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Ι .
서론퇴행성관절염 이라고도 불리는 골관절염(osteoarthritis) 은 성인에서 흔하게 발생하는 대표적인 근골격계 질환이며, 골관절염은 연골하부와 골소주 및 관절연골의 대사로 발생
하며, 관절연골의 국소적인 퇴행성 변화, 연골하골의 비야, 주변 골연골부의 과잉 골형성 관절의 변형등과 함께 심한동 통과 심각한 운동장애를 동반한다(Bang 등, 2007, Altman 등). 이러한 골관절염의 주요 치료방법으로는 체중조절, 물 리치료, 하지근육 운동치료 등의 비약물치료와 함께
마이크로어레이를 이용한 봉독 처리된 돼지 초대배양 연골세포에서의 유전자 발현 프로파일링
박새롬1 · 이영섭1 · 김진우1 · 김 훈1 · 최소영1 · 이지연1 · 나레시 쿠마 싱1 · 오재돈2 · 이학교2 · 이성진1*
강원대학교 동물생명과학대학1, 한경대학교 유전정보연구소2
Gene Expression Profiling in Porcine Primary Chondrocyte Cells Treated with Bee Venom using Microarray
Sairom Park1, Yeung-sub Lee1, Jin Woo Kim1, Hun Kim1, So-young Choi1, Ji-yeon Lee1, Naresh Kumar Singh1, Jae-Don Oh2, Hak-Kyo Lee2 and Sung-Jin Lee1*
1Dept. of Animal Biotechnology, Kangwon National University,
2Genomic Informatics Center, Hankyong National University
ABSTRACT1)
Osteoarthritis is one of the commonest causes associated with age-related damage of articular cartilage.
Non-steroidal anti-inflammatory drugs are commonly used in osteoarthritic patient. However, long term administration of these drugs results gastrointestinal disorders. Though, most studies have demonstrated in the past that bee venom has therapeutic effect on diseases related to inflammation and pains, but its anti-inflammatory properties have not been so far studied on inflamed chondrocytes (LPS induced) invitro. For the purpose, the study was carried out to determine the effect of bee venom on porcine articular chondrocyte cell using microarray. In this study, we found that 2,235 significantly associated gene (1,404 up-regulated genes and 831 down-regulated genes) that were expressed on inflamed and non inflamed chondrocytes during proliferation. Among the 1,404 up-regulated genes and 831 down-regulated genes, known genes were 372 and 237, respectively. On the other hand, bee venom significantly reduced expression of fetuin involved in acute inflammatory reaction. Our results suggest that this study could be useful database in gene expression profiling of chondrocyte cell treated with bee venom.
(Key words: Chondrocyte cell, Osteoarthritic, Bee venom, Microarray)
* Corresponding author: Sung-Jin Lee, Dept. of Animal Biotechnology, College of Animal Life Sciences, Kangwon National University, Chuncheon 200-701, Korea. Tel: +82-33-250-8636, E-mail: sjlee@kangwon.ac.kr
This is an Open Access journal distributed under the teams of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses(by-nc/3.0) which permits unrestricted non-commercial use, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
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acetaminophen 혹은 비스테로이드성 소염진통제류(non- steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)의 복용의 약 물치료, 관절치환술과 같은 수술요법 등이 사용되고 있다 (Noh 등, 2004, Lee 등 1996). 하지만 NSAIDs는 골관절염 환자의 통증 완화를 위해 가장 많이 사용되고 있지만 장기 간 사용했을 시 위장관 부작용이 증가하는 단점이 있어 적 극적인 질병치료 수단으로서는 미흡한 점이 많으며 통증완 화로써 작용하고 있어 치료 수단으로는 미흡한 점이 많다. 한편 천연물질은 예로부터 민간요법으로 이용한 사례가 많았으며 화학적 약물과 달리 장시간 약물투여로 인한 부 작용이 적은 장점이 있어 최근 인공합성물 보다 이를 이용 한 신약개발에 관해 많은 연구가 진행되고 있다.
특히 봉독은 대표적인 천연물질로 알려져 왔으며 관절염, 통풍 등 각종 염증성 질환과 통증성 질환에 활용되어 왔다 (Dunn 등, 1988, Wang 등, 2001). 또한 봉독의 효능에 대해 서는 다양한 연구가 진행되어 왔으며 관절염과 관련된 분 야에서는 진통 및 항염증 효과가 많이 연구되고 있으며 (Jang 등, 2005, Nam 등, 2003), 이외에도 각종 신경성, 타박 성, 소화기 질환뿐만 아니라 암과 에이즈에 이르기까지 다 양한 질환에서 봉독의 항염증 및 항균효과에 관한 연구가 활발히 이루어지고 있다(An 등, 2012). 하지만 현재까지 봉 독 효능에 대한 연구가 상당히 진행되어 왔으나 아직 봉독 이 연골세포 분화에 미치는 영향에 대한 연구는 미미한 실정 이다. 따라서 본 연구는 봉독이 연골세포 분화에 미치는 영 향을 알아보기 위해 돼지연골 세포를 대상으로 microarray 방법을 통해 유전자 발현 양상을 알아보고자 하였다.
Ⅱ. 재료 및 방법
1. 관절 연골세포의 분리 및 배양
연골채취를 위한 실험동물로는 돼지(Sus scrofa)를 사용하 였고, 뒷다리 슬 관절 부위를 삭모 및 소독하였으며 모든 작 업은 무균상태에서 진행하였다. 피부절개를 가한 후, 연골막 을 제거하고 연골을 채취하여 serum-free DMEM(Dulbeco‘s Modified Eagle’s Medium) 용액에 보관하였다. PBS용액으 로 2-3회 세척한 후 hyaluronidase을 첨가한 DMEM media 를 넣어 잘게 chopping한다. 상층액을 제거한 후 protease 으로 37℃에서 60분간 incubation한 후 처리된 연골을 1,500 rpm, 5분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하여 PBS 용액으로 세척하였다. Type Ⅱ collagenase을 37℃에서 약
2시간30분 배양한 후 같은 방법으로 처리하여 연골세포를 얻었다. 얻어진 세포를 혈구계로 세포수를 세어 20% FBS (fetal bovine serum Gibco:26140-038)와 antibiotics가 포함 된 DMEM 배양액에 37℃, 5% CO2하에서 3일 초대배양하 였다. 분리된 연골세포의 동정은 배양 후 3일째 도립현미경 으로 세포의 형태학적 특징을 관찰하였다.
2. 봉독이 연골세포에 미치는 영향, 배양 및 봉독 처리
배양된 세포를 flask에 seeding한 후 세포단층이 형성되 도록 37℃, 5% CO2조건에서 24시간 배양한 후 serum-free DMEM으로 배양액을 교환하면서 대조군과 봉독을 투여할 실 험군으로 나누었다. 대조군에는 1 ㎍/㎕의 lipopolysaccharides 가 포함된 배지에서 배양되었으며, 실험군에는 20 mg/ml 의 농도의 봉독을 포함한 DMEM배지에서 배양되었다.
3. RNA추출 및 Microarry분석
Total RNA는 RNeasy mini kit(Qiagen, Hiden, Germany) 을 이용하여 자사의 protocol에 따라 추출하였다. 유전자 발현은 GenechipⓇ Procine Genome Arrays(Affymetrix, Snta Claara, CA)의 23,973개의 probe를 이용하여 확인하였 다. DNA chip의 scanning은 Affymetrix GeneChip Scanner 3000 7 G를 사용하였다. DNA chip의 제작과 분석 은 GenoCkeck co., Ltd.(Korea)에서 수행하였다.
Ⅲ. 결론 및 고찰
봉독이 돼지 연골세포에 미치는 영향을 확인하기 위해서 Affymetrix사의 porcine genome array genechip을 이용하여 약 23,973개의 probe에서 유전자 발현을 확인하였다(Fig. 1).
유전자에서 봉독에 의해 발현이 1.5배 이상 발현차이를 나타낸 유전자는 약 2,235개로 분석되었으며, log intensity 를 이용하여 발현차이를 나타내는 유전자들의 수를 각 단 계에 따라 Fig. 2에서 확인하였다. X축은 비교, 대조군의 log2 ratio를, Y축은 해당 log intensity를 나타내는 유전자 의 수이며 가운데 두 라인을 제외하고 다른 부분의 유전자 수가 유의적인 발현차이를 나타내었다. 비교 결과 발현양이 증가된 유전자(up-regulated gene)가 1404개, 발현양이 감 소된 유전자(down-regulated gene)가 831개로 분석되었다.
이 발현양이 증가된 유전자 중 밝혀진 유전자(up-regulated
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Gene title Gene symbol Fold change
Myosin, light chain 1, alkali; skeletal, fast MYL1 5.0299
Angiopoietin-like 4 ANGPTL4 4.4992
Serpin peptidase inhibitor, clade E (nexin, plasminogen activator inhibitor type 1),
member 1 SERPINE1 3.4795
Similar to Rho GTPase activating protein 29 Cyclin B2
Transcription factor 19
Transforming growth factor, beta 2 Tissue factor
Similar to kinesin family member 4
Similar to ATPase, class I, type 8B, member 1 Similar to cell division cycle associated 7 Similar to spindle and KT associated 1 Hematological and neurological expressed 1 Aurora kinase A
LOC100152734 CCNB2 TCF19 TGFB2 LOC396677 LOC100152604 LOC100153006 LOC100154583 LOC100157355 HN1
CR956640.2
3.2697 3.2563 3.1797 3.1476 3.1259 3.0433 3.0255 2.9924 2.9544 2.8286 2.7830 Similar to Ankyrin repeat domain-containing protein 28 (Phosphatase interactor
targeting protein hnRNP K) (PITK) LOC100152333 2.7683
Fig. 1. Gene expression
Fig. 2. Intensity ratio histogram of bee venom-treated versus control
Table 1. Expression profiling of the up-regulated gene in the bee venom-treated chondrocyte
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Table 1. Continued
Gene title Gene symbol Fold change
LIM and cysteine-rich domains 1 LMCD1 2.7191
Similar to COX15 homolog, cytochrome c oxidase assembly protein LOC100156375 2.6966
Cellular retinoic acid binding protein 1 LOC100169745 2.6497
GTP binding protein overexpressed in skeletal muscle GEM 2.5479
Topoisomersae II TOPOII 2.5276
DNase X LOC654408 2.5185
PDZ binding kinase PBK 2.5078
Similar to geranylgeranyl diphosphate synthase 1 LOC100155232 2.4984
Similar to hCG2039386 LOC100151967 2.4666
Similar to Vaccinia related kinase 1 LOC100157930 2.4382
Adipose differentiation-related protein ADRP 2.4283
Cyclin B CCNB1 2.4253
Similar to Coronin-1C (Coronin-3) (hCRNN4) LOC100156622 2.4179
Similar to LAG1 longevity assurance 2 LOC100156737 2.3970
Similar to Uncharacterized protein KIAA0423 LOC100155142 2.3907
Similar to RAD51 associated protein 1 LOC100157339 2.3407
Similar to dual specificity phosphatase 5 LOC100157144 2.3204
Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase 1 ROCK1 2.3031
Similar to S100 calcium binding protein A10 LOC100156320 2.2619
Similar to NF1-B3 LOC100155995 2.2302
Similar to MLLT11 protein LOC100157518 2.2244
Baculoviral IAP repeat-containing 5 BIRC5 2.2149
Calpain, small subunit 1 CAPNS1 2.2047
Similar to Rho GTPase-activating protein 11A (Rho-type GTPase-activating protein 11A) LOC100157473 2.1994
Similar to Transcription elongation factor A (SII), 1 LOC100157724 2.1830
Pituitary tumor-transforming 1 PTTG1 2.1777
Testis derived transcript TES 2.1771
Man9-mannosidase MAN1A 2.1770
Similar to Early endosome antigen 1 (Endosome-associated protein p162) (Zinc finger
FYVE domain-containing protein 2) LOC100153403 2.1762
Similar to MGC166137 protein LOC100152590 2.1644
Ras homolog gene family, member B RHOB 2.1445
Paternally expressed 10 PEG10 2.1338
Similar to Coenzyme Q6 homolog, monooxygenase (S. cerevisiae) LOC100155731 2.1329
Similar to ubiquitin-conjugating enzyme E2C LOC100153133 2.1239
Similar to v-myb myeloblastosis viral oncogene homolog (avian)-like 2 LOC100157175 2.1204
Insulin-like growth factor binding protein 6 IGFBP6 2.0921
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Table 1. Continued
Gene title Gene symbol Fold change
Smooth muscle protein 22-alpha SM22A 2.0921
Similar to Spermine synthase LOC100153052 2.0878
Transforming growth factor, beta 3 TGFB3 2.0841
Odd homeobox 1 protein OB1 2.0776
Similar to glucosamine-phosphate N-acetyltransferase 1 LOC100152942 2.0705
Similar to SPECC1-like LOC100156318 2.0605
Similar to RAS-like, family 12 protein LOC100155433 2.0579
Carboxypeptidase E CPE 2.0420
Karyopherin alpha 2 KPNA2 2.0370
Collagen type XI alpha 1 COLL11A1 2.0304
Similar to histone 2a LOC100157768 2.0285
Hypothetical protein LOC100155770 LOC100155770 2.0209
Similar to LOC515537 protein LOC100154619 2.0176
Similar to Fanconi anemia D2 protein LOC100155058 2.0160
Similar to minichromosome maintenance complex component 4 LOC100156398 2.0156
Similar to cell division cycle associated 3 LOC100153312 2.0099
Antigen identified by monoclonal antibody Ki-67 MKI67 2.0080
Table 2. Expression profiling of the down-regulated gene in the bee venom-treated chondrocyte
Gene title Gene symbol Fold change
Ribosomal protein, large, P1 RPLP1 0.0018
Interleukin 8 IL8 0.0162
Alveolar macrophage-derived chemotactic factor-II AMCF-II 0.0179
Chemokine (C-X-C motif) ligand 2 CXCL2 0.0306
Chemokine (C-X-C motif) ligand 2 CXCL2 0.0398
38 kDa heparin-binding glycoprotein GP38K 0.0589
Chemokine (C-X-C motif) ligand 2 CXCL2 0.0784
Similar to Stathmin-2 (Protein SCG10) (Superior cervical ganglion-10 protein) LOC100156768 0.0851
Chemokine (C-C motif) ligand 2 CCL2 0.0957
Myosin light chain, phosphorylatable, fast skeletal muscle MYLPF 0.1035
Superoxide dismutase 2, mitochondrial SOD2 0.1085
Protein phosphatase 1 catalytic subunit alpha isoform LOC733611 0.1340
Complement component 3 C3 0.1371
Nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells inhibitor, alpha NFKBIA 0.1403
Similar to polypyrimidine tract binding protein 2 LOC100153327 0.1947
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Table 2. Continued
Gene title Gene symbol Fold change
Metallothionein MT1A 0.2033
RNA binding motif protein 39 RBM39 0.2152
Splicing factor, arginine/serine-rich 1 SFRS1 0.2393
Matrix metallopeptidase 1 (interstitial collagenase) MMP1 0.2471
Similar to ribeye LOC100154421 0.2493
Parathyroid hormone-like hormone PTHLH 0.2636
Microsomal prostaglandin E synthase-1 LOC654407 0.2657
B-factor, properdin SBAB-707F1.11 0.2677
Similar to ELAV-like 2 LOC100153303 0.2700
Similar to Fanconi anemia, complementation group I LOC100156260 0.2792
Similar to exportin 7 LOC100153229 0.2866
Complement component 1, s subcomponent C1S 0.2893
Claudin 1 CLDN1 0.2902
Chemokine CXCL14 0.2992
Scavenger receptor for phosphatidylserine and oxidized low density lipoprotein SR-PSOX 0.3075
Acyl-CoA synthetase long-chain family member 1 ACSL1 0.3223
Dystrophin DMD 0.3299
Similar to angiotensinogen LOC100157073 0.3311
Pyruvate carboxylase PC 0.3323
Similar to fragile X mental retardation 1 LOC100155078 0.3333
Sp1 transcription factor SP1 0.3350
Splicing factor, arginine/serine-rich 2 SFRS2 0.3419
Similar to cyclophilin D LOC100152612 0.3491
Complement component 1, r subcomponent C1R 0.3510
Vascular cell adhesion molecule VCAM1 0.3631
Interleukin 6 (interferon, beta 2) IL6 0.3658
Protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 2 PTPN2 0.3695
Transformer 2 beta homolog (Drosophila) TRA2B 0.3773
Similar to fragile X mental retardation-related protein 1 LOC100155866 0.3881
Cytochrome P450 1A1 CYP1A1 0.3967
Six transmembrane epithelial antigen of the prostate 1 STEAP1 0.4041
Similar to UDP-glucuronosyltransferase LOC100152603 0.4043
Sodium channel, voltage-gated, type II, alpha subunit SCN2A 0.4282
Protein phosphatase 1 catalytic subunit alpha isoform LOC733611 0.4306
Tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein, theta
polypeptide YWHAQ 0.4333
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Table 2. Continued
Gene title Gene symbol Fold change
F-box protein 32 FBXO32 0.4362
Aryl hydrocarbon receptor AHR 0.4365
DEAH (Asp-Glu-Ala-His) box polypeptide 16 DHX16 0.4559
Similar to Putative RNA-binding protein 15 (RNA-binding motif protein 15) (One-twenty
two protein) LOC100155227 0.4581
Renin binding protein RENBP 0.4596
Solute carrier family 16, member 3 (monocarboxylic acid transporter 4) SLC16A3 0.4611
Similar to SFLQ611 LOC100155717 0.4615
Protein phosphatase 2 (formerly 2A), regulatory subunit B, alpha isoform PPP2R2A 0.4689
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GAPDH 0.4690
Similar to Transcription factor MafB (V-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene
homolog B) LOC100157756 0.4814
Interleukin 4 receptor IL4R 0.4926
Peroxisome proliferator-activated receptor delta PPARD 0.4981
known gene)는 372개, 발현양이 감소된 유전자 중 밝혀진 유전자(down-regulated known gene)는 237개로 나타냈으 며, 이 중 발현이 2배 이상 차이를 나타낸 유전자를 Table 1 과 2에 제시하였다. 유전자 발현이 2배 이상 증가한 유전자 는 68개 발현이 2배 이상 감소한 유전자는 62개로 나타났으 며 이 중 가장 높은 발현을 나타낸 유전자는 MYL1(myosin, light chain 1)으로 가장 감소된 발현을 나타낸 유전자는 RPLP1(ribosomal protein, large, P1)으로 나타났다.
porcine gene ontology(GO) 정보를 이용하여 분석한 결 과 372개의 up-regulated known gene 중 GO function이 밝혀진 유전자는 131개로 나타났으며, GO molecular function은 112개, Go cellular component은 84개, GO biological process은 102개로 밝혀졌다. 또한 237개의 down-regulated known gene 중 GO function이 밝혀진 유 전자는 139개로 나타났으며, GO molecular function은 128 개, GO cellular component은 102개, GO biological process은 110개로 밝혀졌다.
fetuin은 간에서 생성되는 당 단백질로 급성 염증반응에 관여하며 봉독 처리된 연골세포에서 대조군에 비해 유의적 으로 감소함을 확인할 수 있었다. 이는 봉독의 항염증 작용 으로 예상되어 지며 이러한 결과들을 미루어 보면 봉독은 연골세포의 항염증작용에 있어 영향을 미치는 것으로 예상 되어 진다.
기존의 연구로 인해 증명된 봉독의 기능으로는 항암, 진 통, 면역기능증가 등의 효과가 있으나(Gi 등 1998, Lee 등 2003), 연골세포를 이용하여 봉독의 소염 진통효과에 대한 연구는 아직 미미한 상태이다. 본 연구에서는 봉독의 효과 를 microarray방법을 이용하여 검정하였으며 염증작용에 연관된 유전자에서 감소되는 것을 볼 수 있었다. 따라서 봉 독은 연골세포의 항염증작용에 영향을 미치는 것으로 예상 되어 지며 본 연구 결과는 봉독의 발현 프로파일링의 기초 자료로 사용될 것으로 사료된다. 또한 앞으로 RT-PCR 및 western blotting방법을 이용하여 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
Ⅳ. 요약
골관절염(osteoarthritis)은 연령이 증가하면서 발병율이 증가하고 있으며 성인에서 흔하게 발생하는 중요한 질환이 다. 이러한 골관절염의 치료는 외과적 치료방법과 소염진통 제류(non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)의 약물치료가 있지만 부작용이 증가하는 등, 치료수단으로는 미흡한 점이 많다. 한편 봉독은 대표적인 천연물질로 각종 염증, 통증성 질환에 활용되어 관절염에 미치는 효과에 대 한 연구가 많이 진행되어 왔으나 봉독이 연골세포 분화에
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미치는 영양에 대한 연구는 미미한 실정이다. 따라서 본 연 구는 각종 염증성 질환과 통증성 질환에 활용되고 있는 천 연물 유래의 봉독을 활용하여 연골세포 분화에 미치는 영 향을 알아보기 위해 배양된 돼지 연골세포를 대상으로 microarray실험을 실시하였다. 실험 결과 1.5배 이상의 유 의적인 차이를 나타는 유전자는 약 2,235개로 나타났으며 이중 유의적으로 증가된 유전자는 1404개, 유의적으로 감소 된 유전자는 831개로 분석되었다. 또한 유의적으로 증가된 유전자중 밝혀진 유전자는 372개, 감소된 유전자중 밝혀진 유전자는 237개로 나타났다. 한편 면역반응과 관련지어 간 에서 생성되는 당단백질이며 급성 염증반응에 관여하는 fetuin의 발현을 대조군에 비해 유의적으로 감소시켰으며 이는 봉독의 항염증 작용으로 예상된다. 따라서 본 연구 결 과는 봉독의 발현 프로파일링의 기초자료로 사용될 것으로 사료되며 앞으로 더 많은 연구가 필요할 것으로 사료된다.
사사
본 연구는 한국연구재단 신진연구지원사업(과제번호:
120120392)와 농촌진흥청 차세대 바이오그린21 사업(과제 번호 PJ008196)으로 이루어 졌으며 이에 감사드립니다.
Ⅴ. 인용문헌
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(투고일: 2012.10.28. 수정일: 2012.12.06. 판정일: 2012.12.07.)
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