총대장균군– 시험관법 (1주차) (ES 05703.1a)
김 재 건 교수
목차
1. 개요
1.1 목적
1.2 적용범위 2. 용어정의
3. 분석기기 및 기구 4. 시약
4.1.1 저온일반세균 배지 (R2A agar) 4.1.2 희석액
5. 시료채취 및 관리 6. 분석절차
6.1 추정시험 6.2 확정시험 6.3 완전시험 7. 결과보고
1.1 목적
1. 개요
1.2 적용범위
• 먹는물, 샘물 및 염지하수에 존재하는 총대장균군을
분석함에 있어 검사결과의 정확과 통일을 기하기 위해 필요한 제반사항에 대하여 규정함
• 먹는물 수질기준 및 검사 등에 관한 규칙 제2조의
규정에 의한 먹는물의 수질기준에 규정된 먹는물, 샘물 및
염지하수의 수질검사에 적용
3. 용어정의
• 총대장균군
: 그람음성 ∙무아포성의 간균 으로서 락토스를 분해하여
기체 or 산을 발생하는 모든 호기성 or 통성 혐기성균 or 갈락토스 분해효소( 𝛽-galactosidase)의 활성을
가진세균을 말한다.
1. 피펫 or 자동피펫 : 멸균된 부피 5mL~25mL의 용량피펫 or 자동피펫 (플라스틱팁 포함)
2. 마개달린 시험관 : - 솜 (플라스틱 or 금속도 가능)으로 마개 를 할 수 있음 - 고압증기 멸균 가능
- 3종류의 시험관 사용가능
☞ 소시험관 (안지름 16㎜, 높이 150㎜) 중시험관 (안지름 18㎜, 높이 180㎜) 대시험관 (안지름 32㎜, 높이 200㎜)
3. 분석기기 및 기구
3. 분석기기 및 기구
3. 다람(Durham)시험관 : 2종류의 시험관 사용가능
☞ 소 ∙중시험관용 (안지름 6㎜, 높이 30㎜) 대시험관용 (안지름 9㎜, 높이 45㎜)
4. 백금이 : 고리의 안지름이 약 3㎜인 것 사용
3. 분석기기 및 기구
3. 분석기기 및 기구
시험관법 추정시험용 배지
증류수 1L + 표의 조성대로 넣어 녹임
↓
pH를 (6.9±0.2)로 조정
↓
다람관이 들어있는 시험관에 각 mL씩 나누어 넣음
↓
121℃에서 15분간 고압증기멸균 (고압증기멸균기)
※ 먹는물의 경우 : 표 1or 2, 10mL씩
샘물, 먹는샘물, 먹는해양심층수, 염지하수, 먹는염지하수의 경우 : 표3 or 4, 25mL씩
※ 가급적 상용화된 완성제품을 사용
4. 시약 및 표준용액
4.1 시약
4. 시약 및 표준용액
4.1 시약
시험관법 확정시험용 배지
증류수 1L + 표5의 조성대로 넣어 녹임
↓
pH를 (7.2±0.2)로 조정
↓
다람관이 들어있는 시험관에 10mL씩 나누어 넣음
↓
121℃에서 15분간 고압증기멸균 (고압증기멸균기)
※ 가급적 상용화된 완성제품을 사용
4.1 시약
4. 시약 및 표준용액
4.1 시약
4. 시약 및 표준용액
1. 멸균된 시료용기 사용, 무균적으로 시료를 채취, 즉시실험
※ 즉시 실험 불가의 경우 : 빛이 차단된 4℃ 냉장 보관 상태에서 24시간 이내에 시험
2. 잔류염소를 함유한 시료를 채취한 경우
: 시료채취 전 멸균된 시료채취 용기에
멸균한 싸이오황산나트륨용액을 최종농도 0.03% 되도록 투여
5. 시료채취 및 관리
5. 시료채취 및 관리
3. 수도꼭지에서 시료를 채취할 경우
: 수도꼭지를 틀어 2~3분 흘려 보낸 후 채취
☞수도꼭지에 부착물이 있을 경우 : - 부착물 제거
- 깨끗한 헝겊 or 휴지로 이물질을 제거 후 채취
※ 필요에따라 수도꼭지 입구를 화염멸균할 수 있음
4. 먹는샘물, 먹는해양심층수 및 먹는염지하수 제품수의 경우 : - 병의 마개를 열지 않은 상태의 제품을 뜻함
- 병에 넣은 후 12시간내 4℃를 유지한 상태에서 검사 ※ 병의 마개가 열린 것은 사용 불가
5. 시료채취 및 관리
5. 시료채취 및 관리
6.1 추정시험
① 삼각플라스크에 필요한 양만큼 증류수와
배지(3LB – 3배 농후 젖당배지)를 혼합하고
마그네틱 바를 넣은 뒤 가열 교반기에 교반하며 가열
② 시험관에 배지 25mL씩 분주하고 다람관(듀람관) 큰 것을 시험관에 하나씩 넣고 시험관 입구를 면전(솜+거즈)로 밀봉하고
Rack에 꽂아 호일로 멸균 중 면전이 분리되지 않도록
시험관의 윗부분을 감싼 뒤 autoclave(고압증기멸균기)에 넣어 멸균 (121℃ / 1.5atm / 15~20min)
6. 분석절차
③ 멸균이 되는 동안 크린벤치에 실험 초자기구들을 세팅해 두고 Fan과 UV등을 작동시켜 무균상태로 준비
※ Agar가 포함되지 않아 배지가 굳지 않으므로 미리 제조해도 무방
④ 무균상태인 크린벤치에서 실험을 시작하는데 cold chamber에 보관되어 있는 Sample을 꺼내어 pipette aid와 일회용 25㎖ pipette을 이용해 검수(sample) 50㎖를 시험관에 분주하고
면전으로 막은 뒤 배양 조건에 맞는 incubator에 배양 [ 3LB : 35.0±0.5℃ / 24±2hr ] ※ UV등을 반드시 끈 상태에서 실험 진행
※ 시험관에 라벨링 할 것 ※ 접종 전 백금이는 화염멸균
6. 분석절차
6.1 추정시험
⑤ 배양이 끝나면 시험관을 꺼내어 양성(가스생성) 시험관을 체크하여 기록
⑥ 양성 시험관 수만큼 다음 단계 실험인 확정시험에 필요한 배지 (BGLB) 준비
6. 분석절차
6.1 추정시험
① 삼각플라스크에 필요한 양만큼 증류수와 배지(BGLB)를 혼합하고 마그네틱 바를 넣은 뒤 가열 교반기에 교반하며 가열
② 시험관에 배지 10mL씩 분주하고 다람관(듀람관) 작은 것을 시험관에 하나씩 넣고 시험관 입구를 캡으로 밀봉하고 Rack에 꽂아 호일로 멸균 중 캡이 분리되지 않도록 시험관의 윗부분을 감싼 뒤
autoclave(고압증기멸균기)에 넣어 멸균 (121℃ / 1.5atm / 15~20min) ※ 캡을 꽉 막지 않고 살짝 헐겁게
6. 분석절차
6.2 확정시험
③ 멸균이 되는 동안 크린벤치에 실험 초자기구들을 세팅해 두고 Fan과 UV등을 작동시켜 무균상태로 준비
※ Agar가 포함되지 않아 배지가 굳지 않으므로 미리 제조해도 무방
④ 무균상태인 크린벤치에서 실험시작 추정시험에서 양성(가스생성) 시험관
개수만큼 BGLB배지의 시험관을 세팅한 다음 3LB 시험관을 열어 1백금이 취해 BGLB 시험관에 털며 접종
※ UV등을 반드시 끈 상태에서 실험 진행 ※ 접종 전 백금이는 화염멸균
6. 분석절차
6.2 확정시험
⑤ 배양조건에 맞는 incubator에 배양한 다음 가스생성 시험관 수 기록
[ BGLB : 35.0±0.5℃ / 48±2hr ]
⑥ 가스가 생성된 시험관 수만큼 Endo배지 및 LB, NA배지 준비
6. 분석절차
6.2 확정시험
① 삼각플라스크에 필요한 양만큼 증류수와 배지(Endo)를 혼합하고 마그네틱 바를 넣은 뒤 가열 교반기에 교반하며 가열
② 가열이 끝난 뒤 autoclave(고압증기멸균기)에 넣어 멸균 (121℃ / 1.5atm / 15~20min)
6. 분석절차
6.3 완전시험
③ 멸균이 되는 동안 크린벤치에 실험 초자기구들을 세팅해 두고 Fan과 UV등을 작동시켜 무균상태로 준비
※
petri dish에 Endo배지라 표시
④ 멸균이 끝난 배지는 무균상태인 크린벤치에서 Endo배지로 표시해 둔 petri dish에 분주한 다음 굳힌 뒤 확정시험에서 가스가 생성된 시험관에서 1 백금이 취한 뒤 접종(streaking)하고 배양조건에 맞게 incubator에 배양
[ Endo : 35.0±0.5℃ / 24±2hr ] ※ UV등을 반드시 끈 상태에서 실험 진행
6. 분석절차
6.3 완전시험
⑤ 시험관에 LB배지(다람관有)와 NA배지(사면) 제조 [ LB배지 : 35.0±0.5℃ / 48±2hr ] [ NA배지 : 35.0±0.5℃ / 24±2hr ]
⑥ colony 형태 확인 : 전형적(금속광택) → 1 colony / 비전형적(붉은색) → 2 colony 젖당배지(LA)와 보통한천 사면배지(NA)에 접종
※ - 모든 시험은 음성대조군 시험을 동시에 실시 - 음성대조군 시험결과
: 음성으로 나왔을 경우에만 유효한 결과값으로 판정
6. 분석절차
6.3 완전시험
• 결과의 표기
- 총대장균군이 검출되지 않은 경우 :
먹는물 : 불검출/100 mL샘물, 먹는샘물, 먹는해양심층수, 염지하고, 먹는염지하수 : 불검출/250 mL
- 총대장균군이 검출된 경우 :
먹는물 : 검출/100 mL
샘물, 먹는샘물, 먹는해양심층수, 염지하고, 먹는염지하수 : 검출/250 mL
8. 결과보고
