Effects of Keonbodan (健步丹) on MIA-Induced Osteoarthritis in Rat

健步丹이 MIA로 유도된 골관절염 Rat에 미치는 영향

이은정⋅오민석

대전대학교 한의과대학 한방재활의학과교실

Effects of Keonbodan (健步丹) on MIA-Induced Osteoarthritis in Rat

Eun-Jung Lee, O.M.D., Min-Seok Oh, O.M.D.

Department of Korean Rehabilitation Medicine, College of Oriental Medicine, Dae-Jeon University

RECEIVED December 19, 2013 REVISED February 17, 2014 ACCEPTED April 1, 2014

CORRESPONDING TO

Min-Seok Oh, Department of Korean Rehabilitation Medicine, College of Oriental Medicine, Dae-Jeon University, 75, Daedeok-daero, 176beon-gil, Seo-gu, Daejeon 302-869, Korea

TEL (042) 470-9424 FAX (042) 470-9005 E-mail [email protected]

Copyright © 2014 The Society of Korean Medicine Rehabilitation

Objectives This study was carried out to know the effects of Keonbodan (hereinafter re- ferred to KBD) in osteoarthritis induced by Monosodium iodoacetate(hereinafter referred to MIA) on Wistar rat.

Methods Osteoarthritis was induced by injection of MIA into left knee joint cavities of rat.

Osteoarthritis rats were divided into 4 groups (normal (n=6), control (n=6), indomethacin (n=6), KBD (n=6) group). The control group was administered normal saline and in- domethacin group was administered indomethacin (2 mg/kg). And the KBD group was ad- ministered KBD (142 mg/kg). Each groups were administered by orally for 4 weeks. This experiment were carried out in vivo. In vivo, at the end of the experiment (5 weeks after MIA injection), effects on hepatotoxicity and nephrotoxicity, cytokines in serum, arachidonic acid, osteocalcin, MMP-9, TIMP-1 and cartilage volume were evaluated. And histopatho- logical examinations on the articular structures of knee joints were performed.

Results 1. In weight-bearing measurement, level of weight was increased. 2. In order to hepatotoxicity and nephrotoxicity, ALT, AST, BUN and creatinine were tested. And there were no significant changes. 3. In serum, levels of TNF-α, IL-1β were significantly decreased. IL-6 was insignificantly decreased. 4. In serum, level of MMP-9 and TIMP-1 was decreased. 5. In serum, level of LTB

, PGE

and osteocalcin was decreased. 6. In μCT-ar- thrography, the cartilage volume was greater than that of the control group. 7. The joint damage induced by osteoarthritis was lesser than the control group in histopathologic ob- servation (H&E, Safranin-O staining).

Conclusions These results demonstrated that KBD suppressed the osteoarthritis- in- ducing effects of MIA in rat. And further studies are required to find out more effective sub- stance and anti-osteoarthritic mechanism in the future. (J Korean Med Rehab 2014;

24(2):51-64)

Key words Keonbodan (KBD), Osteoarthritis, Monosodium iodoacetate (MIA), Inflam- matory cytokine, MMP-9, TIMP-1

서론»»»

골관절염은 연골세포 대사의 변화와 부하되는 물리적 압력의 증가 등의 원인으로 관절 연골의 미란, 연골하 골 의 경화, 관절 주위 골의 과잉 형성, 관절의 변형 등을 특

징으로 하는 퇴행성 관절 질환이다¹⁾.

痺證의 범주에 속하는 골관절염은 營衛失調, 腠理空疎, 正氣虛弱시 風寒濕熱의 邪氣가 체내에 침입하여 관절에 응체됨으로써 발생한다. 특히 만성적인 골관절염인 경우 虛寒한 경우가 많으므로 養氣血, 補肝腎을 위주로 溫補하

Herb name Pharmacognostic nomenclatures Amount (g) 鹿角膠

狗脊 杜冲 牛膝 天麻 草烏 川烏 甘草 乳香 沒藥 續斷 萆薢 枸杞子 補骨脂 陳皮 黃芪 木瓜 威靈仙 香附子 蒼朮 麥芽 鹿角 Total amount

Cervi Cornus Colla Cibotii Rhizoma Eucommiae Cortex

Achyranthis Bidentatae Radix Gastrodiae Rhizoma

Aconiti Ciliare Tuber Aconiti Radix Glycyrrhizae Radix Olibanum Myrrha Dipsaci Radix

Dioscoreae Tokoro Rhizoma Lycii Fructus

Psoraleae Fructus Citri Pericarpium Astragali Radix Chaenomelis Furctus Clematidis Radix Cyperi Rhizoma Atractylodis Rhizoma Hordei Germinatus Fructus Cervi Cornu

8 8 10 14 12 8 8 6 2.4 2.4 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 150.8 Table I. The Compositions of Keonbodan (KBD)

법으로 치료해야 한다²⁾.

健步丹은 溫甘의 性味가 있으며 補血益精하는 鹿角膠 로 君藥을 삼고, 補肝腎, 强筋骨, 利關節하는 狗脊, 杜冲, 補骨脂, 牛膝, 續斷, 鹿角, 枸杞子와 골소실 및 肢體痲木 을 치료하는 天麻, 補中益氣하는 黃芪를 溫補하는 효력을 돕는 臣藥으로 하였다. 活血行氣하는 乳香, 沒藥과 祛風 除濕 溫經止痛하는 草烏, 川烏頭, 威靈仙으로 관절의 風 寒濕 동통을 치료하고, 木瓜로 舒筋活絡하여 筋脈拘攣한 것을 다스리며, 陳皮, 香附子로 理氣 燥濕 解鬱하고, 萆 薢와 蒼朮로 祛風濕하여 風濕痺痛을 다스리고자 하였는 데 이들을 溫散溫通하는 佐藥으로 삼았으며, 和中하는 麥 芽와 調和諸藥하는 甘草를 使藥으로 하였다³⁾. 이와 같은 구성으로 健步丹은 正氣를 補하면서 祛寒濕 散風邪 溫經 止痛하여 골관절염에 유효한 효과가 있을 것으로 생각했 다.

이에 저자는 健步丹이 골관절염에 미치는 영향을 실험 적으로 규명하고자 monosodium iodoacetate (MIA)로 유 발된 골관절염 rat 모델에서 간과 신장 독성검사, 뒷다리 체중부하 검사, 혈청 내 염증 cytokine과 매개인자 측정 및 연골의 병리조직학적 관찰 등을 시행한 결과 유의한 성적을 얻었기에 보고하는 바이다.

재료 및 방법»»»

1. 재료

1) 약재

본 실험에 사용한 健步丹(Keonbodan 이하 KBD)의 구 성 약재들은 혜화약업사를 통해 구입하여 정선한 후 사용 하였고 그 내용과 1첩당 분량은 다음과 같다(Table I).

처방 구성 중 草烏와 川烏頭는 독성을 제거하기 위해 修治과정을 거쳤다. 草烏는 약재의 乾心이 없어질 때까지 물에 담갔다가 草烏 80 g당 명태 4마리를 함께 약재의 白 心이 없어지고 아린 맛이 없어질 때까지 끓인 후 건조시 켜 사용하였다. 川烏頭는 찬물에 담가 하루에 2~3회 물을 갈아주고 맛을 보아 혀의 마비감이 적어지면 꺼내어 약재 보다 1.5배 많은 鼠目太와 물을 붓고 川烏頭의 白心이 없 어질 때까지 삶아서 쪼개 햇볕에 건조시켜 사용하였다.

또한, 녹각교 8 g을 얻기 위해 녹각 40 g을 3일간 졸여 교질의 형태로 만들어 사용하였다.

2) 동물

수컷 6 주령의 Wistar rat (170~200 g) (오리엔트바이 오, 성남, 한국)을 사용하였고, 동물은 실험 당일까지 고 형사료(5L79, 오리엔트바이오, 성남, 한국)와 물을 충분히 공급하고, 온도 22±2^oC, 습도 55±15%, 12시간 light- dark cycle의 환경에서 1주간 적응시킨 후 실험에 사용하 였다. 본 연구는 대전대학교 동물실험윤리위원회의 승인 을 받아 동물윤리준칙에 의거하여 진행되었다(승인번호 : DJUARB2012-011).

3) 시약

본 실험에 사용된 시약은 Rat Total MMP-9 (matrix metalloproteinase-9) kit, LTB4 (leukotriene B4) kit, Rat TIMP-1 (tissue inhibitor of metalloproteinases-1) kit, Rat IL-6 (interleukin-6) kit, Rat TNF-α(tumor necrosis factor-α) kit, PGE2 (prostaglandin E2) kit, Rat IL-1β (interleukin-1β) kit은 R&D System Co. (Minneapolis, USA)에서, 주정 추출에 이용된 주정은 (주)대한주정판매

(전주, 한국)에서 구입하였다. 양성대조군에는 Indome- thacin (Sigma - Aldrich Co., USA), 골관절염 유발 주사 제로는 Monosodium iodoacetate (MIA) (Cat. No. I2512, Sigma. Chemical Co. Ltd, USA), 마취제로는 Zoletil (Virbae Co., France), Rompun (바이엘코리아, 서울, 한 국)을 사용하였다. Hematoxylin and Eosin 염색과 Safranin- O 염색에는 Hematoxylin (Merck Co., Germany), Eosin Y (Wako Co., Japan), Safranin-O (Merck Co., Germany) 를 사용하였다.

4) 기기

본 실험에 사용된 기기는 Rotary vacuum evaporator (EYELA, Japan), Freeze dryer (일신, 한국), ELISA read- er (Molecular Devices, USA), Flow cytometry system (BD Biosciences Immunocytometry Systems, USA), Incapacitance Meter Tester (IITC Life Science, cal- ifornia, USA), BD Ultra-Fine ll (Becton, Dickinson and Company, USA), Light Microscope (Carl ZEISS AXIO- SKOP-40, Germany), Micro-CT arthrography (SKYSCAN, Optoscan, Belgium)를 이용하였다.

2. 방법

1) 시료 추출

丸으로 제조된 KBD 100 g을 분말한 후 500 ml의 70%

주정에 24시간 환류 추출 후 여과한 뒤, 그 여액을 rotary evaporator를 이용하여 50 ml로 감압, 추출, 동결건조한 후 최종 20.3 g의 고형분을 얻어 사용하였다. 따라서 본 연구에서 사용된 최종 약물의 취득 수율은 20.3% (ｍ/

ｖ)이다. 동물 투여를 위해서는 농도에 맞게(142 mg/kg) 물에 녹여 사용하였다.

2) 관절염 유발

Zoletil (Virbae Co., France) 0.5 ml과 Rompun (BAYER Co., Korea) 0.1 ml로 rat을 마취시킨 후 왼쪽 무릎 주변을 깨끗이 제모하고 골관절염 유발물질인 MIA (Cat. No. I2512, Sigma. Chemical Co. Ltd, USA)를 31G 의 1 ml Insulin Syringe (0.25 mm×8 mm, BD Medical- Diabetes Care, USA)를 사용하여 왼쪽 무릎 관절강 내에 50μl (60 mg/ml)씩 투여하였다. MIA 희석 시에는 0.9%

Saline을 사용하였다. MIA 투여 7일 후에 micro-CT ar- thrography로 관절염 유발 유무를 확인하여 관절염이 유 발된 동물만을 선별하여 실험에 사용하였다.

3) 실험군의 분류

MIA 투여 7일 후에 관절염 유발 유무를 확인하여 관절 염이 유발된 동물만을 대조군, 양성대조군(Indomethacin 투여군), 실험군(KBD 투여군)으로 나누었으며 MIA를 투 여하지 않은 정상군을 포함한 각 군당 rat은 6마리씩으로 하였다.

약물투여는 Wistar rats에 MIA를 주사하여 골관절염을 유발시킨 후 7일이 경과된 이후부터 1일 1회 매일 오전 10시에 대조군에는 생리식염수 2 mg/kg을, 양성대조군에 는 Indomethacin 2 mg/kg을, KBD 투여군에는 KBD 142 mg/kg을 4주 동안 경구투여 하였다.

KBD 투여량 결정은 1일 60 kg 성인이 健步丹 40환을 2회 먹었을 때의 양(8.52 g)을 기준으로 생쥐 300 g을 계 산했을 때 kg당 142 mg 농도로 2 ml씩 투여하였으며 모 든 군에서 자유 음수와 식이를 실시하였다.

4) 뒷다리 체중부하 측정

MIA를 주입한 7일 후부터 약물을 투여한 4주 동안 1주 2회 오전 10시에 관절염이 발현된 뒷다리의 체중부하 비 율을 Incapacitance Meter Tester로 측정하였다. 플라스틱 방을 60도 각도의 기울기로 세운 후 각 뒷다리에 가해진 세기를 10초에 걸쳐서 평균을 산출하였다. 처치된 동측의 뒷다리에 분포된 체중의 백분율은 다음과 같은 방정식을 이용하여 계산하였다.

백분율(%)=( 유발된 하지의 무게

)×100 정상 하지의 무게

5) 혈액분석(Hematology)

최종 실험 종료 후 튜브형 주사기를 이용하여 심장에 서 채혈하였다. 전혈을 바이오톡스텍(주)(청주, 한국)에 의뢰하여 AST, ALT, BUN, Creatinine을 측정하였다.

6) 혈청 내 염증 cytokine 및 염증 매개 인자 측정 최종 실험 종료 후 혈액을 채취하여 혈청을 분리한 뒤, 염증성 지표로서 TNF-α, IL-1β, IL-6 등을 측정하고,

Fig. 1. Image of cartilage degener- ation using Micro-CT arthro-graphy in joint tissue of MIA-induced os- teoarthritis rats.

Prostaglandin E2 (PGE2), Leukotriene B4 (LTB4), Matrix metalloprotease-9 (MMP-9), Tissue inhibitor of metal- loprotease-1 (TIMP-1), Osteocalcin 등의 염증성 매개인 자들을 ELISA assay kit를 이용하여 측정하였다.

7) 연골량 측정

조영제인 Hexabrics 320 (Guerbet Co., France)을 왼 쪽 무릎에 주입하고, Micro-CT arthrography를 사용하여 cartilage volume을 아래 그림과 같이 측정하여 무릎관절 연골의 파괴 정도를 분석하였다(Fig. 1)⁴⁾.

8) 병리조직학적 검사

Micro-CT arthrography 촬영이 끝난 후 무릎 부위를 절단하여 10% EDTA가 포함된 10% 포르말린 용액에 넣 어 관절 조직을 탈칼슘화(decalcification)시켰다. 방사선 촬영기법(radiographic technique)을 이용하여 탈칼슘화 유무를 확인한 후 파라핀 왁스에 관절 조직을 넣고 고정 한 다음 관상절단(coronal section)을 실시하였다. 탈칼슘 화 과정을 거쳐 파라핀으로 고정된 조직을 7 μm의 크기 로 자른 뒤, Hematoxylin and Eosin (H&E) 및 Safranin-O 염색을 실시하여 조직의 상태를 관찰하였다. 조직은 Light Microscope를 이용하여 1×100의 배율로 관찰하였 다. 염증 반응 발생 유무나 활막 세포의 증식, 염증세포 의 조직 침윤 여부는 H&E 염색 결과에서 확인하였으며, proteoglycan 층을 염색하는 Safranin-O 염색 결과에서는 연골 조직의 손상 여부를 확인하였다.

3. 통계처리

실험결과는 SPSS ver. 11.0 for Windows를 사용하여 통계처리하였다. 통계적 유의성은 unpaired student's t-test를 이용하였고 p-value가 0.05 미만인 것을 유의하 다고 판정하였다. 모든 값은 평균(mean)±표준편차 (standard deviation)로 표기하였다.

결과»»»

1. 뒷다리 체중부하에 미치는 영향

뒷다리 체중 부하 측정 결과, 대조군을 100±11.2%로 나타냈을 때, KBD 투여군은 128.6±9.7%, 양성대조군은 164.1±4.7%로 나타나 대조군에 비해 모두 유의성(p

＜0.05) 있는 증가가 나타났다(Fig. 2).

2. 간 기능에 미치는 영향

혈청 ALT는 정상군이 32.0±1.7, 대조군이 33.7±1.2, 양성대조군 37.7±4.2, KBD 투여군이 41.0±2.6 (U/L)로 나타났고 AST는 정상군이 130.0±8.7, 대조군이 162.7±

7.1, 양성대조군 160.0±15.1, KBD 투여군은 178.0±

35.7 (U/L)로 나타나 대조군에 비해 KBD 투여군과 양성 대조군 모두 유의한 차이를 보이지 않았다(Fig. 3).

Fig. 2. Effects of KBD on weight changes in the hind legs of MIA-induced osteoarthritis rats.

Normal: Normal wister rat group, Control: MIA-induced osteo- arthritis rat group, Indomethacin: MIA-induced osteoarthritis rat group treated with Indomethacin (2 mg/kg), KBD: MIA-in- duced osteoarthritis rat group treated with KBD (142 mg/kg) Values represent the means±S.D.

Statistically significant value compared with control by t-test (*p

＜0.05,

p＜0.01).

Fig. 3. Effect of KBD on the ALT and AST in MIA-induced os- teoarthritis rats.

Normal: Normal wister rat group, Control: MIA-induced osteo- arthritis rat group, Indomethacin: MIA-induced osteoarthritis rat group treated with Indomethacin (2 mg/kg), KBD: MIA-in- duced osteoarthritis rat group treated with KBD (142 mg/kg).

Values represent the means±S.D.

A B

Fig. 4. Effect of KBD on the BUN and creatinine in MIA-induced osteoarthritis rats.

Normal: Normal wister rat group, Control: MIA-induced osteoarthritis rat group, Indomethacin: MIA-induced osteoarthritis rat group treated with Indomethacin (2 mg/kg), KBD: MIA-induced osteoarthritis rat group treated with KBD (142 mg/kg).

Values represent the means±S.D.

3. 신장 기능에 미치는 영향

혈청 중의 BUN 농도는 정상군 15.30±0.89, 대조군 18.10±1.45, KBD 투여군은 16.80±1.01 (mg/dl)로 나타 났고, creatinine 농도는 정상군이 0.530±0.020, 대조군 0.547±0.015, 양성대조군 0.583±0.012, KBD 투여군은 0.593±0.025 (mg/dl)로 나타나 대조군에 비해 KBD 투여 군, 양성대조군 모두 유의한 차이를 보이지 않았다(Fig. 4).

4. 혈청 내 염증 cytokine 생성에 미치는 영향

1) TNF-α 생성량

혈청 내의 TNF-α 생성량은 대조군을 100.0±10.2%로 나타냈을 때, 양성대조군은 85.0±9.0%, KBD 투여군은 83.8±7.4%로 모두 대조군에 비해 유의성(p＜0.05) 있는 감소가 나타났다(Fig. 5A).

A B

C

Fig. 5. Effects of KBD on levels of TNF-α (A), IL-1β (B) and IL-6 (C) in the serum of MIA-induced osteoarthritis rats.

Normal: Normal wister rat group, Control: MIA-induced osteo- arthritis rat group, Indomethacin: MIA-induced osteoarthritis rat group treated with Indomethacin (2 mg/kg), KBD: MIA-in- duced osteoarthritis rat group treated with KBD (142 mg/kg).

Values represent the means±S.D.

Statistically significant value compared with control by t-test (*p

＜0.05,

＜0.01,

＜0.001).

A B

Fig. 6. Effects of KBD on levels of MMP-9 (A) and TIMP-1 (B) in the serum of MIA-induced osteoarthritis rats.

Normal: Normal wister rat group, Control: MIA-induced osteoarthritis rat group, Indomethacin: MIA-induced osteoarthritis rat group treated with Indomethacin (2 mg/kg), KBD: MIA-induced osteoarthritis rat group treated with KBD (142 mg/kg).

Values represent the means±S.D.

Statistically significant value compared with control by t-test (

p＜0.001).

2) IL-1β 생성량

혈청 내의 IL-1β 생성량은 대조군을 100.0±1.3%로 나타냈을 때, 양성대조군 80.2±4.1%, KBD 투여군은

87.8±5.3%로 모두 대조군에 비해 유의성(p＜0.01) 있는 감소가 나타났다(Fig. 5B).

A B

Fig. 7. Effects of KBD on levels of Prostaglandin E2 (A) and LTB4 (B) in the serum of MIA-induced osteoarthritis rats.

Normal: Normal wister rat group, Control: MIA-induced osteoarthritis rat group, Indomethacin: MIA-induced osteoarthritis rat group treated with Indomethacin (2 mg/kg), KBD: MIA-induced osteoarthritis rat group treated with KBD (142 mg/kg).

Values represent the means±S.D.

Statistically significant value compared with control by t-test (*p＜0.05,

p＜0.01,

p＜0.001).

Fig. 8. Effects of KBD on levels of osteocalcin in the serum of MIA-induced osteoarthritis rats.

Normal: Normal wister rat group, Control: MIA-induced osteo- arthritis rat group, Indomethacin: MIA-induced osteoarthritis rat group treated with Indomethacin (2 mg/kg), KBD: MIA-in- duced osteoarthritis rat group treated with KBD (142 mg/kg).

Values represent the means±S.D.

Statistically significant value compared with control by t-test (*p

＜0.05,

p＜0.001).

3) IL-6 생성량

혈청 내의 IL-6 생성량은 대조군을 100.0±15.0%로 나 타냈을 때, KBD 투여군은 85.8±16.5%로 대조군에 비해 감소하였으나 유의하지는 않았으며, 양성대조군은 78.5±

11.1%로 대조군과 비교하여 유의한 감소를 보였다(Fig.

5C).

5. 단백분해효소 생성에 미치는 영향

1) MMP-9 생성량

혈청 내의 MMP-9 생성량은 대조군을 100.0±1.8%로 나타냈을 때, 양성대조군은 64.6±1.0%, KBD 투여군은 69.0±4.8%로 모두 대조군에 비해 유의성(p＜0.001) 있 는 감소가 나타났다(Fig. 6A).

2) TIMP-1 생성량

혈청 내의 TIMP-1 생성량은 대조군을 100.0±1.6%로 나타냈을 때, 양성대조군은 72.0±4.2%, KBD 투여군은 77.3±6.0%로 모두 유의성(p＜0.001) 있는 감소가 나타 났다(Fig. 6B).

6. Arachidonic acid 대사 작용에 미치는 영향

1) Prostaglandin E2 생성량

혈청 내의 Prostaglandin E2 생성량은 대조군을 100.0±

13.2%로 나타냈을 때, 양성대조군이 42.2±9.5%, KBD 투여군은 59.7±30.0%로 대조군에 비해 모두 유의성(p

＜0.05) 있는 감소가 나타났다(Fig. 7A).

2) LTB4 생성량

혈청 내의 LTB4 생성량은 대조군을 100.0±12.3%로 나타냈을 때, 양성대조군은 69.8±6.5%, KBD 투여군은 71.1±6.6%로 대조군에 비해 모두 유의성(p＜0.01) 있는 감소가 나타났다(Fig. 7B).

A B

Fig. 10. Effects of KBD on joint pathology Hematoxylin & Eosin staining (A) and Safranin-O staining (B) from joint tissue of MIA-in- duced osteoarthritis rats (×100).

Normal: Normal wister rat group, Control: MIA-induced osteoarthritis rat group, Indomethacin: MIA-induced osteoarthritis rat group treated with Indomethacin (2 mg/kg), KBD: MIA-induced osteoarthritis rat group treated with KBD (142 mg/kg), → : synovial mem- brane, □: cartilage.

A B

Fig. 9. Effects of KBD on cartilage volume using micro CT-arthrography in the joint tissue of MIA-induced osteoarthritis rats.

Normal: Normal wister rat group, Control: MIA-induced osteoarthritis rat group, Indomethacin: MIA-induced osteoarthritis rat group treated with Indomethacin (2 mg/kg), KBD: MIA-induced osteoarthritis rat group treated with KBD (142 mg/kg).

7. Osteocalcin 생성에 미치는 영향

혈청 내 Osteocalcin 생성량은 대조군을 100.0±8.5%

로 나타냈을 때, 양성대조군 60.1±4.1%, KBD 투여군은 80.9±6.3%로 대조군에 비해 모두 유의성(p＜0.05) 있는 감소가 나타났다(Fig. 8).

8. 연골량에 미치는 영향

실험종료 후 조영제인 헥사브릭스를 왼쪽 무릎에 주사 후 Micro-CT arthrograpy를 사용하여 무릎관절의 연골량 (cartilage volume)을 측정 및 분석하였다. 연골량이 정상 군 4.64 mm³, 대조군 1.15 mm³, 양성대조군이 3.70 mm³, KBD 투여군 4.41 mm³로 나타나 대조군에 비해 KBD 투 여군에서 보존된 연골량이 크게 나타났다(Fig. 9).

9. 병리조직학적 변화

1) Hematoxylin & Eosin 염색

조직 염색 후 Microscope를 이용하여 1×100의 배율로 관찰한 결과 정상군의 관절은 반월판의 섬유연골, 관절낭 의 활막 조직이 정상적인 상태를 유지하고 있었다. 반면, 대조군은 관절 주변 활막 세포의 과다 침투가 일어났으 며, 연골과 뼈의 침윤으로 연골하 골 조직이 노출되어 있 거나 연골세포의 윤곽이 사라지고 joint architecture의 손 실이 일어난 것으로 나타났다.

KBD 투여군에서는 변성 괴사된 관절연골의 범위가 감 소되어 있었고, 연골층의 탈락으로 인한 연골하 골 조직 의 노출 및 연골하 골 조직 주위의 섬유화 소견과 활막 세포의 증식으로 인한 활막 비후 정도가 상대적으로 감소 되어 있었다(Fig. 10A).

2) Safranin-O 염색

조직 염색후 Microscope를 이용하여 1×100의 배율로 관찰한 결과 정상군의 관절은 연골조직이 정상적으로 위 치하였다. 대조군은 MIA에 의해 관절 주변에 염증세포의 침투가 일어나고 연골 파괴가 나타나 붉게 염색된 pro- teoglycan 정상조직이 거의 사라진 것을 관찰할 수 있었 다. KBD 투여군은 관절면에 대조군에서 관찰된 연골과 뼈의 침윤이 거의 사라졌고, Safranin-O 염색에서 붉게 염 색된 proteoglycan 조직이 활막 주변에 많이 분포하는 것 으로 나타나 연골의 파괴 정도가 대조군에 비해 적음을 알 수 있었다(Fig. 10B).

고찰»»»

골관절염은 선진국에서 장애를 유발하는 가장 흔한 10 개 질환 중 하나이며, 세계적으로 60세 이상 남성의 9.6%, 여성의 18.0%가 골관절염의 증후를 나타내는 것으 로 추산된다⁵⁾. 국내의 통계청 조사에 따르면 50세 이상에 서 골관절염으로 진단받은 경험이 있는 경우가 2008년에 109,299명에서 2011년에 119,695명으로 매년 증가하고 있는 추세이다. 진료비 또한 증가하여 국내에서 무릎관절 증을 치료받는데 쓰인 진료비는 2007년 4,927억여 원에 서 2009년에는 7,782억여 원에 달하고 있다⁶⁾.

골관절염에 이환되면 손상된 연골세포에서 TNF-α, IL-1, IL-6과 같은 염증관련 cytokine이 과다 발현되고 이 로 인해 matrix metalloproteinase (이하, MMPs), oxygen radical 등과 같은 연골 기질 파괴 인자들이 증가되어 proteoglycan, type II collagen의 농도가 감소하면서 연 골세포사멸이 발생하게 된다⁷⁾. 연골의 기본구조가 파괴되 고 연골하 골에서는 뼈의 소실과 재형성이 진행되면서 관 절 강직감과 점진적인 운동장애를 보이며, prostaglandin E2와 같은 arachidonic acid 대사물질 생성이 증가되어 관 절부위 통증, 종창, 발열 등의 증상을 보이게 된다⁸⁾.

골관절염의 치료방법에는 염증감소와 통증억제를 위한 약물요법과 관절강내 스테로이드 제제를 주입하는 등의 주사요법, 외과적인 관절성형술, 관절경 미세천공술, 인공 슬관절 전치환술과 같은 수술요법이 있다⁹⁾. 그러나, 비스 테로이드성 소염제는 위장관 독성과 신장 기능 저하 등의 부작용이 있고^10,11), 고혈압, 울혈성 심부전, 신장 부작용 등을 유발할 수 있으며, glucosamino glycan 합성율을 오 히려 감소시켜 관절염의 진행을 가속시킨다는 보고가 있 다¹²⁾. 또한 관절강 내 스테로이드 주사는 효과가 한시적 이고 장기간 사용시 부신과 뇌하수체의 기능저하, 무기 력, 부정맥 등의 부작용을 초래할 수 있고^13,14), 외과적인 관절성형술, 관절경 미세천공술 등으로 연골 수복을 기대 하고 있으나 수복된 섬유연골 반흔 조직들이 생역학적으 로 불완전하여 추적관찰시 관절연골이 더욱 손상되고 관 절염이 진행된다는 보고들이 있으며¹⁵⁾ 인공 슬관절 전치 환술의 경우에도 수술 대상자 대부분이 노인환자들로 합 병증의 가능성이 크고 회복력이 떨어지며 장기간의 입원 에 따른 근력감소가 더욱 관절의 기능을 떨어뜨릴 수 있 다는 한계가 있어¹⁶⁾ 보다 적극적인 증상의 호전 및 연골 보호와 재생효과를 목표로 다양한 치료방법의 개발이 시 도되고 있다¹⁷⁾.

최근 10년간 발표된 골관절염의 한의학적 치료에 대한 연구동향을 살펴보면 2006년을 기점으로 진통, 소염, 해 열의 단순 증상 치료 효과에서 연골세포 보호 및 재생이 라는 근본적인 골관절염의 치료 효과에 대한 연구로 흐름 이 변하고 있다¹⁸⁾.

본 연구에서 사용한 健步丹은 風寒濕의 邪氣가 인체의 榮衛失調, 腠理空疎, 正氣虛弱한 틈을 타고 關節에 凝滯 됨으로써 발현된 골관절염을 溫補 溫散 溫通의 방법으로 치료하고자 저자가 착안한 처방이다.

일반적으로 양이 가장 많은 약재가 君藥의 역할을 하 지만 본 연구에서는 鹿角 40 g으로 8 g의 교질이 될 때까 지 3일간 졸여 만든 鹿角膠를 溫補하는 효력을 이끄는 핵 심적인 역할을 한다고 보고 健步丹의 君藥으로 정하였다.

健步丹을 구성하고 있는 구성약물 중 杜冲¹⁹⁾, 續斷^20-22), 牛膝²³⁾, 草烏^24,25), 川烏頭, 沒藥, 乳香²⁶⁾, 威靈仙^27,28), 木瓜²⁹⁾, 陳皮³⁰⁾, 黃芪³¹⁾, 甘草³²⁾, 鹿角³³⁾은 각각 관절염에 대해 유 의한 효과를 나타낸다는 연구 보고가 있었으며, 補骨脂는 윤 등의 연구에서 항산화작용과 이로 인한 신경세포 보호 효과가 확인되었고³⁴⁾, 狗脊은 항염 효과와 골 소실 억제 효과 등이 입증되었으며^35-37), 天麻는 골다공증과 관절염 등의 원인이 되는 파골세포의 형성과 활성증가를 억제하 는 효과가 확인되었다³⁸⁾. 또한, 百節有神湯의 골관절염 동물실험을 통해 鹿角膠와 같은 교질성분이 골관절염에 유효할 수 있음을 보여주었다³⁹⁾.

이에 저자는 健步丹이 久虛한 전신 상태에 風寒濕 邪 氣가 울체되어 발현된 골관절염의 진통, 소염, 연골세포 보호 및 재생 치료에 효과적일 것이라는 가설을 세우고 이를 평가하고자 실험을 시행하였다. MIA로 유발된 골관 절염 rat에 健步丹를 4주간 1일 1회 투여한 다음 관절염 이 유발된 뒷다리의 체중부하검사, 간 및 신장 독성 검사, 혈청 내 염증 cytokine, 단백분해효소, arachidonic acid 대사물질, osteocalcin 생성량을 측정하고, 연골량 및 병 리조직학적 변화 등을 관찰하여 골관절염에 대한 健步丹 의 효과를 확인하였다. 또한 실험에 사용한 健步丹은 환 자에게 투여되는 실제 약물의 효과를 확인해보고자 제조 된 丸藥 그대로를 사용하여 시행하였다.

본 실험에서 골관절염 유발물질로 사용된 MIA는 관절 연골의 손상, 기능장애, 통증 등의 양상이 사람의 골관절 염과 매우 유사하게 발현되고, 질환의 진행정도와 통증 수준을 정확하게 평가할 수 있을 뿐 아니라 주입 농도에 따라 관절 퇴행정도가 다양한 동물 모델을 만들 수 있는 장점을 가지고 있다^40,41).

또한, 기존 선행 연구를 살펴보면 MIA 주입 후 3일째 부터 무릎관절의 연골부분에서 염증성 소견이 확인되고 급성 염증 반응에 의한 통증 유발 물질이 관절 내에 분비 되어 연골하 골에 있는 말초 일차 침해 수용기인 Aδ 섬 유와 C 섬유들을 민감하게 만들어 통증이 발생되고 MMP 활성이 증가되는 것을 확인할 수 있다⁴²⁾. 주입 7일째에는 윤활막과 주위 조직 내 변형이 발생하며 proteoglycan의

소실이 모든 구획에서 관찰되고 연골하 골의 기질 붕괴와 MMP, collagenase, gelatinase의 활성이 증가하는 것을 볼 수 있으며 퇴행이 진행되고 있는 연골하 골에서 뼈 파 괴세포와 뼈 모세포의 활동이 증가되어 골의 재형성 과정 이 진행되면서 동시에 관절 연골이 소실되게 되며 21일째 에는 심층부의 연골까지 파괴되는 것을 관찰할 수 있었 다⁴³⁾. 이를 근거로 이번 연구에서는 MIA 주입 후 7일째 부터 약물 투여를 시작하여 총 4주 동안 심층부까지 진행 되는 골관절염에 대한 약물의 반응을 살펴보았다.

본 연구에서 양성대조군에게 투여한 Indomethacin은 NSAIDs의 대표약물로 해열 및 강한 항염증작용과 진통작 용을 하며⁴⁴⁾ 국내에서는 급만성 관절염, 근육통, 척추염 등의 치료목적으로 유통 판매중인 성분이다⁴⁵⁾.

본 연구에서 골관절염을 유발한 rat의 뒷다리 체중 부 하를 측정하여 통증변화를 간접적으로 관찰하였다. KBD 투여군은 대조군과 비교하여 체중부하비율에서 유의한 증가를 보였다(Fig. 2). 이는 관절염 유발 후 염증, 부종 및 통증으로 인해 체중을 싣지 못하던 rat이 약물 투여가 시작되면서 염증반응과 통증발현이 감소되면서 뒷다리 체중부하비율이 증가된 것을 보여주는 결과이다.

In vivo에서 시행된 혈청검사에서 간 기능을 반영하는 ALT, AST 농도와 신장 기능을 반영하는 BUN, creatinine 의 농도는 모두 대조군에 비해 유의한 증감을 보이지 않 아 KBD가 생체 내에서 안전한 약물임을 확인할 수 있었 다(Fig. 3, 4).

골관절염이 발현되면 연골세포나 윤활막 세포에서 관 절염의 진행에 주요하게 관여하는 TNF-α, IL-1, IL-6이 발현된다. 이런 cytokine이 과도하게 분비되면 MMPs와 aggrecanase 등의 단백분해효소와 prostaglandin의 생성 을 촉진시키고 type II collagen과 proteoglycan의 합성을 방해하여 관절 연골세포와 조직을 손상시키고 이것이 침 해수용성 1차 구심성 신경을 자극하여 통증을 유발시키 게 된다^46-48).

TNF-α는 세포의 증식, 생존, 분화와 자멸사 등을 포 함한 다양한 세포활동에 관여하는 cytokine이다. 골관절 염이 발현되면 대식세포에서 TNF-α가 비정상적으로 과 다 분비되며 IL-1β, IL-6, IL-10 및 MMPs와 같은 하위염 증매개물질의 분비를 촉진하여 염증을 증폭시키고 활막 세포의 증식을 항진시켜 관절 연골기질로부터 proteogly- can 소실과 재합성 억제를 통해 관절 연골을 손상시키고

골관절염의 진행을 유도한다^48,50).

IL-1β는 IL-6의 발현을 증가시키고, 연골세포로부터 MMPs와 PGE2, 아교질 분해효소 및 산화질소의 생성과 분비를 촉진시켜 연골기질의 파괴를 촉진시킨다⁵¹⁾. 또한, 증가된 IL-1β는 염증성 통증과 관련된 신경성장인자 (nerve growth factor)의 발현을 유도하여 통각 과민을 유발하고 일차 구심성 신경섬유를 자극하여 통증을 발생 시킨다^52,53).

IL-6은 TNF-α와 IL-1에 의해 분비 촉진되는 급성 조절 단백질로 파골세포 분화를 촉진시켜 골 흡수와 골 생성의 방해에 관여하며 골관절염과 같은 염증상태나 골 흡수과 정에서 C-reactive protein (CRP)의 분비를 촉진시켜 급성 염증 반응을 유발하는 등 관절 염증반응 진행에 주된 매 개 작용을 한다⁵⁴⁾.

본 연구에서 KBD를 4주간 투여한 관절염 유발 rat의 혈청검사에서 TNF-α, IL-1β의 생성량은 대조군에 비해 유의하게 감소하였으며, IL-6은 대조군보다 감소하였으나 통계적 유의성은 없었다(Fig. 5A~5C). 이는 KBD가 생체 내에서 TNF-α, IL-1β, IL-6의 활성을 억제하여 골관절염 에 유의한 효과를 기대할 수 있음을 보여준다.

MMPs는 단백분해효소로 정상적인 생리환경에서 세포 외 기질의 조절된 분해를 담당하는데 그 작용이 조절되지 않고, 과도하게 표현되는 경우 세포외 기질성분을 광범위 하게 분해하여 조직의 손상을 초래한다⁵⁵⁾. MMP는 현재 까지 약 20여 종류가 알려져 있다. 이 중 MMP-9는 type V, type IX, type X collagen을 분해하는 gelatinase로서 기존 많은 연구를 통해 퇴행성 골관절염의 연골세포에서 MMP-9의 단백 및 mRNA가 과발현되고 있음이 증명되었

다^56-60). 또한, MMP-9는 Mankin 조직학적 등급과 방사선

영상소견에서의 Kellgren 점수가 높을수록 발현율이 증가 하여 MMP-9의 발현정도가 임상 예후 인자와 부합되는 가능성을 보여주었다⁶⁰⁾.

TIMP (Tissue Inhibitor of Metalloproteinase)는 MMP 단백활성을 억제하는 기능을 한다. 정상조직인 경우 MMP 와 TIMP가 균형을 이루어 기저막의 분해가 적절하게 조 절되나 골관절염에서는 이들의 불균형으로 인해 관절염 의 정도가 결정된다고 보고되고 있다⁶¹⁾. 노의 연구에서 보면 TIMP-1 유전자의 발현은 병변이 심해질수록 동반되 어 증가됨을 보여주고 있다⁶⁰⁾.

본 연구에서 KBD 투여군의 MMP-9 및 TIMP-1의 생성

량은 양성대조군과 비슷한 수준으로 대조군에 비해 유의 하게 감소하였다(Fig. 6A, 6B). 이는 KBD 투여가 연골세 포 손상을 효과적으로 억제하여 진행중인 골관절염의 치 료 가능성을 보여주는 것으로 해석할 수 있다.

Arachidonic acid는 cytokines, 호르몬 등에 의해 세포 지질막에서 분비되어 COX와 lipoxygenase의 활성화에 따라 prostaglandin, thromboxane, leukotriene과 같은 eicosanoids로 전환되는 불포화지방산이다⁶²⁾.

PGE2는 염증반응의 중요한 매개물질로 다양한 염증성 질환에서 정상 조직의 파괴와 함께 형성이 촉진되는 것으 로 알려져 있으며, 특히 골관절염에서는 염증부위에 arachidonic acid 대사물질 생성이 증가할 때 PGE2의 합 성을 매개하여 관절부위 통증, 국소종창 및 발열 등의 골 관절염의 증상을 야기하는데 주로 관여한다^63,64).

LTB4는 Lipoxygenase의 활성화에 따른 주요 산물로서 염증반응에서 호산구 및 호중구에 대하여 강력한 유주성 특성을 갖는 성분으로 알려져 있으며, 세포의 화학주성에 필요한 여러 인자들과 세포부착인자의 발현에 영향을 주 어 치주염, 류마티스 관절염 및 다수의 염증성 질환에 핵 심적 기능을 하는 인자이다⁶⁵⁾.

본 연구에서는 PGE2, LTB4의 변화를 통해 arachidonic acid의 대사를 살펴보았는데, KBD 투여군에서 대조군에 비해 유의한 감소를 보였다(Fig. 7A, 7B). 이러한 결과는 KBD가 arachidonic acid 대사활성을 저하시켜 항염효과 를 나타내는 하나의 근거로 판단될 수 있다. 특히, 관절 염이 유발된 뒷다리의 체중부하 증가와 신경자극통증을 발현할 수 있는 TNF-α, IL-1β, IL-6와 같은 cytokine의 감소, 통증과 종창 등 주요 관절염 증상을 야기하는 PGE2

의 감소는 KBD가 골관절염 발현 시 통증을 억제하는데 일정한 효과가 있음을 보여주는 근거가 된다.

Osteocalcin은 뼈의 성장, 변형, 재생에 중요한 역할을 하는 조골세포에서 합성되는 골 형성 지표 단백질이다⁶⁶⁾. 골관절염은 이환 관절의 연골하 골 침하, 골극 형성, 연골하 골의 경화 등 신생골 형성을 특징으로 하는 질환 특성상 골 교체율이 증가되어 골질이 약한 높은 골밀도를 나타낼 수 있다. 이런 이유로 진행되는 골관절염에서는 osteocalcin의 혈청농도가 높게 측정될 수 있다⁶⁷⁾.

본 연구에서 측정한 osteocalcin 생성량은 KBD 투여군 에서 대조군에 비해 유의하게 감소하였다(Fig. 8).

실험 종료 후 Micro-CT arthrography를 사용하여 연골

손상정도를 확인하기 위해 남아있는 연골량을 측정한 결 과, 정상군이 4.64 mm³, 대조군이 1.15 mm³, 양성대조군 이 3.70 mm³, KBD 투여군은 4.41 mm³로 나타났다(Fig.

9). 정상군과 거의 가깝게 연골량이 보존된 이 결과는 KBD가 연골 세포 소실을 억제하고 보호하여 골관절염의 관련 증상들을 근본적으로 치료할 수 있는 가능성을 보여 주었다.

실험 종료 후 병리조직학적 소견을 관찰하기 위해 시 행한 H&E 염색 결과, KBD 투여군 및 양성대조군에서는 변성괴사된 관절연골의 범위, 연골하 골조직의 노출 및 연골하 골조직 주위의 섬유화 소견, 활막의 비후 정도가 대조군에 비해 상대적으로 감소하였다(Fig. 10A).

Proteoglycan은 연골조직의 유연성과 탄력성을 유지하 고, 관절 표면에 proteoglycan membrane을 형성하여 관 절면을 보존하며, 삼투압을 통해 관절연골에 영양공급을 하는 한편 교원질 섬유와 결합하여 연골과 골이 손상되지 않도록 하는 역할을 한다. 따라서 기질의 proteoglycan 함량 감소는 관절의 불안정성을 높이고, 관절연골의 대사 작용을 저하시켜 골관절염을 진행시키고 악화시키는 요 인이 된다⁶⁸⁾.

본 실험의 Safranin-O 염색 결과, 대조군에서는 관절 연골층의 대부분이 파괴되어 붉은색 염색 조직이 모두 사 라진 것에 비하여 양성대조군과 KBD 투여군은 붉게 염 색된 proteoglycan 조직이 활막 주변에 많이 분포하고 있 고 그 차이가 뚜렷하여 KBD 투여가 MIA유발 골관절염의 진행에서 관절 연골내 proteoglycan 파괴를 억제하는 역 할을 했음을 알 수 있다(Fig. 10B).

이상의 결과를 종합하면 健步丹(KBD)이 MIA로 유도된 골관절염 rat에서 혈청 내 염증 cytokine의 생성과 MMP- 9, TIMP-1 등의 염증매개인자를 억제하여 항염증 작용 및 진통작용을 하는 것을 관찰할 수 있었으며, 이를 통해 연골파괴와 활막 주변의 proteoglycan 파괴를 억제하는데 유의한 효과가 있음을 확인하였다.

향후

in vivo

결론»»»

健步丹(KBD)이 골관절염에 미치는 효과를 확인하기 위하여 MIA로 유도된 골관절염 rat을 이용하여 염증매개 인자 측정 및 병리조직학적 관찰 등을 실시한 결과 다음 과 같은 결론을 얻었다.

1. 관절염을 유발한 뒷다리 체중부하측정에서 유의한 증가를 보였다.

2. 간 및 신장에 독성을 나타내지 않았다.

3. 혈청 내 염증 cytokine 중 TNF-α, IL-1β는 유의하 게 감소하였으며, IL-6은 감소하였으나 유의하지 않았다.

4. 혈청 내 MMP-9와 TIMP-1은 유의하게 감소하였다.

5. 혈청 내 LTB4, PGE2, Osteocalcin 생성량이 유의하 게 감소하였다.

6. Micro-CT arthrography 상 연골량이 정상군에 가깝 게 보존되어 있었다.

7. 병리조직학적 소견에서 관절 주변 연골과 뼈의 침 하, proteoglycan과 연골파괴 등이 감소하였다.

이상의 결과로 보아 健步丹은 MIA로 유도된 rat의 골 관절염에서 염증 cytokine과 염증 매개인자 발현을 억제 하는 항염증 및 진통효과가 있었다. 또한 연골의 변성 및 파괴를 방지함으로써 관절염 진행을 억제하는 효과를 나 타내는 바, 향후 임상에의 활용이 기대된다.

참고문헌»»»

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