The Effects of Eunhoebanchong-san on the Caerulein-induced Acute Pancreatitis in the Rat

․교신저자: 이영수 광주광역시 남구 월산동 동신대학교 광주한방병원

TEL: 062-350-7203 FAX: 062-350-7141 E-mail: [email protected]

․이 논문은 2009년도 동신대 일반대학원 한의학 박사학위 논문임.

Caerulein으로 유발된 흰쥐의 급성 췌장염에 대한 銀茴蟠葱散의 효과

이형호, 김인수, 신민구, 이영수 동신대학교 한의과대학 내과학교실

The Effects of Eunhoebanchong-san on the Caerulein-induced Acute Pancreatitis in the Rat

Hyung-ho Lee, In-soo Kim, Min-gu Shin, Young-su Lee

Dept. of Internal Medicine, College of Oriental Medicine, Dong-Shin University

ABSTRACT

Objectives :

Methods :

Pancreatic tissues of rats from all groups were removed for apoptosis, and light, and electron microscopic examination. Blood of rats from all groups was obtained for oxidative stress markers and pathological examination. Pancreatic oxidative stress markers were evaluated by the measurements of serum amylase, and interleukin-6 (IL-6) levels were determined spectrophotometrically.

Results :

Conclusions :

Key words :

Ⅰ. 서 론

급성 췌장염은 담석, 음주, 고지혈증 및 고칼슘 증 등의 원인에 의해 췌장에 부종, 종창, 자가분해,

괴사 또는 출혈을 동반한 급성 염증성 장애이다¹. 통증은 지속적이고 자통(boring)이며 심와부 및 배 꼽주위에 나타나고 종종 등이나 가슴, 옆구리 하복부 쪽으로 방사되기도 하며 흔히 환자가 바로 누웠을 때 심해지는 경향이 있다. 급성 췌장염은 가성낭종, 농양, 패혈증, 다발성 장기부전 등과 같은 합병증 을 동반하는 경우에는 높은 사망률을 초래할 수 있기 때문에 임상에서 관심의 대상이 되고 있다².

한의학에서 급성 췌장염은 ‘脾心痛', ‘結胸’ 등에

해당되고³, ≪靈樞･厥病篇≫⁴에 “腹脹胸滿, 心尤痛 甚, 胃心痛也 … 痛如以錐鍼刺其心, 心痛甚者, 脾心 痛也”이라 하여 脾心痛이 급성 췌장염의 통증 부 위와 증상이 유사하다. 치료는 消肝解鬱, 理氣止痛, 活血化瘀하는 大柴胡湯加味, 少腹逐瘀湯加味, 膈下 逐瘀湯加味, 蟠葱散 등이 활용되었다^1,3.

銀茴蟠葱散은 ≪太平惠民和劑局方≫에 수록된 蟠 葱散에 金銀花와 小茴香을 加한 것으로 급만성 췌 장염에 응용되고¹, 김 등⁵의 동물실험을 통하여 췌 장염에 높은 유의성이 인정된 方劑이다.

급성췌장염에 대해서는 그동안 加減大黃牧丹皮 湯⁶, 正傳加味二陳湯⁷, 手拈散⁸ 등의 처방들과 敗將⁹, 金銀花¹⁰, 小茴香¹⁰ 등의 단일 약재를 이용한 연구 들이 진행되어 왔다. 그러나 실험적으로 caerulein 유도 급성 췌장염 모델에 대한 銀茴蟠葱散의 효과 에 대한 연구는 이루어지지 않았다.

이에 본 연구에서는 銀茴蟠葱散이 급성 췌장염 억제 효과가 있음을 알아보기 위해 caerulein으로 유도된 급성 췌장염 흰쥐에 투여량을 달리한 銀茴 蟠葱散(EBS)을 투여한 후 췌장 중량/체중 비율, 혈청 amylase, alanine aminotransferase(ALT) 활 성, Interleukin 6(IL-6) 농도, 광학현미경･전자현미 경 관찰 및 세포자멸사 검사 등 실험을 수행하고 그에 대한 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이 다.

Ⅱ. 실험재료 및 방법

1. 재 료 1) 실험동물

체중 200±10 g 내외의 7주령 수컷 흰쥐(Sprague Dawley, male) 30마리를 샘타고(주, 오산)로부터 구입하였다. 실험동물은 동신대학교 한의과대학 동 물 사육실에서 일정한 조건(온도 : 21±2℃, 습도 : 50-60%, 12시간 주기 명/암)하에서 일반 고형사료 (샘타코, 흰쥐 용)와 물을 충분히 공급하면서 1주 동안 적응시킨 후 실험에 사용하였다.

본 실험은 소속 기관의 동물실험윤리위원회의 승인을 받아 진행하였다.

2) 銀茴蟠葱散의 구성

실험에 사용한 약재는 동신대학교 부속한방병원 에서 구입한 후 정선하여 사용하였고, 銀茴蟠葱散 (EunHoeBanChongSan, 이하 EBS)의 구성은 ≪太 平惠民和劑局方≫의 蟠葱散 처방에 金銀花와 小茴 香을 加하였다(Table 1).

Herbal

name Crude drug name (Scientific name)Weight (g) 金銀花 Lonicerae Flos

(Lonicera japonica Thunberg.) 20.0 小茴香 Foeniculi Fructus

(Foeniculum vulgare Miller.) 12.0 蒼 朮 Atractylis Rhizoma

(Atractylodes japonica Koidz. et Kitam.) 4.0 甘 草 Glycyrrhizae Radix

(Glycyrrhiza uralensis Fisch.) 4.0 三 稜 Scirpi Tuber

(Scirpus flaviatilis A. Gray.) 2.8 蓬 朮 Zedoariae Rhizoma

(Curcuma zedoaria Roscoe.) 2.8 茯 苓 Hoelen(Poria cocos Wolf.) 2.8 靑 皮 Aurantii Pericarpium

(Citrus unshiu Markovich.) 2.8 砂 仁 Amomi Semen

(Amomum villosum Lour.) 2.0 丁香皮 Eugeniae Cortex

(Engenia caryophyllata Thunberg.) 2.0 檳 榔 Arecae Semon

(Areca catechu Linne.) 2.0 玄胡索 Corydalis Tuber

(Corydalis turtschaninovii Bess.) 1.2 肉 桂 Cassiae Cortex

(Cinnamomum cassia Presl.) 1.2 乾 薑 Zingiberis Rhizoma

(Zingiber officinale Roscoe.) 1.2 葱 白 Allii Rhizoma

(Allium fistulosum Linne.) 1.2

總 計 62

Table 1. Prescription of Eunhoebanchong-san.

3) 약물 추출

동신대 광주한방병원에서 銀茴蟠葱散 4첩 분량 의 약재를 구입하여 물 600 ml에 넣고 약탕기로 3 시간 동안 가열한 다음 농축한 후 저온순환수조 (COOL ACE CA-1500)에서 1차 동결한 다음 동결 건조기(Samwon, SFDSMO06, 한국)로 동결 건조 하여 32 g의 분말을 얻었다. 銀茴蟠蔥散의 수득률 은 17.8%였다.

2. 방 법

1) 실험군 설정 및 약물 투여

실험은 3군으로 구분하여 시행하였다. 급성 췌장 염을 유발시키지 않은 정상군과 췌장염을 유발시 킨 대조군, EBS를 투여한 실험군으로 구분하였다.

실험군은 EBS의 농도에 따라 3군으로 세분하였다.

EA군은 EBS 130 mg/kg, EB군은 EBS 260 mg/kg, EC군은 EBS 520 mg/kg를 caerulein 투여 시에 각 각 생리식염수 0.5 ml에 용해하여 구강 투여 하였 다.

2) 급성 췌장염 유발

정상군을 제외한 모든 실험동물은 약 16시간 전 부터 사료 공급을 중단한 다음 caerulein(40 μg/kg, Sigma, USA)을 1시간 간격으로 2회 복강 투여하 여 급성 췌장염을 유발¹¹하였다.

3. 관찰방법 1) 췌장/체중 비율

실험이 끝난 모든 실험동물은 pentobarbital sodium (500 mg/kg)을 복강 투여하여 마취한 상태에서 채 혈을 한 다음 췌장을 절취한 후 Grady 등¹²의 방법 에 의하여 wet pancreas weight/wet body weight 계산식을 통하여 체중에 대한 췌장의 중량을 측정 하였다.

2) 혈청 amylase 측정

정상군과 caerulein을 최종 투여한 다음 2시간, 6 시간, 24시간 후에 흰쥐의 심장 채혈을 통하여 혈 청을 얻은 다음 amylase SL kit(ELITECH, France)

를 사용하여 405 nm에서 혈청 amylase의 농도를 측정(photometer 5010, Germany)하였다.

3) 혈청 alanine aminotransferase(ALT) 활성 측정 Alanine aminotransferase(ALT)의 활성 측정은 Reitman-Frankel¹³의 방법에 따라 kit 시약(아산제 약, 한국)을 사용하여 측정하였다. ALT 기질액 1.0 mL을 시험관에 넣고 37℃에서 5분간 방치한 다음 혈청 0.2 ml을 넣어 잘 혼합한 후 37℃에서 30분간 반응시킨 다음 정색 시액 1.0 ml을 첨가하여 잘 혼 합하여 실온에서 20분간 방치하여 반응을 종료시 키고, 0.4 N NaOH 용액 10 ml을 가하여 잘 혼합 한 후 실온에서 약 10분간 방치하였다가 505 nm에 서 흡광도(photometer 5010, Germany)의 변화를 측정하였다.

4) 혈청 Interleukin 6(IL-6) 농도 측정

혈청중의 IL-6 농도는 Pezzilli 등¹⁴의 방법에 의 하여 Mouse IL-6 ELISA kit(BD, USA)를 이용하여 SpectraMax M2(Molecular Device, USA)로 450 nm 에서 측정하였다. 먼저 각 well에 ELISA dilution 50 μl와 혈청 50 μl를 넣고 5초 동안 흔들어 준 후, 실온에서 2시간 동안 incubation하였다. Plate를 wash buffer로 5회 수세하고, 각 well에 Working detector 를 100 μl 넣고 실온에서 1시간 동안 incubation 하 였다. Wash buffer를 이용하여 수세한 다음 DMB 발색제를 넣고 다시 30분 동안 incubation 하고 Stop solution을 분주한 다음 450 nm에서 측정하였다.

5) 광학현미경 관찰

24시간 군에서 흰쥐의 췌장을 적출하고 Bouin 용액을 사용하여 24시간 동안 고정시킨 후 30, 50, 70, 80, 90, 95, 100Ⅰ, 100Ⅱ와 같이 알코올 농도를 상승시켜 탈수한 다음 xylene으로 투명화 과정을 거친 후 파라핀으로 포매하였고, 포매된 조직을 자 동조직절편기(MR-3, USA)을 사용하여 6 μm두께 로 절편을 제작하였다. 절편한 조직을 slide glass 위에 부착시키고 xylene으로 paraffin을 제거한 다 음 100%, 90%, 80% ethanol 과 같이 농도가 낮아 지는 순으로 5분씩 담구어 함수과정을 거치게 하

였다. Hematoxylin과 Eosin으로 이중염색을 한 후 탈수하였다. Canada balsam으로 봉합한 후 카메라 부착 광학현미경(Olympus BX51, Japan)으로 관찰 한 후 사진을 촬영하였다.

6) 전자현미경 관찰

전자현미경 관찰을 위하여 광학현미경 시료와 동일 한 부위의 조직을 절취하여 전고정액 속에서 1 mm³ 크기로 세절한 후 2.5% glutaraldehyde(phosphate buffer, pH 7.4)로 2시간 동안 전고정하였다. 전고 정이 끝난 조직은 동일 완충액을 사용 10분 간격으로 3회 세척한 후 1% osmium tetroxide(OsO4)로 2시간 동안 고정 한 다음 동일 완충액으로 3회 세척하였 다. 세척 후 시료들은 상승농도 순의 에탄올로 탈수 하여 propylene oxide로 치환한 다음 Epon-Araldite 혼합액으로 포매하였고 60℃ 오븐에서 30시간 중합 시켰다. 포매된 조직들을 LKB-Ⅴ형 ultramicrotome 을 사용 1 μm두께로 절편을 제작하여 1% toluidine blue로 hot plate(60℃)상에서 염색하였다. 염색된 시료를 광학현미경으로 관찰하여 조직을 확인한 다음 동일한 부위에서 60 nm두께로 초박절편을 제 작하여 silver grid에 부착하였고, uranyle acetate 와 lead citrate로 이중 염색한 다음 JEM 100 CX-Ⅱ 투과형 전자현미경(80KV)으로 관찰하였다.

7) 세포자멸사 검사

24시간 군의 실험동물에서 췌장 조직의 절편에 존재하는 세포자멸사 검사를 위하여 ApopTag in situ apoptosis detection kit(IntergenⓇ)을 이용하여 수행하였다. 조직 절편을 slide glass에 부착시킨 후 xylene으로 파라핀을 제거하고서 농도가 낮은 순으로 (100%, 90%, 70%) 함수 과정을 거친 다음 5분 동안 PBS에서 배양하였다. 염색은 proteinase K(20 μg/ml;

Sigma)에서 15분 동안 배양한 후, 증류수로 세척하 고, 그 다음 3% H2O2(vol/vol, in PBS)에서 5분 동 안 배양하여 endogenous peroxidase의 활성을 억제 하였다. Equilibration 완충액을 30초 동안 처리 한 다음 terminal deoxynucleotidyl transferase(TDT) enzyme을 37℃에서 1시간 동안 처리하였다. Stop

완충액을 처리 한 다음 slide glass를 수세하였다.

DAB 발색시약을 5분 동안 처리한 후 methyl green 으로 대조 염색한 다음 탈수과정을 거친 후 cover slips을 봉합하였다. 이후 동일한 방법으로 사진을 촬영하였다.

8) 통계분석

결과에 대한 통계처리는 SAS(statistical analysis system)program에 의하여 각 실험군 별로 평균치 와 표준오차를 계산하였고, p-value가 최소한 0.05 이하의 수준에서 유의성을 검정하였다. 본 연구결 과를 분석하는데는 one-way ANOVA 방법을 사용 하였다.

Ⅲ. 결 과

1. 췌장 중량/체중 비율 변화

급성 췌장염을 유발시킨 2시간 후 체중은 정상 군(0.42±0.02)에 비하여 대조군(0.53±0.06)과 EB군 (0.47±0.03), EC군(0.46±0.01)에서 유의성있게 증가 하였으나 대조군과 실험군 사이에 유의성은 없었고 (Fig. 1-1) 6시간 후에는 정상군(0.42±0.02)에 비하여 대조군(0.57±0.02)에서는 유의성 있게 증가하였고 대조군에 비하여 EA군(0.45±0.04), EB군(0.42±0.00), EC군(0.42±0.02)에서는 유의성(p<0.05) 있게 감소 하였으며(Fig. 1-2) 24시간 후 정상군(0.42±0.02)에 비하여 대조군(0.65±0.01)에서는 유의성 있게 증가 하였고 대조군에 비하여 EA군(0.46±0.02), EB군 (0.42±0.01), EC군(0.47±0.02)에서는 유의성 있게 (p<0.05) 감소하였다(Fig. 1-3).

Fig. 1-1. The comparison of pancreas/body weight at 2 hr.

Nor : normal group administrated saline, Con : control group administrated saline before 2hrs ago treated with caerulein, EA group administrated EBS 130 mg/kg, EB group administrated EBS 260 mg/kg, and EC group administered EBS 520 mg/kg before 2hrs ago treated with caerulein.

All values are mean±S.E.M.(n=6). Significant differences were compared with normal at *p<0.05, or control at

p<0.05.

Fig. 1-2. The comparison of pancreas/body weight at 6 hr.

Nor : normal group administrated saline, Con : control group administrated saline before 6 hrs ago treated with caerulein, EA group administrated EBS 130 mg/kg, EB group administrated EBS 260 mg/kg, and EC group administered EBS 520 mg/kg before 6hrs ago treated with caerulein.

All values are mean±S.E.M.(n=6). Significant differences were compared with normal at *p<0.05, or control at

p<0.05.

Fig. 1-3. The comparison of pancreas/body weight at 24hr.

Nor : normal group administrated saline, Con : control group administrated saline before 24 hrs ago treated with caerulein, EA group administrated EBS 130 mg/kg, EB group administrated EBS 260 mg/kg, and EC group administered EBS 520 mg/kg before 24 hrs ago treated with caerulein. All values are mean±S.E.M.(n=6).

Significant differences were compared with normal at *p<0.05, or control at

p<0.05.

2. 혈청 amylase 측정

대조군과 실험군의 심장 채혈을 통한 혈청 amylase 의 농도를 측정하였다. 그 결과 caerulein을 투여한 다음 2시간부터 amylase의 농도가 증가하기 시작 하였으며, 6시간(5,384±127.55)에 정점에 도달하였 고 그 이후 시간이 경과함에 따라 점차 감소하였 다. Amylase의 활성은 대조군이 정상군에 비하여 모든 시간에서 유의성(*p<0.05)있게 높았고 EA군, EB군, EC군은 대조군에 비하여 유의성(^#p<0.05) 있게 감소하였다(Fig. 2).

3. 혈청 alanine aminotransferase(ALT) 활성 Caerulein에 의한 조직의 손상정도를 규명하기 위하여 ALT 활성을 검사하였다. 2시간 후 정상군 (22.8±1.74 U/ℓ)에 비하여 대조군(30±4.93 U/ℓ)과 EC군(29.2±1.57 U/ℓ)이 다소 증가하였고(Fig. 3-1) 6시간 후 정상군(22.8±1.74 U/ℓ)에 비하여 대조군 (29±2.52 U/ℓ)과 EB군(30±5.63 U/ℓ)이 다소 증가 하였으며(Fig. 3-2) 24시간 후 정상군(22.8±1.74 U/ℓ)

에 비하여 대조군(31.3±4.18 U/ℓ)이 가장 높게 나타 났으며, EA군(24±4.19 U/ℓ) 과 EB군(23±5.53 U/ℓ)은 대조군에 비하여 다소 감소하였으며, EC군(22±2.11 U/ℓ)은 유의성(p<0.05) 있게 활성이 감소하였다 (Fig. 3-3).

Fig. 2. The changes of serum amylase activities.

Nor : normal group administrated saline, Con : control group administrated saline before 2 hrs ago treated with caerulein, EA group administrated EBS 130 mg/kg, EB group administrated EBS 260 mg/kg, and EC group administered EBS 520 mg/kg before 2 hrs ago treated with caerulein.

All values are mean±S.E.M.(n=6). Significant differences were compared with normal at *p<0.05, or control at

p<0.05.

Fig. 3-1. The changes of ALT activities at 2 hrs.

Nor : normal group administrated saline, Con : control group administrated saline before 2 hrs ago treated with caerulein, EA group administrated EBS 130 mg/kg, EB group administrated EBS 260 mg/kg, and EC group administered EBS 520 mg/kg before 2hrs ago treated with caerulein.

All values are mean±S.E.M.(n=6). Significant differences were compared with normal at *p<0.05, or control at

p<0.05.

Fig. 3-2. The changes of ALT activities at 6 hrs.

Nor : normal group administrated saline, Con : control group administrated saline before 6hrs ago treated with caerulein, EA group administrated EBS 130 mg/kg, EB group administrated EBS 260 mg/kg, and EC group administered EBS 520 mg/kg before 6hrs ago treated with caerulein.

All values are mean±S.E.M.(n=6). Significant differences were compared with normal at *p<0.05, or control at

p<0.05.

Fig. 3-3. The changes of ALT activities at 24 hrs.

Nor : normal group administrated saline, Con : control group administrated saline before 24hrs ago treated with caerulein, EA group administrated EBS 130 mg/kg, EB group administrated EBS 260 mg/kg, and EC group administered EBS 520 mg/kg before 24 hrs ago treated with caerulein. All values are mean±S.E.M.(n=6).

Significant differences were compared with normal

at *p<0.05, or control at

p<0.05.

4. 혈청 Interleukin 6(IL-6) 농도

2시간 후 정상군(6.62±0.21 pg/mL)에 비하여 대조 군(8.93±0.13 pg/ml)과 EA군(8.6±0.25 pg/ml), EB군 (8.56±0.13 pg/ml), EC군(8.64±0.17 pg/ml) 모두 유 의성(*p<0.05)있게 증가하였고(Fig. 4-1) 6시간 후 정상군(6.62±0.21 pg/ml)에 비하여 대조군(9.33±0.24 pg/ml)과 EA군(9.07±0.11 pg/ml), EB군(9.07±0.11 pg/ml), EC군(8.84±0.11 pg/ml) 모두 유의성(*p<0.05) 있게 증가하였으며, 대조군이 전반적으로 높았다 (Fig. 4-2). 24시간 후 정상군(6.62±0.21 pg/ml)에 비하여 대조군(32±5.20 pg/ml)이 약 5배 정도 증가 하였으며, EA군(18.32±0.59 pg/ml), EB군(18.96±0.86 pg/ml), EC군(17.67±0.51 pg/ml)은 약 3배 정도 증 가하였으며 모두 유의성(*p<0.05)있었다. 한편 EA군, EB군, EC군은 대조군에 비하여 유의성(^#p<0.05) 있게 감소하였다(Fig. 4-3).

Fig. 4-1. The changes of IL-6 at 2 hrs.

Nor : normal group administrated saline, Con : control group administrated saline before 2 hrs ago treated with caerulein, EA group administrated EBS 130 mg/kg, EB group administrated EBS 260 mg/kg, and EC group administered EBS 520 mg/kg before 2 hrs ago treated with caerulein.

All values are mean±S.E.M.(n=6). Significant differences were compared with normal at

*p<0.05, or control at

p<0.05.

Fig. 4-2. The changes of IL-6 at 6 hrs.

Nor : normal group administrated saline, Con : control group administrated saline before 6hrs ago treated with caerulein, EA group administrated EBS 130 mg/kg, EB group administrated EBS 260 mg/kg, and EC group administered EBS 520 mg/kg before 6hrs ago treated with caerulein.

All values are mean±S.E.M.(n=6). Significant differences were compared with normal at *p<0.05, or control at

p<0.05.

Fig. 4-3. The changes of IL-6 at 24 hrs.

Nor : normal group administrated saline, Con : control group administrated saline before 24hrs ago treated with caerulein, EA group administrated EBS 130 mg/kg, EB group administrated EBS 260 mg/kg, and EC group administered EBS 520 mg/kg before 24 hrs ago treated with caerulein. All values are mean±S.E.M.(n=6).

Significant differences were compared with normal at *p<0.05, or control at

p<0.05.

5. 광학현미경 관찰

정상군 샘꽈리세포들은 둥글게 또는 다소 불규 칙하게 배열되어 있었다. 샘꽈리세포의 핵은 세포 의 바닥쪽에 위치하였고, 핵 주변 세포질은 eosin에 강한 염색성을 보였다(Fig. 5A). Caerulein을 투여 24시간 후 대조군 췌장은 샘꽈리세포들의 샘꽈리

가 매우 팽창되어 있는 것을 볼 수 있었고, 정상군 에서 관찰되었던 샘꽈리의 강한 호염기성은 아주 약하게 관찰되었다(Fig. 5B). EA군의 샘꽈리세포 의 팽창은 대조군에 비하여 다소 감소하였으며, 꽈 리부분의 호염기성은 다소 높게 나타났다(Fig. 5C).

EB군의 샘꽈리세포들의 팽창은 대조군이나 EA군 에 비하여 보다 더 감소하였고, 샘꽈리세포의 호염 기성은 실험군 중에서 가장 높았다(Fig. 5D). EC 군의 샘꽈리세포의 샘꽈리의 팽창은 정상군과 같 이 회복되지는 않았지만 대조군에 비하여 현저히 감소하였고, EA나 EB군에 비하여 미약하였으며, 꽈리의 호염기성은 대조군이나 EA군에 비하여 높 고 EB군에 비하여 낮았다(Fig. 5E).

Fig. 5. Light micrographs of pancreatitis in 24 hrs groups.

A : normal group, B : control group, C : EA group, D : EB group, E : EC group. Tissue sections were stained with hematoxylin and eosin for light microscopy. Original magnification=×200.

6. 전자현미경 관찰

정상군에서 샘꽈리세포의 핵은 둥글고 세포의 바닥 부분에 치우쳐 있으며, 핵질이 고르게 발달해 있고 커다란 핵소체를 함유하고 있었다. 샘꽈리세

포의 바닥쪽 세포질은 과립세포질세망으로 충만되 어 있으며, 다수의 사립체가 주로 세포의 바닥 부 분에서 관찰되었다. 핵 윗부분에는 잘 발달된 골지 복합체가 효소원과립(zymogen granule) 사이에서 관찰되었다. 간혹 전자밀도가 낮은 효소원이전과립 (prozymogen granule)이 관찰되며, 샘꽈리세포의 자유면에는 소수의 짧은 미세융모들을 볼 수 있었 다(Fig. 6a).

대조군에서 24시간 후 관찰되는 샘꽈리세포의 핵은 핵질이 고르지 않고 전반적으로 전자밀도가 낮았으며 핵의 바닥 쪽에서 관찰되는 과립세포질 세망은 발달이 아주 미약하여 손상되어 있음을 확 인할 수 있었다. 사립체 또한 손상된 구조를 보여 주었을 뿐만 아니라 소수 관찰되었고 핵의 윗부분 에서 관찰되는 효소원과립들은 그 수가 현저히 감 소하였다(Fig. 6b).

N No

M ZG

rER

(a)

M No

rER N

(b)

Fig. 6. Electron microgrphs of acinar cells from normal(a) and control groups(b).

N : Nucleus, No : Nucleolus, rER : rough

endoplasmic reticulum, ZG : Zymogen granule.

EA군의 샘꽈리세포 핵은 핵질이 고루지 못하고 전자밀도는 비교적 낮았고 핵의 바닥 쪽에서 관찰 되는 과립세포질세망의 발달은 정상군에 비하여 미약하였으며, 다소 손상된 소견을 보여주었다. 골 지복합체의 발달 또한 미약하였으며, 효소원과립은 정상군에 비하여 현저히 감소하였지만 대조군에 비하여 다소 증가하였다(Fig. 7a-b).

M N rER

(a)

(b)

N

rER No

ZG

ZG

No

M

Fig. 7. Electron microgrphs of acinar cells from normal(a) and EA groups(b).

N : Nucleus, No : Nucleolus, rER : rough endoplasmic reticulum, ZG : Zymogen granule.

EB군의 샘꽈리세포의 핵은 핵질이 다소 고루지 못하였고 핵의 바닥 쪽에서 주로 관찰되는 과립세 포질세망은 아주 잘 발달되어 있었으며 다수의 사 립체들이 나타났다. 골지복합체가 발달해 있었으 며, 효소원과립의 수가 대조군에 비하여 증가하였 다(Fig. 8a-b).

N

M

rER (a)

(b)

N

M rER

ZG

ZG

Fig. 8. Electron microgrphs of acinar cells from normal(a) and EB groups(b).

N : Nucleus, No : Nucleolus, rER : rough endoplasmic reticulum, ZG : Zymogen granule.

EC군의 샘꽈리세포의 핵은 핵질이 고루게 나타 났으며 핵의 바닥 쪽에서는 아주 잘 발달된 과립 세포질세망이 있었는데 이들의 내강은 매우 팽창 되어 있고 주변에 크고 작은 분비소포들이 집적되 어 있었다. 다수의 사립체들이 관찰되었는데 이들 의 크기는 매우 크고 크리스테의 형태가 뚜렷하였 고 골지복합체 또한 잘 발달해 있었다. 전자밀도가 높은 효소원과립의 수는 매우 증가하였고, 전자밀 도가 다소 낮은 효소원이전과립이 수 또한 매우 증가하였다(Fig. 9a-b).

N

M Go

(a)

(b)

M

N

rER ZG

No

ZG

Fig. 9. Electron microgrphs of acinar cells from normal(a) and EC groups(b).

N : Nucleus, No : Nucleolus, rER : rough endoplasmic reticulum, ZG; Zymogen granule.

7. 세포자멸사 검사(Tunel Assay)

Caeruelin의 투여로 췌장염이 유발된 24시간 후에 샘꽈리세포들의 세포자멸사를 확인 하고자 Tunel assay를 시행하였다. 그 결과 정상군에서는 세포자 멸사 핵들이 관찰되지 않았지만(Fig. 10A), 대조군 에서 가장 많은 세포들이 세포자멸사 되었다(Fig.

10B). EA군에서는 대조군에 비하여 세포자멸사 핵 들이 다소 감소하였고(Fig. 10C), EB군에서는 EA 군 보다 더 감소하였으며(Fig. 10D), EC군에서는 실험군 중에서 세포자멸사 핵의 수가 가장 낮게 나타났다(Fig. 10E).

Fig. 10. Light micrographs of pancreatitis in 24 hrs groups.

A : normal group, B : control group, C : EA group, D : EB group, E : EC group. Tissue sections were stained with Tunel assay. A number of apoptotic nuclei are observed in the control group(B). Arrows indicate apoptotic nuclei. Original magnification=×200.

Ⅳ. 고 찰

급성 췌장염을 일으키는 원인들은 매우 다양하 다. 가장 흔한 원인으로는 담석 및 음주로 보고되 고 있으나 일반적으로 급성 췌장염 발생 기전의 기본 과정은 어떠한 원인이든지 유사한 염증 및 복구 과정을 보인다. 1896년 Chiari가 췌장의 “자가 소화”(autodigestion) 개념을 제안한 이후, 급성 췌 장염의 병태 생리에 관한 다양한 개념들이 발전되 고 있다¹⁵. 급성 췌장염에서 염증 반응이 어떻게 진 행되는지에 관한 평가는 현재까지도 많은 연구가 되고 있지만 분명한 것은 췌장염의 시작 시 한 가 지 이상의 변화들이 생김으로써 췌장의 자가소화 를 유발시키는 것으로 알려져 있다. 이러한 변화들 을 요약하면 급성췌장염의 염증변화는 trypsin의

조숙한 활성화, lysosome 가수분해 효소와 공동국 소화(colocalization), 세포내 calcium의 지속적 증가, 세포 선단의 F-actin의 파괴, 전사 인자인 NF-kB 의 활성화 등으로 볼 수 있다¹⁶.

급성 췌장염의 병태 생리 연구는 동물 실험이 주류를 이루는데, 병태모델마다 다양한 병정과 사 망률을 보이기 때문에 실험 목적에 따라 다양하게 유발물질을 이용할 수 있다. 실험적 췌장염은 답즙산, 알콜, 췌 효소 등의 여러 가지 물질의 췌관 내 주입 으로 쉽게 일으킬 수 있으며 근래에 cholecystokinin 유사물질인 caerulein을 최대 분비 자극 용량 이상 으로 주사하여 유발시키는 췌장염 모델이 많이 이 용되고 있다^17,18. 과분비 자극으로 인한 췌장염의 기전으로는 아미노산이나 단백질 합성과는 무관하 게¹⁹ zymogen과립이 서로 융합하여 세포질내 공포 를 형성하고 이것이 리소좀과 합쳐져 세포 내 자 가소화기전으로 췌장염을 일으킨다²⁰.

caerulein 유도 췌장염 모델은 재현성이 뛰어나 고 쥐, 생쥐 등을 이용하여 수행에 드는 비용이 저 렴하여 가장 널리 사용되는 실험동물 모델로서 그 동안 많은 연구에 의하여 발생 기전에 관하여 비 교적 잘 연구되어 온 실험모델이다^16,21,22.

급성 췌장염은 ‘脾心痛’, ‘結胸’등에서 유사성을 찾아 볼 수 있고³, ≪靈樞･厥病篇≫⁴에 “腹脹胸滿, 心尤痛甚, 胃心痛也 … 痛如以錐鍼刺其心, 心痛甚 者, 脾心痛也”이라 하여 급성 췌장염과 유사한 통 증 부위와 증상을 언급했다.

蟠葱散은 宋代 편찬된 陳의 ≪太平惠民和劑局方≫

에 수록된 처방으로 “脾胃虛冷 攻築心腹 連脇肋刺 痛 胸膈痞悶 背膊連項 拘急疼痛" 등을 치료한다고 하였고, 龔²³은 小腸氣痛에, 李²⁴는 脾心痛과 寒性의 七情疝에, 許 등²⁵은 寒疝에, 黃²⁶은 脾胃虛冷으로 인한 心腹痛과 膀胱氣痛 小腸氣痛 腎氣作痛에 응 용하였으며, 현대에 와서 腎心痛 氣痛 心痛 寒疝 氣疝 胃痙攣 等症에 응용하고 있다. 근래에는 本方 에 항염증효과가 뛰어난 金銀花²⁷와 진통, 소염 효 과가 뛰어난 小茴香²⁸을 加하여 銀茴蟠葱散이라 명

하고 급만성 췌장염에 응용하여 임상적으로 높은 효과를 나타내고 있으며¹ 김 등⁵의 동물실험을 통 하여 銀茴蟠葱散의 췌장염에 대한 높은 유의성이 인정되었다.

銀茴蟠葱散의 구성약물중 金銀花²⁷와 小茴香²⁸을 포함하여 肉桂 砂仁 靑皮 蓬朮은 평활근경련에 대 한 항경련작용²⁹, 甘草는 항 bacteria 및 항균작용³⁰, 玄胡索은 지통작용³¹, 乾薑은 항 bacteria작용 및 항 염증작용³² 등의 실험보고가 있다.

실험에서 rat에게 투여된 銀茴蟠葱散의 용량은 실제 임상에서 사용되고 있는 일반 성인(평균 몸 무게 70 kg)의 銀茴蟠葱散 하루 투여량(9 g)을 기 준으로, rat의 몸무게에 맞추어 비례 배분하여 투 여하도록 하였다. 또한 실험 군을 셋으로 나누어 銀茴蟠葱散 투여 기준량의 각각 1배, 2배, 4배 분량 을 투여하여 투여량에 따른 효과를 비교 관찰하였 다.

Caerulein으로 유도한 급성 췌장염에서 몸무게에 대한 췌장비율이 높아지는 것으로 알려져 있다³³. 본 실험에서 銀茴蟠葱散은 Caerulein으로 유도한 급성 췌장염의 몸무게에 대한 췌장 비율 증가를 억제하는 것으로 확인하였다. 이러한 결과는 銀茴 蟠葱散이 급성 췌장염을 유발할 때에 부종을 억제 할 수 있음을 시사한다.

혈청 amylase 수준은 급성 췌장염을 예측할 수 있는 중요한 바이오마커 중 하나로³⁴ 췌장에 염증 이 있을 때 amylase가 직접 또는 림프관을 통하여 혈중으로 들어가 혈청 amylase가 상승하게 되는데 amylase는 혈중에서 제거되며 반감기는 10시간 정 도이므로 아주 높은 고amylase혈증이라도 이 효소 가 지속적으로 혈중에 공급되지 않으면 24시간 내 에 정상으로 되기 때문에 되도록 빨리 측정하는 것이 중요하다². 본 실험에서도 caerulein을 투여한 다음 2시간에서부터 amylase의 농도가 증가하기 시작하였으며, 6시간에 정점에 도달하였고 그 이후 시간이 경과함에 따라 점차 감소하였다. Amylase의 활성은 대조군이 정상군에 비하여 모든 시간에서

유의성 있게 높았고 EA군, EB군, EC군은 대조군 에 비하여 amylase의 활성이 유의성 있게 낮은 것 을 확인하였는데, 이는 caerulein으로 유도된 급성 췌장염에 銀茴蟠葱散이 유용하게 활용될 수 있음 을 의미한다.

Caerulein에 의한 조직의 손상정도를 규명하기 위하여 투여 24시간 후 ALT 활성을 검사한 결과, 정상군에 비하여 대조군이 가장 높게 나타났으며, EA군과 EB군은 대조군에 비하여 다소 낮게 나타 났고, EC군은 유의성 있게 활성이 감소하였다. 이 는 銀茴蟠葱散이 급성 췌장염 발생 시 ALT의 활 성을 감소시켜 조직의 손상을 제어한다고 볼 수 있 다.

IL-6은 급성기 단백반응의 주 매개체이며 숙주 의 자연적 방어기전에 관여하는 물질로 급성 췌장 염의 정도와 예후를 반영해 주는 표시자로서 24-48 시간내에 기준치의 3-6배 정도로 상승하며 급성기 단백인 C-반응단백(C-reactive protein)의 상승보 다 선행하는 것으로 밝혀졌다³⁵. 24시간 후 혈청 내 IL-6의 농도를 관찰한 결과 정상군에 비하여 대조 군이 약 5배 정도 증가하였으며, 실험군인 EA군, EB군, EC군은 약 3배 정도 증가하였으나 대조군 에 비하여서는 유의성 있게 감소한 수치를 나타내 었다. 이는 銀茴蟠葱散이 급성 췌장염 유발 시 IL-6 조절에 중요한 역할을 할 수 있음을 시사한다.

Caerulein으로 유도한 급성 췌장염에서는 췌장 조직의 염증, 부종, 공포화, 괴저가 일어나는 것으 로 알려져 있다³⁶. 광학 현미경･전자현미경 관찰결 과 대조군에 비해 실험군에서 췌장 조직의 염증, 부종, 공포화, 괴저를 유의성 있게 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

Caeruelin의 투여로 췌장염이 유발된 24시간 후 에 샘꽈리세포들의 세포자멸사를 확인 하고자 Tunel assay를 시행한 결과 정상군에서는 세포자멸사 핵 들이 관찰되지 않았지만, 대조군에서 가장 많은 세 포들의 세포자멸사가 확인 되었고, 실험군 모두에 서 대조군에 비하여 세포자멸사 핵들이 감소하였

으며, 고용량 일수록 세포자멸사 핵의 수가 낮게 나타났다. 이러한 결과는 銀茴蟠葱散이 급성 췌장 염 유발 시 조직의 손상을 억제하는 데 효과적인 약물이라는 것을 암시한다.

이상의 실험결과를 요약하면 실험군은 대조군에 비하여 췌장 중량/체중 비율, 혈청 amylase 측정, 혈청 alanine aminotransferase(ALT) 활성 측정, Interleukin 6(IL-6) 측정 등에서 유의성 있는 효과 를 보였으며, 광학 현미경과 전자 현미경 관찰, 세 포자멸사 검사를 통해 췌장염 억제 효과 와 췌장 조직 보호효과가 유의한 것으로 나타났다. 이와 같 은 효과는 일반적으로 투여량에 비례하는 것으로 사료되나 보다 정확한 적정투여량과 적정투여기간 에 대한 검증이 추가적으로 필요할 것으로 사료된 다.

Ⅴ. 결 론

급성 췌장염에 대한 銀茴蟠葱散의 효과를 알아 보기 위하여 실험 동물에 Caerulein으로 급성췌장 염을 유발시킨 후, 투여량을 달리하여 설정한 실험군 (EA군 : EBS 130 mg/kg, EB군 : EBS 260 mg/kg, EC군 : EBS 520 mg/kg)을 통해 다음과 같은 결 론을 얻었다.

1. 몸무게에 대한 췌장 비율이 모든 실험군에서 유 의성 있는 억제효과를 나타내었다.

2. Amylase의 활성이 모든 실험군에서 유의성 있 게 감소하였다.

3. ALT 활성 측정 결과 24시간 후 EC군에서 유의 성 있게 활성이 감소되었다.

4. IL-6 측정 결과 모든 실험군에서 유의성 있게 감소되었다.

5. 광학 현미경ㆍ전자현미경 관찰 결과 대조군에 비해 실험군에서 췌장 조직의 염증, 부종, 공포 화, 괴저가 유의성 있게 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

6. 세포자멸사 확인 결과 실험군 모두에서 대조군 에 비하여 세포자멸사 핵들이 감소하였고, 고용량 일수록 세포자멸사 핵의 수가 낮게 나타났다.

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