79cy 4.10±2.68dy 12.29±1.80dz
5.88±0.41cy 1.32±3.60dy 28.22±3.05cz
0.86±2.18dx 16.17±1.08cy 75.31±5.74bz
9.75±1.20bx 87.47±4.67az 72.10±2.20by
62.53±1.57ax 75.06±0.83by 93.70±0.01az
3.37±1.96
White rind
10 30 60
-1.48±1.38cz -1.54±1.43dz 0.30±1.34ez
-2.79±1.07cy -2.02±0.10dy 8.90±0.17dz
-1.72±0.62cx 38.73±0.95cy 67.36±0.20bz
11.03±0.87bx 61.61±0.26by 65.10±1.83cz
53.89±0.61ax 79.04±1.06az 70.03±0.30ay
-1.25±1.25
Green rind
10 30 60
-0.54±0.52cyx -1.50±1.82dx 1.74±1.65dz
1.98±0.37by 6.41±2.19cz -1.44±0.45ex
-0.54±0.85cx 9.14±0.88cy 50.03±1.49cz
0.65±1.28bcx 50.68±3.40by 59.35±1.14bz
10.74±0.84ax 56.20±1.28ay 93.95±0.01az
3.83±0.58 Different letters within a row (a-e) and a column in each part (x-z) are significantly different (P<0.05), n=3.
0 20 40 60 80 100 120
C 10 50 100 500 - 10 50 100 500
MTT reduction (%) .
(A)
flesh (μg/mL) flesh (μg/mL) Normal condition H2O2 (1 mM)
0 20 40 60 80 100 120
C 10 50 100 500 - 10 50 100 500
MTT reduction (%) .
(B)
green rind (μg/mL) green rind (μg/mL) Normal condition H2O2 (1 mM)
0 20 40 60 80 100 120 140
C 10 50 100 500 - 10 50 100 500
MTT reduction (%) .
(C)
white rind (μg/mL) white rind (μg/mL) Normal condition H2O2 (1 mM)
0 20 40 60 80 100 120
C 10 50 100 500 - 10 50 100 500
MTT reduction (%) .
(D)
flesh (μg/mL) flesh (μg/mL) Normal condition H2O2 (1 mM)
0 20 40 60 80 100 120
C 10 50 100 500 - 10 50 100 500
MTT reduction (%) .
(E)
green rind (μg/mL) green rind (μg/mL) Normal condition H2O2 (1 mM)
0 20 40 60 80 100 120
C 10 50 100 500 - 10 50 100 500
MTT reduction (%) .
(F)
white rind (μg/mL) white rind (μg/mL) Normal condition H2O2 (1 mM)
Fig. 1. The neuroprotective effect of hydrothermal extracts from watermelons on H2O2-induced cytotoxicity in PC12 cells. Each extract from (A) untreated flesh, (B) untreated green rind, (C) untreated white rind, (D) hydrothermal treated flesh, (E) hydrothermal treated green rind, and (F) hydrothermal treated white rind.
MTT reduction assay을 통한 신경세포 보호효과 측정
PC12 세포주에 대한 수박 추출물의 세포독성 효과를 확 인하기 위해 MTT reduction assay를 실시하였다. 열수 무 처리군과 열수 처리군(300°C, 60분)으로 나누어 수박 부위 별 추출물(과육, 외피, 내피)을 농도별로(10, 50, 100, 500 μg/mL) PC12 세포주에 처리하였다. 모든 추출물을 각각 10, 50, 100, 500 μg/mL의 농도로 처리하였을 때 추출물을 처리하지 않은 세포주와 비교하여 세포생존율의 유의적 차 이가 없었으며 이를 통해 세포독성이 없는 것을 확인하였다 (Fig. 1).한편 H2O2가 유도하는 산화적 스트레스로부터 수박 추출 물의 PC12 세포주에 대한 보호효과를 확인하였다. H2O2 처 리군의 세포생존율은 정상군에 비해 세포생존율이 현저하 게 감소한다는 것을 확인할 수 있었으며, 열수 무처리군의 추출물을 위와 동일한 농도로 처리 시 과육은 각각 11.6, 11.4, 10.9, 11.5%, 외피는 각각 11.6, 12.4, 11.0, 11.4%, 내피는 각각 11.9, 11.6, 11.8, 11.7%로 H2O2 처리군과 세 포생존율의 유의적 차이가 없었으며 이를 통해 신경세포 보 호효과가 없음을 확인할 수 있었다(Fig. 1(A)~(C)). 그러나 300°C에서 30분간 열수 처리한 수박 추출물을 10, 50, 100, 500 μg/mL의 농도로 처리 시 과육은 각각 16.7, 24.8, 39.1, 67.1%, 외피는 각각 20.2, 32.3, 67.1, 61.6%, 내피는 각각 18.8, 22.9, 29.9, 68.3%로 농도 의존적으로 세포 생존 율이 회복되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 1(D)~(F)).
MTT reduction assay는 탈수소 효소(mitochondrial dehydrogenase) 작용에 의해 노란색의 수용성 기질을 청 자색을 띠는 비수용성 MTT formazan으로 환원시키는 mi- tochondria의 능력을 이용하는 측정법이며(21), 일반적인 세포독성 실험에 널리 이용되고 있다. MTT reduction as- say를 이용하여 검정콩 껍질 추출물의 신경세포 보호효과 를 확인한 논문에서도 추출물 500 μg/mL 농도에서 76.0%
의 생존율로 높은 신경세포 보호효과를 보였다는 보고가 있 었으며(22), 이는 본 연구에 사용된 수박추출물의 신경세포 보호 효과와 거의 유사한 활성이라 할 수 있다.
이상의 결과는 열수 처리가 수박의 tyrosinase 저해능을 향상시키고, 산화적 스트레스로부터 신경세포주를 보호하 는 능력을 증가시킴을 의미한다. 이는 수박에 존재하는 불용 성의 유용 물질이 열수 처리에 의해 가용화되거나, 열수 처 리에 의해 유용 물질이 합성될 가능성을 시사한다. 전술한 바와 같이 열수 처리는 수박의 페놀 화합물 함량 증가에 기 여하며(15), 이들 물질들이 tyrosinase 저해능과 산화적 스 트레스에 의한 신경세포 보호 능력을 향상시키는 것으로 생 각된다. 따라서 열수 처리는 수박추출물의 생리활성물질 함 유량을 증가시킬 수 있는 공정임이 확인되었고, 열수 처리를 기능성이 우수한 수박 가공품 개발에 응용할 수 있을 것으로 기대된다.
요 약
수박을 과육, 외피, 내피로 나누어 100~300°C에서 10, 30, 60분간 열수 추출하여 tyrosinase 저해활성과 신경세포 보 호효과를 조사하였다. Tyrosinase 저해활성은 온도가 높을 수록 시간이 증가할수록 높아졌으며, 과육과 외피에서 300°C, 60분 처리했을 때, 약 93%로 가장 높은 저해활성을 보였다. 300°C에서 60분간 열수 추출한 수박 추출물을 PC12 세포주에 농도별로(10, 50, 100, 500 μg/mL) 처리하 여 신경세포 보호효과를 확인하였다. 열수 추출을 하지 않은 수박 부위별 추출물은 H2O2 처리군과 세포생존율의 유의적 차이가 없었으며 이를 통해 신경세포 보호효과가 없음을 확 인하였으나, 열수 추출물들은 H2O2 단독처리군에 비해 세 포생존율이 증가하였다. 이상의 결과들은 열수 처리가 수박 에 함유된 유용 물질들의 추출에 매우 유용한 공정임을 시사 한다.
감사의 글
본 논문은 2012학년도 경남대학교 연구비 지원으로 이루어 졌으며, 이에 감사드립니다.
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