Effects of water extract of Paeoniae Radix Alba on a thioacetamide induced acute liver injury rat model

(1)

ABSTRACT

Purpose:

Paeonia Radix Alba is a traditional herbal medicine used to treat the liver and the

spleen. Many studies have reported that Paeonia Radix Alba extract (PR) affects liver injury,

but there has been no study on liver injuries induced by thioacetamide (TAA). Therefore, we

aimed at evaluating the effect of PR on a TAA-induced acute liver injury (ALI) model.

Methods:

The antioxidant activity of PR was assayed by the content of total polyphenol, total

flavonoid, 1,1-diphenyl-2′-picrylhydrazyl (DPPH), and 2,2'-azino-bis

(3-ethylbenzo-thiazoline-6-sulfonicacid) (ABTS) radical scavenging activities

in vitro test. ALI was induced via-intraperitoneal

injection of TAA (200 mg/kg body weight) for three consecutive days. Also, silymarin (100 mg/

kg body weight) and PR (100 or 200 mg/kg body weight) were administered at 1 hours 30 minutes

prior to TAA treatment. The levels of ammonia, glutamic oxaloacetic transaminase (GOT),

and glutamic pyruvic transaminase (GPT) were analyzed using an assay kit. The expressions of

antioxidant proteins including Nrf2, Keap1, HO-1, SOD, catalase, and GPx-1/2 and oxidative

stress-related proteins including NOX2, p47

phox

_{, and p22}

phox

_{were evaluated by the western blot analysis.}

Results:

PR showed excellent antioxidant activity

in vitro. TAA administration increased the

levels of ammonia, GOT, and GPT in the ALI control group compared to the normal group,

whereas it was significantly reduced by PR pretreatment. Moreover, NADPH oxidase protein

expressions were upregulated after TAA treatment, while the elevated expressions were

inhibited by PR pretreatment. The expressions of antioxidant protein were downregulated

in the ALI control group, whereas Nrf2 activation in the PR group was accompanied by

increased levels of antioxidant enzymes.

Conclusion:

PR administration increased the antioxidant enzymes via activation of the

Keap1/Nrf2 pathway and inhibited the protein levels of NADPH oxidase factors. Taken

together, these results showed that PR treatment may be considered to ameliorate acute liver

injury induced by TAA.

Keywords:

acute liver injury, Paeoniae Radix, oxidative stress, antioxidant, thioacetamide

Research Article

Effects of water extract of Paeoniae

Radix Alba on a thioacetamide

induced acute liver injury rat model

Se Hui Lee

1

_{, Mi-Rae Shin}

1

_{, Ji Hye Lee}

2

_{, and Seong-Soo Roh}

1

1_{Department of Herbology, College of Korean Medicine, Daegu Haany University, Daegu 42158, Korea} 2_{Herbal Medicine Resources Research Center, Korea Institute of Oriental Medicine, Daejeon 34054, Korea}

Thioacetamide

_유발

_급성

_간손상

_동물

모델에

백작약

열수

추출물이

미치는

효능

이세희

1

_,

_신미래

1

_,

_이지혜

2

_,

_노성수

1 1_{대구한의대학교 한의과대학 본초약리학교실} 2_{한국한의학연구원 한약자원연구센터} Received: Jan 18, 2021 Revised: Feb 10, 2021 Accepted: Feb 18, 2021 Correspondence to Seong-Soo Roh

Department of Herbology, College of Korean Medicine, Daegu Haany University, 136 Sincheondong-ro, Suseong-gu, Daegu 42158, Korea.

Tel: +82-53-770-2350 E-mail: [email protected] © 2021 The Korean Nutrition Society This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http:// creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. ORCID iDs Se Hui Lee https://orcid.org/0000-0002-9102-7115 Mi-Rae Shin https://orcid.org/0000-0002-4365-6988 Ji Hye Lee https://orcid.org/0000-0003-3236-7416 Seong-Soo Roh https://orcid.org/0000-0002-4162-6849 Funding

This work was supported by the National Research Foundation of Korea (NRF) grant funded by the Korea government (MSIT) (No.2018R1A5A2025272).

Conflict of Interest

There are no financial or other issues that might lead to conflict of interest.

(2)

서론

최근

현대인들의

건강과

생활

수준의

향상에

대한

관심이

점점

증가하면서

각종

질환과

노화를

촉진하는

요인에

대한

연구가

활발히

진행되고

있다

.

많은

질환

중

사망원인의

전체

8

위에

해

당하는

간질환의

경우

산화적

스트레스

,

알코올

,

약물

및

바이러스로

인해

염증

반응이

생기게

되고

,

염증

반응이

지속될

시

간염

,

간섬유화

,

간경변증

및

간암

등의

만성

질환으로

진행되는

것으로

보고되어

있다

[1].

간질환의

원인

중

하나인

산화적

스트레스

(oxidative stress, OS)

는

인

체

내

대사산물인

과산화수소

(hydrogen peroxide, H2O2),

과산화물

음이온

(superoxide anion, O2 −₎

_및

_수산화

_라디칼

_{(hydroxyl radical, OH)}

_을

_포함하는

_{활성산소종}

_{(reactive oxygen species, ROS)}

을

생성하며

,

자외선

노출

,

과도한

스트레스

,

음주

및

흡연과

같은

외부

요인에

의해서도

생성

될

수

있다

[2].

생성된

과량의

ROS

는

세포나

조직에

유해한

손상을

입히게

되는데

,

이

상태가

지속되면

지질산화와

단백질

변성

등으로

인해

세포막을

파괴하고

, DNA

를

손상시켜

간질환

뿐만

아니라

당뇨

,

고혈압

,

고지혈증

,

위염

,

알츠하이머

치매

,

신장염

및

암과

같은

만성

질환의

발병률이

증가하는

것으로

알려져

있다

[3,4].

정상

세포는

산화적

스트레스로

인해

대사

과정

중에

생성되는

ROS

를

제거할

수

있는

항산화

체계를

구축하고

있으며

,

효소적

그리고

비효소적

방어로

체계적인

구분이

되어

있다

.

효소

적

방어

기전으로

superoxide dismutase (SOD), catalase

및

glutathione peroxidase (GPx)-1/2

등

의

항산화

효소들의

작용이

있으며

, tocopherol

과

비타민

C

같은

강한

항산화

활성을

가진

유

기화합물

등에

의해

제거하는

비효소적

방어가

있다

[5].

이와

같은

작용으로

체내에서

생성

되는

ROS

를

제어하고

있지만

다른

요인들로

인해

과다

생성되어

항산화

시스템의

활성이

저

해되면

세포와

조직

내의

산화적

스트레스가

증가하게

된다

[6,7].

따라서

각종

질환

예방을

위해서

생체

내

산화적

스트레스를

조절하는

것이

매우

중요한

문제로

대두되고

있다

.

백작약

(Paeoniae Radix Alba, PR)

은

작약과

(Paeoniacease)

의

작약속

(Paeonia)

에

속하는

다년

생식물로

주로

뿌리를

건조하여

약재로

사용한다

.

한의학에서

백작약은

간

(肝)

과

폐

(肺)

를

보하고

,

양혈유간

(養血柔肝),

완중지통

(緩中止痛),

염음수한

(斂陰收汗)

하는

효능이

있다고

알

려져

있으며

[8],

복통

,

두통

,

생리불순

및

생리통

등

여러

통증에

효과가

있는

것으로

보고되

어

있다

.

주요

약리효과로

항균

[9],

항암

[10],

항염증

[11],

항산화

[12,13]

및

항노화

[14]

등이

보고되어

있다

.

백작약으로부터

paeoniflorin, paeonel, paeonine, gallic acid

및

catechin

등의

다양한

생리활성

물질이

분리되어

있으며

[15],

유효성분

중

gallic acid

와

catechin

의

산화적

스트레스

억제

효과

[16]

를

비롯해

간독성

보호

[17,18]

등

다양한

연구가

보고되어

있다

.

그러

나

연구들의

경우

,

백작약

열수

추출물의

항암과

항산화

효과에

초점이

맞춰져

있어

간

보호

효과를

비롯한

간독성에

대한

연구가

부족한

실정이다

.

기존

연구들의

경우

lipopolysac-charide (LPS),

사염화탄소

(carbon tetrachloride, CCL4)

로

유발한

동물

모델로

백작약

열수

추

출물의

간보호

효과를

평가하였으며

, thioacetamide (TAA)

를

이용한

간손상

연구는

이루어지

지

않고

있다

.

따라서

본

연구에서는

백작약

열수

추출물의

항산화능과

TAA

로

인한

산화적

손

상의

연관성을

알아보고자

in vitro

와

in vivo

실험을

통해

항산화능과

산화적

스트레스의

억제

(3)

연구방법

시료

추출

본

실험에

사용한

백작약은

약전규격집에

따로

규정이

없는

생약으로

약효가

가장

높을

때

채

취하여

60°C

이하에서

말린

적합한

것을

옹기한약국

(Daegu, Korea)

에서

구매하여

사용하였

다

.

백작약

300 g

에

10

배수의

증류수

3,000 mL

를

가한

후

열탕

추출기

(DWT-1800T; Daewoong Pharmaceutical Co., Ltd., Seoul, Korea)

에서

2

시간

추출하여

얻은

추출액을

50°C

의

감압

추출

장치

(Buchi B-480; Buchi AG, Flawil, Switzerland)

를

이용하여

농축하였다

.

그

동결

건조

기

(FD5508; Ilshin Biobase Co., Ltd., Yangju, Korea)

를

이용하여

27.9 g

의

백작약

파우더

(PR,

수

율

9.3%)

를

얻었으며

,

이를

냉동

(−80°C)

보관

후

실험

직전

증류수에

녹여

실험에

사용하였다

.

시약

본

실험에

사용된

L-(+)-ascorbic acid

는

Alfa Aesar (Tewksbury, MA, USA)

에서

구매하였으며

, TAA, potassium persulfate, phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), potassium phosphate dibasic, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), 7 mM 2,2′-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS), naringin, gallic acid, Folin-Ciocalteu's phenol reagent, diethylene glycol, sodium carbonate, sodium hydroxide

및

potassium phosphate monobasic

은

Sigma Aldrich Co., Ltd. (St. Louis, MO, USA)

에서

구입하여

사용하였다

. 1

차

항체

nicotinamide adenine dinucleotide phos-phate oxidase 2 (NOX2), p47phox_{, p22}phox_{, nuclear factor erythroid 2–related factor 2 (Nrf2),} kelch-like ECH-associated protein 1 (Keap1), heme oxygenase-1 (HO-1), superoxide dismutase (SOD), catalase, glutathione peroxidase-1/2 (GPx-1/2), β-actin

및

histone

은

Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)

에서

구매하였으며

, 2

차

항체인

rabbit lgG antibody

와

mouse lgG anti-body

는

GeneTex, Inc. (San Antonio, TX, USA)

에서

구입하여

사용하였다

. Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit

는

Thermo Scientific (Rockford, IL, USA)

에서

구입하여

단백질

정량을

위해

사용하였으며

, GE Healthcare (Bloomington, IL, USA)

에서

ECL western blotting

검출시약

을

구입하여

사용하였다

. Protease inhibitor mixture, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)

는

Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Osaka, Japan)

에서

구입하였다

.

총

폴리페놀과

총

플라보노이드

함량

측정

총

폴리페놀은

총

페놀화합물

(total phenolic compound)

정량법

[19]

에

의해

측정하였다

. 10

µL

의

시료

, Folin-Ciocalteu's phenol reagent 50 µL,

증류수

790 µL

를

혼합하여

실온에서

1

분

동

안

반응시킨

후

150 µL

의

20% sodium carbonate

를

넣어주었다

.

실온의

환경에서

2

시간

동안

반응시킨

를

사용하

여

765 nm

에서

흡광도를

측정한

뒤

,

표준물질인

gallic acid

로

표준

검량선을

구하고

총

폴리

페놀

함량을

산출하였다

.

총

플라보노이드는

Lister

등

[20]

의

방법에

의해

함량을

측정하였다

. Diethylene glycol 1 mL,

100 µL

의

시료와

1 N NaOH 10 µL

를

혼합하여

37°C

의

환경에서

1

시간

동안

반응시킨

에서

흡광도를

측정하였다

.

표준물질인

naringin

으로

표준

검량선을

구하여

총

플라보노

(4)

DPPH

자유

라디칼

(free radical)

소거능

분석

백작약

열수

추출물의

항산화능

분석을

위해서

Blois

의

DPPH

자유

라디칼

소거법을

활용하

였다

[21]. 60 µM DPPH

용액

100 µL

와

백작약

열수

추출물을

농도별로

희석한

용액

100 µL

를

혼합한

후

실온의

암실에

30

분

동안

반응시켜

540 nm

에서

흡광도를

측정하였다

.

본

실험에

서

L-ascorbic acid

는

양성대조군으로

사용하였으며

, IC50 (the half maximal inhibitory

concen-tration)

값은

아래의

식으로

계산하여

값을

구하였다

.

DPPH

라디칼

소거

활성

(%) = [1 − (ODsample/ODcontrol)] × 100

ODsample:

시료의

흡광도

ODcontrol:

대조군의

흡광도

ABTS

자유

라디칼

소거능

분석

백작약

열수

추출물의

항산화능을

평가하기

위해서

Re

등

[22]

의

ABTS

자유

라디칼

소거법을

활용하였다

. 2.4 mM potassium persulfate

와

7 mM ABTS

시약을

혼합하여

실온의

암소

환경에

서

약

16

시간

방치한

후

ABTS+

_을

_형성시켜

_흡광도

_{415 nm}

_에서

_{0.70 ± 0.02}

_측정값이

_되도록

_에

탄올로

희석하여

사용하였다

.

희석된

ABTS

용액

95 µL

에

백작약

열수

추출물

5 µL

를

가하여

15

분

동안

방치하고

415 nm

에서

흡광도를

측정하였다

.

본

실험에서

L-ascorbic acid

는

양성대

조군으로

사용하였으며

, IC50

값은

아래의

식으로

계산하여

값을

구하였다

.

ABTS

라디칼

소거

활성

(%) = [1 − (ODsample/ODcontrol)] × 100

ODsample:

시료의

흡광도

ODcontrol:

대조군의

흡광도

실험

동물

및

유발

본

실험에

사용되는

동물은

대한바이오

(Eumseong, Korea)

에서

6

주령

(200 g

내외

)

Sprague-Dawley (SD) rat

수컷을

구매하였으며

,

물과

고형사료

(Zeigler Bros, Inc., PA, USA)

를

자유롭게

공급하였다

.

온도

(23°C ± 2°C),

습도

(50% ± 10%)

및

명암주기

(12/12

시간

)

가

조절

되는

사육실

조건에서

1

주간

적응시킨

후

본

실험에

투입되었다

.

동물

실험을

위해서

난괴

법

(randomized complete block design)

에

의해

각

군당

8

마리씩

5

군으로

나누었다

: 1)

정상군

(Normal), 2)

대조군

(Control), 3) silymarin 100 mg/kg/day

투여군

(S100), 4)

백작약

100 mg/kg/ day

투여군

(PR100), 5)

백작약

200 mg/kg/day

투여군

(PR200).

실험

동물은

매일

동일한

시

간에

1

일

1

회

체중을

측정하였다

.

간

손상

유발을

위해

정상군을

제외한

나머지

군은

3

일간

TAA (200 mg/kg/day)

를

복강투여

하였으며

,

양성대조군과

백작약

열수

추출물은

TAA

유발

1

시간

30

분전에

경구

투여하였다

. 3

일의

동물

실험

후

부검을

진행하였다

. Isoflurane (Troikaa

Pharmaceuticals Ltd., Gujarat, India)

을

사용하여

흡입

마취시킨

후

복대정맥에서

채취한

혈액

을

냉장고속원심분리기

(Mega17R; Hanil Scientific Inc., Seoul, Korea)

를

이용하여

4,000 rpm,

10

분간

4°C

에서

원심

분리

후

얻은

혈청과

실험

동물에서

적출한

간

조직은

−80°C

에서

냉동

보관하였다

.

본

실험은

대구한의대학교

동물

실험

윤리위원회

(Institutional Animal Care and

Use Committee, IACUC)

의

승인

(DHU2020-083)

을

얻어

시행하였으며

동물관리

규정을

준수

(5)

혈중

암모니아

분석

혈중

암모니아

측정은

ammonia assay kit (Abcam, Cambridge, UK)

의

프로토콜에

따라

측정

하였다

.

간

손상

지표

분석

Glutamic oxaloacetic transaminase (GOT)

와

glutamic pyruvic transaminase (GPT)

는

assay kit (Asanpharm Co., Ltd, Seoul, Korea)

로

측정하였다

.

조직을

이용한

western blotting

간

조직의

세포질을

얻기

위하여

0.1 M DTT, 1.5 M sucrose, 2 mM MgCl2, pH 7.5

의

5 mM Tris-HCl, 15 mM CaCl2, pH 7.4

의

100 mM Tris-HCl, protease inhibitor cocktail

을

첨가한

buffer A

를

넣고

조직분쇄기

(BioSpec Product, Bartlesville, OK, USA)

로

분쇄한

후

아이스

위에서

30

분

간

정치시킨다

. 10% NP-40

용액을

첨가한

으로

2

분

동안

원심분리

후

세포

질을

포함하고

있는

상층액을

분리하여

보관하였다

.

핵을

얻기

위하여

10% NP-40

가

더해진

buffer A

로

2

회

세척하고

100 µL

의

buffer C (50 mM HEPES, 50 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 0.3 mM NaCl, 10% glycerol, 1 mM DTT, 0.1 mM PMSF)

를

첨가해

재부유

시킨

분마다

3

회

vortex

를

반복하였다

.

그리고

12,000 rpm

으로

10

분

4°C

에서

원심

분리한

후

핵을

포함한

상층액을

얻어

−80°C

에서

각각

냉동

보관하였다

.

간

조직

세포질의

NOX2, p47phox_{, p22}phox_{, Keap1, HO-1,} SOD, Catalase, GPx-1/2

및

β-actin

과

핵의

Nrf2

와

histone

단백질

발현을

측정하기

위하여

10 µg

의

단백질을

8–15% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel

을

이용하여

전기영동

후

단백질

을

nitrocellulose membrane

으로

이동시켰다

.

준비된

membrane

에

각각의

1

차

항체

(1:1,000)

를

처리하여

4°C

에서

overnight

시킨

로

6

분마다

5

회

세척하고

,

각각

처리된

1

차

항체에

적절한

2

차

항체

(1:3,000)

를

사용하여

상온에서

2

시

간

반응시킨

후

, PBS-T

로

6

분

간격으로

5

회

세척하였다

.

그리고

membrane

을

enhanced che-miluminescence (ECL)

용액에

충분히

노출시킨

후

, Sensi-Q2000 Chemidoc (Lugen Sci Co. Ltd,

Seoul, Korea)

에

감광시켜

단백질

발현을

확인하였다

.

해당

band

정량은

ATTO Densitograph

Software (ATTO Corporation, Tokyo, Japan)

프로그램을

사용하였으며

,

단백질

수준은

정상군

의

단백질

수준으로

나눈

후

대조군에

대한

상대적

비로

나타냈다

.

조직학적

관찰

24

시간

동안

10% neutral buffered formalin

에

고정시킨

간

조직을

graded alcohol

로

탈수시키

고

,

파라핀으로

포매하여

표본을

제작하였다

.

그리고

microtome

으로

5 µm

두께의

조직

절편

을

제작하여

hematoxylin & eosin (H&E)

으로

염색하였으며

, xylene

으로

투명화

처리

후

마운

팅시약으로

고정하여

광학현미경

(DSCHX50V; Sony, Tokyo, Japan)

을

이용하여

조직의

특이

병변

유무를

관찰하였다

.

통계분석

실험

수치는

in vitro

에서

mean ± SEM,

in vivo

에서

mean ± SD

로

나타냈다

.

각

자료의

통계적

유

의성은

SPSS (version 25.0; IBM Corp., Armonk, NY, USA)

로

one-way analysis of variance (ANOVA) test

를

실시하여

least significant difference (LSD) test

로

검증하였고

,

정상군과

대조군

,

대조군

(6)

결과

총

폴리페놀과

총

플라보노이드

함량

PR

의

총

폴리페놀과

총

플라보노이드

함량

측정

결과

,

총

폴리페놀

함량은

58.73 ± 0.25 mg

gallic acid equivalents (GAE)/g,

총

플라보노이드

함량은

9.30 ± 0.04 mg naringin equivalent (NE)/g

으로

나타났다

(Table 1).

DPPH

와

ABTS

자유

라디칼

소거

활성

DPPH

자유

라디칼

소거능을

측정한

결과

,

양성대조물질로

사용한

L-ascorbic acid

의

IC50

값은

1.92 ± 0.03 µg/mL

로

나타났고

, PR

의

IC50

값은

17.83 ± 0.16 µg/mL

로

나타났다

(Fig. 1A).

ABTS

자유

라디칼

소거능을

측정한

결과

,

양성대조물질로

사용한

L-ascorbic acid

의

IC50

값은

2.98 ± 0.26 µg/mL

로

나타났고

, PR

의

IC50

값은

24.36 ± 0.27 µg/mL

로

나타났다

(Fig. 1B).

체중변화

및

간

중량

실험기간동안

정상군은

체중증가를

보였으나

대조군은

정상군에

비해

17%

정도의

유의적인

체중감소를

보였다

(p < 0.001).

또한

S100

군

, PR100

군

및

PR200

군

(p < 0.05)

은

대조군에

비해

체중이

감소하였지만

큰

차이는

없었다

.

군간

간

중량은

정상군에

비하여

대조군에서

21%

정

도로

유의성

있게

증가하였고

(p < 0.001),

대조군

대비

PR200

군에서만

유의성

있게

감소하

였다

(p < 0.05) (Table 2).

혈중

암모니아

및

간

손상

지표

분석

혈중

암모니아

농도

(nmol/µL)

측정

결과

,

정상군에

비하여

대조군에서

약

65%

가량

유의성

있게

증가하였고

(p < 0.001),

대조군에

비하여

S100

군

(p < 0.001), PR100

군

(p < 0.001)

및

PR200

군

(p < 0.001)

모두

30%

이상으로

유의성

있게

감소하였으며

, PR200

군의

경우

정상군

의

수준까지

감소하였다

(Fig. 2A).

Table 1. Total polyphenol and total flavonoid contents of PR

Sample name Total polyphenol (mg GAE/g) Total flavonoid (mg NE/g)

PR 58.73 ± 0.25 9.30 ± 0.04

All values are expressed as mean ± SEM of 3 replications.

PR, Paeoniae Radix Alba water extract; GAE, gallic acid equivalents; NE, naringin equivalent.

L-ascorbic acid PR 100 75 50 25 0 1 Concentration (µg/mL)

A

DPPH (% of inhibition) 2.5 5 10 25 50 100 250 500 1,000 L-ascorbic acid PR 100 75 50 25 0 1 Concentration (µg/mL)

B

AB TS (% of inhibition) 2.5 5 10 25 50 100 250 500 1,000 Fig. 1. Scavenging activity (IC50) of PR on DPPH and ABTS free radical.

All values are expressed as mean ± SEM of three replications.

PR, Paeoniae Radix Alba water extract; DPPH, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl; ABTS, 2,2′-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid).

(7)

GOT

와

GPT

수치

(IU/L)

를

측정한

결과

, GOT

는

정상군에

비하여

대조군에서

2

배가량

유의성

있게

증가하였고

(p < 0.001), S100

군

(p < 0.05), PR100

군

(p < 0.05)

및

PR200

군

(p < 0.001)

모

두

17%

이상으로

유의성

있게

감소하였다

. GPT

측정

결과

,

정상군에

비하여

대조군에서

10

배

가량

유의성

있게

증가하였고

(p < 0.001), S100

군

, PR100

군

및

PR200

군

모두

50%

이상

유의

성

있게

감소하였다

(p < 0.01) (Fig. 2B and C).

간

조직의

항산화

단백질

발현

간

조직을

이용한

western blot

을

통해

항산화

조절

단백질인

Nrf2

와

Keap1

의

발현을

확인하

였다

.

그

결과

, Nrf2

는

정상군에

비하여

대조군에서

26%

정도

감소하였고

,

대조군에

비하여

S100

군

(p < 0.01), PR100

군

(p < 0.05)

및

PR200

군

(p < 0.05)

모두

46%

이상

유의성

있게

증가

하였다

(Fig. 3A).

Table 2. Effect of PR on body weight change, liver weight and LW/BW ratio (%)

Groups2) _{Liver Weight (g)} _{Body Weight (g)} _{LW/BW ratio (%)}1)

Normal 8.3 ± 0.1 238.9 ± 2.1 3.5 ± 0.1

Control 10.1 ± 0.2### _{202.9 ± 3.5}### _{5.0 ± 0.1}###

S100 9.8 ± 0.1 202.5 ± 2.5 4.8 ± 0.1

PR100 9.8 ± 0.2 200.2 ± 3.1 4.9 ± 0.1

PR200 9.5 ± 0.2* 197.4 ± 4.1 4.8 ± 0.1

All data are expressed as means ± SEM (n = 8 rat per group). PR, Paeoniae Radix Alba water extract; TAA, thioacetamide.

1)_{LW/BW ratio (%) = [liver weight gain (g/day)/body weight gain (g/day)] × 100.}

2)_{Animals were divided into 5 groups: normal rats (Normal), TAA-induced control rat (Control), TAA-induced with}

silymarin 100 mg/kg body weight rat (S100), TAA-induced with Paeoniae Radix water extract 100mg/kg body weight rat (PR100), and TAA-induced with Paeoniae Radix water extract 200 mg/kg body weight rat (PR200). Significance: ###_{p < 0.001 vs. Normal,}_*_{p < 0.05 vs. Control.}

25 20 10 5 0 Normal Control S100 PR100 PR200

A

Ammonia (nmol/µL ) *** *** *** 15 ### 75 25 0 Normal Control S100 PR100 PR200

B

GO T (IU /L ) 40 50 30 20 10 0 Normal Control S100 PR100 PR200

C

GPT (IU /L ) _** ** ** *** ** ** ### ###

Fig. 2. Levels of ammonia, GOT and GPT in serum.

Serum ammonia concentration (A), Serum GOT level (B), Serum GPT level (C). Animals were divided into 5 groups: normal rat (Normal), TAA-induced control rat (Control), TAA-induced with silymarin 100 mg/kg body weight rat (S100), induced with Paeoniae Radix water extract 100 mg/kg body weight rat (PR100), and TAA-induced with Paeoniae Radix water extract 200 mg/kg body weight rat (PR200). All data are expressed as means ± SD (n = 8 rat per group).

GOT, glutamic oxaloacetic transaminase; GPT, glutamic pyruvic transaminase; TAA, thioacetamide. Significance: ###_{p < 0.001 vs. Normal,}_**_{p < 0.01,}_***_{p < 0.001 vs. Control.}

(8)

Keap1

의

경우

,

정상군에

비하여

대조군에서

16%

가량

유의성

있게

증가하였고

(p < 0.001),

대

조군에

비하여

PR100

군은

0.5%

정도

감소하는

경향만

보인

반면

S100

군

(p < 0.001)

과

PR200

군

(p < 0.05)

에서는

유의성

있게

감소하였다

(Fig. 3B).

간

조직의

항산화

인자

발현

간

조직을

이용한

western blot

을

통해

항산화

인자인

HO-1, SOD, catalase

및

GPx-1/2

의

발현량

을

측정한

결과

, HO-1

의

경우

정상군에

비하여

대조군에서

49%

정도

유의성

있게

감소하였

고

(p < 0.001),

대조군에

비해

S100

군

(p < 0.05), PR100

군

(p < 0.01),

및

PR200

군

(p < 0.01)

모두

28%

이상으로

유의성

있게

증가하였다

(Fig. 4A). SOD

의

경우

정상군에

비하여

대조군은

30%

가량

유의성

있게

감소하였고

(p < 0.05),

대조군에

비해

PR100

군에서

27%

정도

증가하였고

, S100

군과

PR200

군에서는

40%

이상으로

유의성

있게

증가하였다

(p < 0.05) (Fig. 4B). Catalase

의

발현량은

정상군에

비하여

대조군에서

20%

가량

유의성

있게

감소하였고

(p < 0.05),

대조

군에

비하여

약물투여군에서

12%

가량

증가하였다

(Fig. 4C). GPx-1/2

의

발현량은

정상군에

비

하여

대조군에서

25%

가량

유의성

있게

감소하였고

(p < 0.05), S100

군

, PR100

군

및

PR200

군

은

대조군에

비하여

27%

이상으로

유의하게

증가하였으며

정상군의

수준까지

증가하였다

(p < 0.05) (Fig. 4D).

간

조직의

NADPH

산화효소

단백질

발현

간

조직을

이용한

western blot

을

통해

NADPH

산화효소

단백질인

NOX2, p47phox

_및

_p22phox

_의

_발

현량을

측정한

결과

, NOX2

의

경우

정상군에

비하여

대조군에서

47%

가량

유의성

있게

증가하

였고

(p < 0.001), S100

군

(p < 0.01), PR100

군

(p < 0.05)

및

PR200

군

(p < 0.05)

은

대조군에

비하

여

17%

이상으로

유의성

있게

감소하였다

(Fig. 5A). p47phox

_의

_경우

_,

_정상군에

_비하여

_대조군에

서

27%

가량

유의성

있게

증가하였고

(p < 0.01), PR100

군과

S100

군

(p < 0.05)

은

대조군에

비해

14%

정도

감소하였으며

, PR200

군

(p < 0.01)

의

경우

29%

정도로

정상군의

수준과

동일하게

감

소하였다

(Fig. 5B). p22phox

_의

_발현량은

_정상군에

_비하여

_{대조군에서}

_34%

_정도

_유의성

_있게

_증

가하였고

(p < 0.05),

대조군에

비해

S100

군은

39%

정도로

유의성

있게

감소하였으나

(p < 0.01), PR100

군과

PR200

군에서는

16%

정도로

감소하였다

(Fig. 5C). 1.6 1.2 0.8 0.4 0 Normal Control S100 PR100 PR200

A

Nrf 2 ( fol d of normal) Nrf2 Histone 1.5 1.0 0.5 0 Normal Control S100 PR100 PR200

B

Ke ap 1 ( fol d of normal) Keap1 β-actin * * _*** * ** ###

Fig. 3. Expressions of antioxidant-related proteins in liver.

Antioxidant-related proteins: Nrf2 (A) and Keap1 (B). Subjects were divided into 5 groups: normal rat (Normal), TAA-induced control rat (Control), TAA-induced with silymarin 100 mg/kg body weight rat (S100), TAA-induced with Paeoniae Radix water extract 100 mg/kg body weight rat (PR100), and TAA-induced with Paeoniae Radix water extract 200 mg/kg body weight rat (PR200). All data are expressed as means ± SD (n = 8 rat per group). Nrf2, nuclear factor erythroid 2–related factor 2; Keap1, kelch-like ECH-associated protein 1; TAA, thioacetamide. Significance: ###_{p < 0.001 vs. Normal,}_*_{p < 0.05,}_**_{p < 0.01,}_***_{p < 0.001 vs. Control.}

(9)

간

조직학적

분석

H&E

염색을

이용하여

간

조직을

광학

현미경으로

관찰한

결과

,

정상군에

비하여

대조군에서

는

TAA

에

의한

조직

내

괴사

,

비대

(hypertrophy)

와

더불어

염증세포

침윤

변화를

현저히

관찰

할

수

있었다

.

대조군에

비해

PR100

군에서는

간손상

병변과

세포

변화

정도가

감소한

모습을

관찰할

수

있었으며

, S100

군과

PR200

군에서는

PR100

군에

비해

간손상

완화가

확연히

나타

남을

확인할

수

있었다

(Fig. 6).

고찰

간은

체내

독성

물질의

해독

작용과

물질대사

과정을

담당하며

간

기능

장애나

손상으로

인

한

간질환은

생명을

위협하게

만드는

큰

요인으로

알려져

있다

[23].

간질환

발병

시

간세포

의

괴사

,

세포사멸에

의한

담즙분비

억제와

단백질

활성

수준이

낮아지면서

비타민

흡수

저

해

,

지방축적에

의한

식욕부진

,

전신

권태감

,

피로

및

독성물질

배설

기능

저하

등의

증상이

나타나게

된다

[24].

이러한

간질환의

원인은

다양하지만

병인학적

요인으로

볼

때

약물중독

및

바이러스로

인한

간질환

,

담도기능부전에

의한

간질환

및

알코올성

간질환

등으로

분류

할

수

있다

[25]. 1.2 0.8 0.4 0 Normal Control S100 PR100 PR200

A

HO -1 (fol d of normal) HO-1 β-actin 1.2 0.8 0.4 0 Normal Control S100 PR100 PR200

B

SOD ( fol d of normal) SOD β-actin ** ** * * * _# 1.2 0.8 0.4 0 Normal Control S100 PR100 PR200

C

Catalase ( fol d of normal) Catalase β-actin 1.2 0.8 0.4 0 Normal Control S100 PR100 PR200

D

Gp x-1/2 (fol d of normal) Gpx-1/2 β-actin * * * # ### #

Fig. 4. Expressions of antioxidant-related proteins in liver.

Antioxidant-related proteins: HO-1 (A), SOD (B), Catalase (C), and GPx-1/2 (D). Animals were divided into 5 groups: normal rat (Normal), TAA-induced control rat (Control), TAA-induced with silymarin 100 mg/kg body weight rat (S100), induced with Paeoniae Radix water extract 100 mg/kg body weight rat (PR100), and TAA-induced with Paeoniae Radix water extract 200 mg/kg body weight rat (PR200). All data are expressed as means ± SD (n = 8 rat per group).

HO-1, heme oxygenase-1; SOD, superoxide dismutase; GPx-1/2, glutathione peroxidase-1/2; TAA, thioacetamide. Significance: #_{p < 0.05,}###_{p < 0.001 vs. Normal,}_*_{p < 0.05,}_**_{p < 0.01 vs. Control.}

(10)

TAA

는

간독성

물질로서

만성간염

,

간경화

및

간암

등의

다양한

간질환

실험

모델을

유발하는

데

사용되고

있다

[26].

이러한

TAA

는

간

microsomal mixed-function oxidase

에

의해

생체

변환

되고

,

간

산화

효소에

의해

간독성

화합물로

활성화되어

급성

또는

만성

간손상을

유발한다고

보고되어

있다

[27,28].

이에

본

연구는

TAA

로

유발한

급성

간손상

모델에

백작약

물

추출물을

경구투여한

간보호

효과를

확인하기

위해

항산화

활성

,

혈액

내

간손상

지표

분석

,

간

조

직을

이용한

항산화

인자

,

산화적

스트레스

인자

및

조직학적

분석을

관찰하였다

.

식물의

폴리페놀계

물질

중

페놀화합물인

플라보노이드는

항균

,

항염

,

항암

및

항산화작용

등

다양한

효과를

보이며

천연

항산화제로

작용한다고

알려져

있으며

항산화능

측정에

널리

사용되고

있다

[21]. DPPH

자유

라디칼

소거능은

지방

산화를

억제하고

라디칼에

전자를

공

여하는

능력을

말하며

, ABTS

자유

라디칼

소거능은

ABTS

를

H2O2, peroxidase

와

반응시켜

활

성

양이온으로

알려진

ABTS+

_가

_형성되면

_해당

_추출물의

_항산화

_물질에

_의해

_라디칼이

_소거

되는

정도로

항산화

활성을

확인할

수

있는

것으로

알려져

있다

[29].

백작약

열수

추출물의

항산화능을

확인하기

위해

총

폴리페놀

,

총

플라보노이드

함량

, DPPH

자유

라디칼

소거능

및

ABTS

자유

라디칼

소거능의

IC50

값을

분석한

결과

,

백작약

열수

추출물은

높은

항산화능을

나타냈다

.

따라서

이러한

결과를

미루어

볼

때

백작약

열수

추출물은

간손상으로

인해

증가

된

산화적

스트레스를

감소시켜

간

보호

효과를

나타낼

것이라

판단된다

. 1.6 0.8 0.4 0 Normal Control S100 PR100 PR200

A

N OX 2 ( fol d of normal) NOX2 β-actin * * ** 1.2 ### 1.6 0.8 0.4 0 Normal Control S100 PR100 PR200

B

p47 pho x (fol d of normal) p47phox β-actin 1.6 1.2 1.2 0.8 0.4 0 Normal Control S100 PR100 PR200

C

p22 pho x (fol d of normal) p22phox β-actin ** ** * # ##

Fig. 5. Expressions of NADPH oxidase proteins in liver.

NADPH oxidase proteins: NOX2 (A), p47phox_{(B), and p22}phox_{(C). Animals were divided into 5 groups: normal rat}

(Normal), induced control rat (Control), induced with silymarin 100 mg/kg body weight rat (S100), TAA-induced with Paeoniae Radix water extract 100 mg/kg body weight rat (PR100), and TAA-TAA-induced with Paeoniae Radix water extract 200 mg/kg body weight rat (PR200). All data are expressed as means ± SD (n = 8 rat per group).

NOX2, nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 2; TAA, thioacetamide. Significance: #_{p < 0.05,}##_{p < 0.01,}###_{p < 0.001 vs. Normal,}_*_{p < 0.05,}_**_{p < 0.01 vs. Control.}

(11)

건강한

사람의

경우

,

암모니아는

순환

요소와

구연산을

사용하여

간에서

글루타민과

요소로

전환되어

전신

순환으로

들어가는

것을

방지하는

것으로

알려져

있다

.

간

기능

장애로

인해

혈중

암모니아

수치가

증가하고

혈액이

간

주위로

전환되게

되면

[30],

산화적

스트레스를

일

으키고

다양한

합병증과

간질환을

유발하게

된다

[31].

간

손상

지표

분석으로

이용한

GOT

와

GPT

는

아미노산을

형성하는

효소로

약물과

과도한

스트레스

등으로

인한

간세포의

손상이

나

사멸에

따라

혈중으로

배출되는

수치가

증가한다고

알려져

있다

[32].

따라서

암모니아의

혈중

농도

증가는

간

기능의

손상을

의미한다고

볼

수

있다

[33].

이에

본

연구에서

혈중

암모

니아

수치와

간

손상

지표인

GOT, GPT

수치를

확인하였으며

,

백작약

열수

추출물의

투여가

암모니아

, GOT

및

GPT

농도를

유의적으로

감소시킨

것을

확인하였다

. Nrf2

와

Nrf2

의

주요

조절

역할을

하는

Keap1

는

인체

내

항산화

시스템을

조절하는

단백질로

존재한다

.

세포질에서

Nrf2-Keap1

의

단백질

-

단백질

상호작용

(protein-protein interaction,

PPI)

역할로

존재하다가

세포

독성제나

산화적

스트레스로

인해

Keap1

이

비활성화되면

Nrf2

가

방출되어

핵

내로

진입하게

된다

.

이후

Nrf2

는

HO-1, SOD, catalase

및

GPx-1/2

등의

항산화

효소를

활성화시켜

산화

손상으로부터

세포를

보호하는

것으로

알려져

있다

[34,35].

이에

본

연구에서

항산화

단백질의

발현을

측정하였으며

백작약

열수

추출물의

투여로

인해

Nrf2,

HO-1, GPx-1/2, SOD

및

catalase

의

증가를

확인하였다

.

따라서

백작약

열수

추출물은

항산화

단백질을

활성화시켜

산화적

스트레스로

인한

세포

손상을

보호할

것으로

판단된다

. 100 µm 100 µm 100 µm 100 µm 100 µm Normal Control S100 PR100 PR200

Fig. 6. Histopathological analysis.

Liver tissues were stained with H&E (original magnification ×200, bar = 100 µm). Inflammation cellular infiltration (red arrows), hypertrophy in liver tissue (black arrows) and hepatocyte necrosis in liver tissue (blue arrows) in liver tissue (stick arrows). Subjects were divided into 5 groups: normal rat (Normal), TAA-induced control rat (Control), TAA-induced with silymarin 100 mg/kg body weight rat (S100), TAA-induced with Paeoniae Radix water extract 100 mg/kg body weight rat (PR100), and TAA-induced with Paeoniae Radix water extract 200mg/kg body weight rat (PR200).

(12)

NOX

는

세포질과

원형질막에서

발견되며

성장

,

혈관

신생

및

세포

사멸과

신호

전달

의

매개체로서

ROS

를

생성하는

기능을

주요

담당한다

.

또한

간에서

NOX

체계로

인해

발생하

는

산화적

스트레스는

간염

,

담즙

정체

간손상

및

알코올성

간질환

등의

간질환에

중요한

역

할을

한다

[36]. NOX

중

NOX2

는

산화적

스트레스로

발생한

ROS

의

대사산물인

H2O2

를

생성

하며

, p47phox_{, p22}phox

_와

_같은

_여러

_필수

_{구성요소를}

_포함하고

_있는데

_이

_효소들

_또한

_ROS

_생성

에

관여한다고

알려져

있다

[37].

본

실험에서

백작약

열수

추출물의

투여와

산화적

스트레스

억제의

확인하기

위하여

NOX2, p47phox

_및

_p22phox

_의

_발현을

_{측정하였으며}

_억제

_효과

를

확인하였다

.

이러한

결과로

백작약

열수

추출물이

TAA

유발로

인한

산화적

손상을

감소시

킴으로써

손상된

간

기능에

보호효과를

나타낼

것으로

판단된다

. TAA

에

의한

간세포

손상을

조직학적으로

분석한

결과

,

정상군에서의

간세포와는

달리

TAA

로

유발한

동물의

간

조직에서는

간세포의

괴사

,

비대

및

염증세포

침윤

정도가

다량

관찰되

었으나

백작약

물

추출물을

투여한

군의

경우

염증성

병변을

현저하게

감소시켰음을

확인할

수

있었다

.

기존

연구에서

백작약

열수

추출물의

간보호

효능은

in vitro

세포

실험

,

혈액

내

간

지표

분석

및

항산화

인자

분석으로

확인되었으나

항산화능으로

인한

산화적

스트레스

인자들의

억제에

관해선

연구가

이루어지지

않았다

.

따라서

본

연구에서는

기존

연구의

분석에

추가적

으로

in vitro

항산화

효능

,

혈액

내

암모니아

측정

및

웨스턴을

통한

산화적

스트레스

인

자를

분석하였으며

,

이러한

결과로

백작약

열수

추출물이

산화적

스트레스로

인한

간손상을

억제할

수

있음을

제시하였고

,

향후

간섬유화

,

간경변증

및

간암과

같은

간질환에

관한

추가

연구에서

백작약

물

추출물이

효과적으로

활용될

수

있을

것으로

사료되며

,

또한

간

보호제

와

천연

항산화제로서의

개발을

기대해

볼

수

있을

것이다

.

요약

본

연구는

백작약

열수

추출물의

in vitro

항산화능을

평가하였으며

, TAA

를

유발한

급성

간손

상

동물

모델을

이용하여

항산화

활성으로

인한

산화적

스트레스

억제

효과와

간

기능

보호

효과

여부를

검증하였다

.

총

폴리페놀

,

총

플라보노이드

함량

, DPPH

및

ABTS

자유

라디칼

소

거능

측정

결과

높은

항산화능을

나타냈으며

,

체중

,

간무게

및

간중량

비율

(%)

이

대조군에

비해

S100

군과

PR100

군보다

PR200

군에서

더욱

감소하였다

.

약물투여군의

혈중

암모니아

,

GOT

및

GPT

수준의

유의적인

감소를

확인하였으며

, western blot

실시

후

대부분의

인자에서

유의적인

차이를

확인하였다

.

이

결과를

토대로

백작약

열수

추출물이

Nrf2-Keap1

경로의

활

성화를

통해

항산화

효소를

증가시켰으며

,

항산화능을

통한

산화적

스트레스

개선에

긍정적

인

효과가

있음을

확인할

수

있었다

.

따라서

백작약

열수

추출물은

급성

간손상시

간보호

효

과를

위한

후보

소재로서

가능성이

있다고

판단된다

.

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