사랑과 열정으로 더불어 함께 하는 세상 만들기 - 율촌재단(栗村財團)

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(1)유탕식품 중 다환방향족탄화수소 평가 및 공정요인 분석. 신 한 승. 동국대학교 식품생명공학과. 1. 총괄연구개발과제의 목적 및 필요성 1.1 총괄연구개발과제의 목표 ○ 최근 유럽식품안전청(European Food Safety Authority; EFSA)은 COMMISSION REGULATION (EU) No 835/2011에서 PAHs의 허용기준 설정 및 위해평가의 기준으로 benzo[a]pyrene이 사용되는 것에 타당성을 평가한 결과, benzo[a]pyrene이 검출 지표로 부족하다고 평가하여 4 개의 PAHs에 대한 기준을 추가하였다. 현행 EU 규정(COMMISSION REGULATION (EC) No 1881/2006)에서는 식품에 들어 있는 PAHs의 허용 한도량을 종류별로 구분하지 않고 PAHs를 대표하는 benzo(a)pyrene의 최대 허용량만을 규정하고 있다. 그러나 신규정은 기존 규정의 benzo(a)pyrene 최대 허용 함유량 이외 별도로 benzo(a)pyrene을 포함한 4가지 PAHs (benzo(a)pyrene, benz(a)anthracene, benzo(b)fluoranthene, chrysene)의 최대 허 용 한도량을 추가로 규정하고 있다.. ○ 국내 식품 중 PAHs의 기준 규격의 재평가가 필요함에 따라 식품에 따른 분석 방법을 검토하 고, PAHs의 오염실태의 파악 및 위해평가를 실시한다. PAHs와 같은 유해물질의 분석에 있어 서 중요한 요소로는 검체 채취, 시료 처리, 분석하고자하는 물질의 추출, 방해 물질로부터의 정제, 정성 및 정량이 가능한 분석기기의 선택 등이 고려되어야하며 지용성(lipophilic)인. 유탕식품 중 다환방향족탄화수소 평가 및 공정요인 분석. 545.

(2) PAHs의 특성을 고려하여 대상 식품군인 유탕처리제품의 특성에 맞는 PAHs 시료 전처리 조건 인 추출 및 정제 등의 과정을 선택하여 식품 중 PAHs를 정량하는 분석법에 대한 연구가 매우 중요하다.. ○ 다환방향족탄화수소(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)는 2개 이상의 벤젠고리를 가 지는 유기화합물로, 황색의 결정성 고체이며(Table 1), 300-600℃사이 온도에서 불완전 연소 시 생성되기 때문에 오염원은 매우 다양하다. 인위적 발생원으로는 경유, 휘발유 등 화석연료 를 사용하는 자동차의 배출가스, 석탄연소 배출물, 자동차 폐오일, 담배연기 등이 있으며 인위 적 발생원으로 인한 PAHs 오염이 훨씬 더 심각하다. 식품원에서는 굽기, 튀기기, 볶기 등의 조리, 가공 과정에 의한 탄수화물, 지방 및 단백질의 탄화에 의해 생성되며 농산물 등 조리가 공하지 않은 식품에도 존재한다(IARC, 1987). 생식품 특히 어류, 육류 등은 그들의 대사능력 (생물전환력, Bio-transformation) 으로 인해 PAHs 오염도가 낮으며, 야채, 과일류 등은 대 기 입자의 직접 또는 오염토양에서의 재배 등으로 오염된다. 대기오염에 의한 호흡노출 및 가 열조리 식품의 경구섭취가 주요 인체노출경로로 알려져 있다(식품의약품안전청, 2008).. 546. 2013년 기초연구과제총서.

(3) Table 1. Physical and chemical properties of Benzo[a]pyrene in PAHs 화학명. Benzo[a]pyrene. 화학구조. CAS. No.. 50-32-8. 화학식(formula). C20H12. 분자량. 252.31. 물리적 성상. 황색 결정성 고체. 녹는점. 179-179.3℃. 끓는점. 10 mmHg에서 310-312℃; 495℃. 용해도. 물; 2.3×10 mg/L 에탄올 및 메탄올에 드물게 용해; 벤젠, 톨루엔, 크실렌 및 에테르에 용해. 반응성. 산화제(격렬하게 반응 또는 유독/자극적인 연기 발생) 및 강산 (예, 황산 및 질산; PAHs 분해)과 incompatible. 안정성. 보통은 안정, 빛과 공기 중에 분해 유기 용매 안의 B[a]P 용액은 공기와 빛에서 어두워지고 천천히 산화. -3. 비중. 1.351 (water= 1) (3,17). 밀도. 1.351 g/cm3 (temp. not specifed). 증기압 옥탄올/물 분배계수 헨리상수. 5.6×10. -9. mmHg. Log Kow= 6.06 Log Koc= 6.74 4.9×10. -7. atm.㎥/mol. 유탕식품 중 다환방향족탄화수소 평가 및 공정요인 분석. 547.

(4) ○ PAHs는 내분비계장애물질이면서 발암가능물질로 잔류기간이 길고 독성도 강하여 Codex 및 JECFA(Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives)의 위해성평가를 위한 우 선순위 목록에 포함되는 등 세계적 관심의 대상 물질이 되고 있다. 국제암연구소(IARC: International Agency for Research on Cancer)는 최근 벤조피렌을 Group 1의 확인된 인 체발암물질 (carcinogenic to humans)로 등급을 상향조정 하였다(Table 2, Dabestani, 1999, EC, 2002, IARC 2006, IRIS. 1994).. Table 2. Agents classification by IARC(International Agency for Research on Cancer) monographs 확인된 인체 발암물질 (The agent is carcinogenic to humans). Group 1. 2A. 인체 발암추정 물질 (The agent is probably carcinogenic to humans) 인체 발암 증거가 제한적이거나 부정확하고, 실험동물의 발암 증거는 충분한 경우. 2B. 인체 발암가능 물질 (The agent is possibly carcinogenic to humans) 인체 발암 증거가 제한적이거나 부정확하고, 실험동물 발암증거도 충분하지 아니한 경우. Group 2. Group 3. 인체 발암성있는 물질로 분류할 수 없는 물질 (The agent is not classifiable as to its carcinogenicity into humans) 인체 및 실험동물 발암 증거가 제한적이거나 부정확한 경우. Group 4. 인체 비발암성 물질 (The agents is probably not carcinogenic to humans) 발암성을 증명할 증거가 부족한 경우. ○ PAHs 중 독성이 알려진 화합물에는 benzo(a)pyrene(B[a]P) 외 50 종이 밝혀졌고 특히 benzo(a)pyrene(B[a]P), benz(a)anthrace 등이 있다. Table 3은 US EPA에서 유해성 우선 물질로 선정한 16종의 PAHs 에 대한 화학적 특징을 나타낸다.. 548. 2013년 기초연구과제총서.

(5) Table 3. 미국 EPA가 유해성 우선 물질로 선정한 PAHs 16종 종류. 분자량. 화학식. 1. Naphthalene. 128. 2. Acenaphthylene. 3. 구조. 녹는점(℃). 끓는점(℃). C10H8. 80.2. 218. 152. C12H8. 92-93. 265-280. Acenaphthene. 154. C12H10. 90-96. 277-279. 4. Fluorene. 167. C13H9. 116-118. 293-295. 5. Anthracene. 178. C14H10. 96-101. 340. 6. Phenanthrene. 178. C14H10. 216-219. 339-340. 7. Fluoranthene. 202. C16H10. 107-111. 375-393. 8. Pyrene. 202. C16H10. 150-156. 360-404. 9. Benz[a]anthracene. 228. C18H12. 157-167. 435. 10. Chrysene. 228. C18H12. 252-256. 441-448. 11. Benzo[b]fluoranthene. 252. C20H12. 167-168. 481. 유탕식품 중 다환방향족탄화수소 평가 및 공정요인 분석. 549.

(6) Table 3. (Continued) 종류. 분자량. 화학식. 12. Benzo[k]fluoranthene. 252. 13. Benzo[a]pyrene. 14. 구조. 녹는점(℃). 끓는점(℃). C20H12. 198-217. 480-481. 252. C20H12. 177-179. 493-496. Dibenz[ah]anthracene. 278. C22H14. 275-278. 525. 15. Indeno[1,2,3-cd]pyrene. 276. C22H12. 162-163. -. 16. Benzo[ghi]perylene. 276. C22Hl2. 266-270. 524. ○ Polycyclic aromatic hydrocarbons(PAHs)는 폐기관, 위장기관 및 피부를 통하여 흡수되며 특히 폐의 흡수율은 PAHs의 형태, 흡수되는 입자의 크기 및 흡착제의 조성에 의존한다(IPCS, 1988). 위-장기에서의 흡수는 설치류에서 빨리 일어나며, 대사물질은 담즙 배설을 통하여 장 으로 들어가 PAHs의 대사로 탈독성화 되거나, 몇몇 PAHs 는 주로 종양을 야기할 수 있는 diol-epoxide로 활성화 된다. PAHs 대사산물과 그들의 공역체는 오줌이나 분으로 배설되며, 담즙에서 배설된 공역체는 장세균의 효소에 의해 가수분해 될 수 있으며, 재 흡수되어 PAHs 는 체내에 남아 있지 않게 된다(Fig.1)(ASTDR,1990).. 550. 2013년 기초연구과제총서.

(7) Fig.1. The major metabolic pathway of PAHs leading to the ultimate carcinogen. ○ PAHs는 기관지 점액층을 지나 폐를 통해 흡수된다. 일반적으로 PAHs는 세포의 지질 및 물에 구획을 갖고 침투확산을 통해 폐에 도달할 수 있는 지질화합물로 혈중 낮은 농도에서 hydrocarbons의 혈액과의 결합체를 통한 폐로부터 다른 장기로의 재분배는 확산이 속도결정 단계라는 것을 지시한다. 스며든 PAHs는 지방 용해화합물의 섭취를 통해 흡수된다.. ○ PAHs의 경구섭취 후 위 장관에서의 흡수율은 일부 기름(옥수수 유 등)에 의하여 증가한다. PAHs의 피부흡수 기전은 대부분이 층을 통한 수동적인 확산일 것이라고 추정되고 있다. PAHs와 그들의 대사체는 혈액을 통해 조직으로 분배되므로 PAHs는 노출 후 빠르게 조직으 로 확산되고 덜 관류한 조직에서는 더욱 느리게 제거된다. 경구로 흡수된 상당수의 PAHs가 흉관의 림프구 흐름을 경유하여 위 장관에서 혈중으로 지질단백질에 의해 수송된다.. ○ PAHs는 돌연변이와 종양의 개시를 이끄는 세포의 거대분자에 공유 결합하는 것보다 화학적으 로 반응 중간 생성물로의 생체변환을 통한 발암성을 표현한다. PAH 대사 생성물은 epoxide 중간물, dihydrodiols, phenols, quinones와 그들의 다양한 혼합물을 포함한다.. 유탕식품 중 다환방향족탄화수소 평가 및 공정요인 분석. 551.

(8) ○ PAHs의 bay 부위에서 diol epoxide 중간 생성물이 궁극적인 발암원이라고 생각된다. Diol epoxides는 쉽게 탄소이온들로 변환하여 알킬화합물로서 발암의 개시 및 돌연변이 역할을 한다. 그 러므로 PAHs의 발암성 및 독성은 그들의 대사체에 의존하지만, 종양을 유발하는 일부 PAHs에는 bay 부위가 없거나 단순히 bay 지역에서의 epoxide로서 활성을 지닌다고 볼 수는 없다. 이러한 화 합물이 서로 다른 기전으로서 발암성을 지닌다면 그들은 종양 위치와 종 특이성도 다를지도 모른다.. ○ PAHs의 bay 부위에서 diol epoxides로의 변환에 대한 필요조건으로 cytochrome P-450의 존재와 변환에 필요한 효소들과의 연합이다. 이러한 효소들을 간에서 일차적으로 발견할 수 있 지만 폐, 장 점막, 다른 조직에서도 효소들은 존재하므로 목표조직으로의 분배, 용해도, 이 효 소들과의 근접도와 같은 요인들이 PAHs의 발암성을 설명한다.. ○ 발암성과 P-450 동질효소 유도 능력간의 관계를 측정하기 위해서 일부 P-450 동질효소의 지 표를 benzo[a]pyrene과 benzo[e]pyrene로 배양한 세포질 미립체에서 측정하는데 두 PAHs 화합물이 몇 가지 P-450-I 활성의 요소들을 증가시켰으며 benzo[a]pyrene이 benzo[e]pyrene 보다 더욱 활성이 있다고 보고된바 있다.. ○ Cytochrome P-450 체계에서의 변화는 PAHs의 발암성에 영향을 줄 수 있다. 이러한 체계는 환경에서 일반적으로 존재하는 다른 화합물들과 마찬가지로 PAHs 그들 스스로에 의한 유도로써 받아들일 수 있다. 유도의 정도와 특이성은 조직과 종, 계통에 의존하며 특별히 PAHs의 대사에 중요한 효소인 AHH의 유도가 알려져 있다.. ○ 인간 유전자의 이질성에 따라서 AHH 유도에 감수성이 있는 집단은 더욱 암의 유도가 잘 일어 날 수 있다. 일단 bay 부근에서 epoxide가 형성되면 그것은 DNA 및 다른 세포 거대분자와 공 유 결합할 수 있으며 아마 돌연변이 및 발암 개시를 일으키는 것으로 추정된다. DNA 부가생성 물의 수치는 mouse의 피부, rat의 간과 폐에서 PAHs에 의한 발암성과 관련을 맺고 있다.. ○ Benzo[a]pyrene-DNA 부가물은 PAH가 유도하는 피부종양에 저항성을 보인다고 알려진 rat 의 피부에 존재하지 않는다. 다양한 benzo[a]pyrene 대사체를 rats에게 복강 투여하여 폐, 간, 림프구에서의 DNA 부가물을 측정하였는데 DNA와 결합하는 대사체들은 2-, 9- ,12hydroxybenzo[a]pyrene과 trans-7,8-dihydrodiol이다. in vivo의 조직 benzo[a]pyrene 대 사의 결과물인 서로 다른 DNA 부가물이 발암성의 조직 특이성과 관련이 있는 것으로 보인다.. 552. 2013년 기초연구과제총서.

(9) ○ PAHs가 유도하는 발암성에 대한 연구를 동물 모델과 in vitro에서 수행하였음에도 불구하고 인간의 in vitro 연구는 인간에서도 같은 활성의 기전을 포함할지도 모른다는 것을 지시한다. 세포의 변형과 암 유도에 필요한 모든 단계들을 배양한 인간 피부의 섬유 아세포에서 증명된 바 있다(AHH 활성, 변환된 세포 증식운동, DNA 손상). 그래서 인간도 아마 동물을 이용한 실험에서 밝힌 PAH가 유도하는 기전으로 발암성에 감수성이 있는 것으로 보인다. 발암원인 PAHs는 면역 기능에 효과를 보임으로서 발암유도를 일으키는 반면에 비발암성 PAHs는 면역 기능에 영향을 주지 않는다고 알려져 있다(Fig.2).. Fig. 2. Formation and carcinogenesis of PAHs. 유탕식품 중 다환방향족탄화수소 평가 및 공정요인 분석. 553.

(10) ○ PAHs는 설치류에서 유선 발암원으로 알려져 있으며 인간 유방암에도 해당될지도 모른다. Benzo[a]pyrene이 성장요소 경로를 흉내낼 수 있으며 인간의 일차 유선 표피 세포와 MCF-10A 세포에서 세포증식을 증가시킨다고 보고된바 있다. B[a]P의 중요한 대사물인 B[a]P-quinones (BPQs)는 산화반응물질 (ROS)의 생산과 연합되어 있으며 BPQ가 유도한 EGF receptor 활성과 세포증식의 연합은 EGFR receptor 억제제인 AG1478과 항산화제 N-acetyl cysteine으로 조절된다. PBQs가 과산화수소를 발생시켜 MCF-10A 세포 내 EGF receptor를 활성화시켜 EGF가 결여된 상황에서도 세포 숫자의 증식을 이끈다는 것을 지시한 다(Burdick et al., 2003).. ○ Mouse에 복강주사를 하여 구한 LD50은 약 250 mg/kg body weight이며 단기 노출실험 결 과 임신 중 투여는 기형 유발을 일으키는 것으로 알려져 있다(Embryo/Fetal toxicity and teratogenicity 참고).. ○ PAHs는 피부접촉, 흡입, 기관 내 및 기관지 투여, 피하 혹은 근육 주사, 그 밖의 다양한 다른 사용법에 의하여 여러 종의 동물들에 국소적인 발암성을 유발한다고 잘 알려져 있다. PAHs는 복강, 정맥, 태반 경유 주사, 경구 투여 후에도 종양을 유발한다. Benzo[a]pyrene는 국소적인 사용에 의한 것보다는 전신 투여에 의한 노출이 상대적으로 발암성이 적은 것으로 보인다 (IPCS).. ○ 급성 독성 실험에서 오직 benzo[a]pyrene 투여군의 수컷들만이 백혈구의 감소와 평균 세포헤모글로빈 농도 증가를 보인다. 체중에 대한 간 무게의 비율이 투여 군의 암, 수 모두에서 최 대 30 %까지 증가하였으며 혈중 화학성분(ALT, AST, BUN) 또는 요의 여러 요소들(glucose, bilirubin, pH, 단백질, urobilinogen, nitrite, leukocytes)은 의의 있는 영향이 없다. 만성 적 독성 연구에서 오직 benzo[a]pyrene 투여 군의 수컷들만이 평균 체중의 감소(13%)와 체중 에 대한 간 무게의 비율 증가를 보인다.. ○ 90일의 투여기간 후 몇 가지 혈중 화학성분이 암, 수 모두에서 의의 있게 감소하였다. RBC (Red blood cell, 최대 10%), Hct (Hematocrit, 최대 12%), 헤모글로빈 (최대 12%). 혈액 화학적 요소들(ALT, AST, BUN)에서는 오직 고용량 100 mg/kg/day 투여 군의 수컷에서만 BUN(blood urea nitrogen)이 의의 있게 증가하였다. 또한 조직학적 검사는 90일간 2개의 고 용량 투여 군내 수컷에서만 신장의 비정상성(요 원주)을 보여준 바 있다. Benzo[a]pyrene의. 554. 2013년 기초연구과제총서.

(11) 급 만성 독성이 상대적으로 낮은 편이며 benzo[a]pyrene이 특히 혈액요소와 장기에 영향을 주고 암컷보다는 수컷에서 더 큰 영향을 끼침이 보고된 바 있다. 수컷에서만 일어난 비 발암성 신장의 이상은 오직 신장 기능손상의 지표일지도 모르며 benzo[a]pyrene에 대한 내성의 성별 차이를 입증해 준다(Knuckles et al., 2001).. ○ US EPA는 benzo[a]pyrene을 인간에게서 발암성이 있을 것이라 보고 B2로 분류하였다. 인간 에게서 benzo[a]pyrene이 발암성이 있다는 자료는 부족하나 동물연구에서 다수의 benzo[a]pyrene 투여경로에 의한 발암성을 입증하였다(EPA).. ○ 담배연기, 지붕 재, 요리 오븐 재를 포함하여 PAHs를 함유하고 있다고 알려진 다양한 polycyclic aromatic hydrocarbons 혼합물은 인간에게 폐암을 유도하였다. 그러나 이러한 정보로써 PAHs가 발암성에 어느 정도 영향을 줄지를 측정할 수는 없다(EPA).. ○ Mice, rats, hamsters에게 B[a]P를 사료 투여 혹은 위관영양 투여시킨 결과 위의 종양이 증 가하였다. Neal과 Rigdon(1967)은 CFW-Swiss mice의 암, 수컷에게 benzo[a]pyrene을 사 료에 0,1, 10, 20, 30, 40, 45, 50, 100, 250 ppm으로 넣어 먹였는데. Mice의 나이는 17-180일로 다양하게 분포하였으며 처리기간은 1-197일이다. 위의 종양이 0, 1, 10 ppm에 서는 보이지 않았으나 20, 30, 40, 45, 50, 100, 250 ppm에서는 각각 1/23, 0/37, 1/40, 4/40, 23/34, 19/23, 66/73의 비율로 생성되었다. Control 그룹의 선위 종양 자료는 CFW-Swiss 종에서 찾을 수 없었는데 관계된 자료로서 SWE/J Swill 00,controls는 수컷 암 컷에서 각각 선위 종양이 2/268, 1/402 비율로 존재하였다(EPA).. ○ Brunce 등(1981)은 benzo[a]pyrene을 caffeine 위관 영양법에 의해 Sprague-Dawley rats 에 경구투여 하였다. Rats이 죽거나 거의 죽어갈 때까지만 투여하였으며, 위관 투여하는 rats 를 3개의 그룹 당 성별로 각각 32 마리의 rats로 구성하였다. 0.15 mg/kg을 A조는 9일마다, B조는 3일마다. C조는 한 주에 5일씩 투여하였다. 이러한 처리로 인해 매년 평균 투여 용량은 6, 18, 39 mg/kg으로 추정된다. Control 그룹을 그룹 당 성별로 각각 32마리로서 비 투여 controls와 위관 영양 투여 controls로 구성하였다. 평균 생존 기간은 비 투여 controls, 위관 영양 투여 controls, A조, B조, C조 순으로 129, 102, 112, 113, 87 주었다. C조의 생존율 이 특히 짧았으며 이로 인해 종양 형성의 발생을 방해했을지도 모른다고 판단되며 선위, 식도, 후두에서의 종양 발병률은 비 투여 controls, 위관 영양 투여 controls, A조, B조, C조 순으. 유탕식품 중 다환방향족탄화수소 평가 및 공정요인 분석. 555.

(12) 로 3/64, 6/64, 13/64, 26/64, 14/64이었다. 투여 용량과 종양 발생과의 관계는 자료적으로 의의가 있었으나 직선관계는 아니었다(EPA).. ○ Brunce 등 (1981)은 benzo[a]pyrene을 사료에 0.15 mg/kg으로 넣어 그룹 당 성별로 9일마 다 혹은 5번/1주 각각 32마리에게 주었다. Rats가 죽거나 거의 죽어갈 때까지만 투여하였다. 생존율은 모든 그룹에서 비슷하였다. 종양과 관련하여 (선위, 식도, 후두) 종양은 3/64, 3/64, 10/64의 비율로 control 군, 9일마다 처리 군, 주 5일 처리 군에 각각 존재하였다. 실험분석 은 동물들에서 선위, 식도, 후두의 종양이 benzo[a]pyrene 투여 용량에 비례하여 일어남을 보 여주었다(EPA).. ○ 유럽식품안전청(European Food Safety Authority; EFSA)은 유럽에서 판매되고 있는 식품들 을 13개의 category, 33개의 subcategory로 나누어 PAHs mornitoring 결과를 분석하였다. 13개의 category는 1) Cereals and cereal products, 2) Sugar and confectionery, 3) Fats and oils, 4) Vegetables, nuts and pulses, 5) Starchy roots and tubers, 6) Fruits, 7) Non-alcoholic beverages, 8) Coffee, tea and cocoa, 9) Alcoholic beverages, 10) Meat and meat products, 11) Fish and seafood, 12) Milk and dairy based products,13) Miscellaneous/food for special use 이다.. ○총. 9714개의. 시료. 중. 16. PAHs. (benzo[a]pyrene, chrysene, benzo[a]anthracene,. benzo[b]fluoranthene, benzo[j]fluoranthene benzo[k]fluoranthene, benzo[ghi]perylene, dibenz[a,h]anthracene, cyclopenta[cd]pyrene, dibenzo[a,l]pyrene, dibenzo[a,e]pyrene, dibenzo[a,i]pyrene, dibenzo[a,h]pyrene, indeno[1,2,3-cd]pyrene, 5-methylchrysene, benzo[c]fluorene)모두를 조사한 시료는 823 개이며, 15 PAHs (benzo[a]pyrene, chrysene, benzo[a]anthracene, benzo[b]fluoranthene, benzo[j]fluoranthene benzo[k]fluoranthene, benzo[ghi]perylene, dibenz[a,h]anthracene, cyclopenta[cd]pyrene, dibenzo[a,l]pyrene, dibenzo[a,e]pyrene, dibenzo[a,i]pyrene, dibenzo[a,h]pyrene, indeno[1,2,3-cd]pyrene, 5-methylchrysene)를 조사한 시료는 1375개, 8 PAHs를 조사한 시료는 4065개 이었다.. ○ Benzo[a]pyrene은 시료의 50%에서 발견되었으며, chrysene은 60%의 시료에서 검출됨. benzo[a]pyrene이 검출되지 않은 나머지 50%의 시료 중 30%에서 발암성 및 유전독성을 나타 내는 15 PAHs 가 검출되었다.. 556. 2013년 기초연구과제총서.

(13) ○ 15 PAHs를 분석한 시료 중에서, benzo[a]pyrene은 8%를 차지했다. 2 PAHs (benzo[a]pyrene and chrysene) 은 34%, 4 PAHs (benzo[a]pyrene, chrysene, benzo[a]anthracene and benzo[b]fluoranthene)은 60%, 8 PAHs (benzo[a]pyrene, chrysene, benzo[a]anthracene, benzo[b]fluoranthene, benzo[k]fluoranthene, benzo[ghi]perylene, dibenz[a,h]anthracene and indeno[1,2,3-cd]pyrene) 은 80%로 나타났다.. ○ 4 PAHs 또는 8 PAHs의 검출 결과는 benzo[a]pyrene과 2 PAHs가 PAHs의 검출지표가 되 기에 부족함을 의미한다. 그러나 8 PAHs가 15 PAHs 중에 80%를 차지한다고 하여도, 4 PAHs의 결과와 비교하였을 때, 큰 차이를 보이지 않아 EFSA는 4 PAHs를 PAHs의 검출지표 로 지정하였다(EFSA,2008).. ○ 유럽식품안전청(European Food Safety Authority; EFSA)은 benzo[a]pyrene 과 추가 4 PAHs에 대하여 최대 허용 한도량을 지정하여 2012년 9월 1일부터 적용되었다(Table 4).. Table 4. 유럽식품안전청의 식품 분류 별 4 PAHs의 최대 허용량 기준규격(2011년) 식품 카테고리. 최대 허용량(Maximum levels, ㎍/㎏). Benzo(a)pyrene, benz(a)anthracene, benzo(b)fluoranthene, chrysene Oils and fats(excluding cocoa butter and coconut oil) intended for direct human consumption or uses as an ingredient in food(오일과 지방유지). Cocoa beans and derived products (코코아콩과 그 제품). Benzo(a)pyrene. Sum of benzo(a)pyrene, benz(a)anthracene, benzo(b)fluoranthene, chrysene. 2.0. 10.0. 2013.4.1.부터 5.0 ㎍/㎏ fat. Coconut oil intended for direct human consumption or use as in ingredient in food (코코넛 오일). 2.0. - 2013.4.1.부터 2015.3.31.까지 35.0 ㎍/㎏ fat - 2015.4.1.부터 30.0 ㎍/㎏ fat 20.0. 유탕식품 중 다환방향족탄화수소 평가 및 공정요인 분석. 557.

(14) 식품 카테고리. 최대 허용량(Maximum levels, ㎍/㎏). Smoked meat and smoked meat products (훈제고기 및 그 제품). - 2014.8.31.까지 5.0 - 2014.9.1.부터 2.0. - 2012.9.1.부터 2014.8.31.까지 30.0 - 2014.9.1.부터 12.0. Muscle meat of smoked fish and smoked fishery products, excluding fishery products listed in points 6.1.6 and 6.1.7. The maximum level for smoked crustaceans applies to muscle meat from appendages and abdomen. In case of smoked crabs and crab-like crustaceans(Brachura and Anomura) it applies to muscle meat from appendages (훈제 생선, 갑각류 근육부분으로 제조된 제품). - 2014. 8. 31.까지 5.0 - 2014. 9. 1.부터 2.0. - 2012. 9. 1.부터 2014. 8. 31.까지 30.0 - 2014. 9. 1.부터 12.0. Smoked sprats and canned smoked sprats(sprattus sprattus) : bivalve molluscs(fresh, chilled or frozen) ; heat treated meat and heat treated meat products sold th the final consumer (훈제 청어 및 훈제 쌍각류 연체동물 통조림). 5.0. 30.0. Bivalve molluscs(smoked) (훈제 쌍각류 연체동물). 6.0. 35.0. Processed cereal-based foods and baby foods for infants and young children (곡물 제품과 유아식품). 1.0. 1.0. Infant formulae and follow-on formulae, including infant milk and follow-on milk (영유아용 조유 포함한 영유아용 조리 식품). 1.0. 1.0. Dietary foods for special medical purposes intended specially for infants (특수 유아용 식이용법용 식품). 1.0. 1.0. 558. 2013년 기초연구과제총서.

(15) ○ 유탕처리과정의 유지의 경우 올리브, 대두, 목화씨, 참깨 등의 식물의 열매 또는 종자를 이용 한다. 식물성 원료에 환경오염에 의해 생성된 PAHs가 혼입되거나 또는 유탕처리제품의 생산 과정에서 PAHs가 생성될 가능성이 있다. 유탕처리제품에서 주로 사용하는 유지류는 일반적으 로 세척, 건조 및 배전, 볶음, 착유, 병입 및 포장공정을 거치게 되는데 이 때 열을 사용하는 건조 및 배전공정과 볶음 공정에서 PAHs 생성 가능성이 있다.. Fig. 3. The manufacture processing of oils and possible PAH formation during processing.. ○ 유탕처리제품 중 PAHs와 같은 유해물질의 분석에 있어서 중요한 요소로는 검체 채취, 시료 처리, 분석하고자 하는 물질의 추출, 방해물질로 부터의 정제, 정성 및 정량이 가능한 분석기 기의 선택 등이 고려되어야 하며 지용성(lipophilic)인 PAHs의 특성을 고려하여 각 식품군의 특성에 맞는 PAHs 시료 전처리 조건인 추출 및 정제 등의 과정을 선택하여 식품 중 PAHs를 정량하는 분석법에 대한 연구가 매우 중요하다.. 유탕식품 중 다환방향족탄화수소 평가 및 공정요인 분석. 559.

(16) Fig. 4. 식품의 유탕가열 공정 중 이화학적 변화. ○ 따라서 본 연구에서는 유탕처리제품의 PAHs의 시료 전처리 조건 확립 및 기기분석조건의 확 립을 바탕으로 식품군에 대한 PAHs의 오염실태를 파악하고 국제허용기준(Codex) 및 선진국 (EU 및 USA) 기준과 비교, 검토하여 식품의 안전관리를 위한 PAHs의 실태조사와 같은 안전 성 평가를 시행하여 국민건강의 안전성을 확보하고자 하였다.. ○ 유탕식품의 유탕처리 공정에서. PAH의 생성에 영향을 미칠 수 있는 가능 요인들을 (예: 유탕. 처리 온도, 유탕처리 시간, 유탕식품 원료 등) 파악하여 유탕식품 생산 공정의 안전성을 향상 시킬 수 있는 방안을 제시하였다.. 560. 2013년 기초연구과제총서.

(17) 1.2 총괄연구개발과제의 목표달성도 ○ 국내 식품 중 농심의 유탕처리제품에 대한 PAHs 실태조사 자료수집 및 안전성 검토를 수행하 였다.. ○ 국내 식품 중 PAHs (benzo[a]anthracene, chrysene, benzo[b]fluoranthene, benzo[a]pyrene) 분석을 위해 기기별 분석과 기기분석 방법을 검증하여 분석방법을 최적화 하였다.. ○ PAHs 시험법 검증을 위하여 회수율, 정확성, 정밀성, 직선성, 검출한계 및 정량한계 등의 밸 리데이션을 실시하였다.. ○ 농심의 유탕처리제품 51건을 대상으로 PAHs 함량 모니터링 조사를 실시하였다.. ○ 유탕식품 생산공정의 공정요인 분석: 유탕식품의 유탕처리 공정에서. PAHs의 생성에 영향을. 미칠 수 있는 가능 요인들을 (예: 유탕처리 온도, 유탕처리 시간, 유탕식품 원료 등) 파악하여 유탕식품 생산공정의 안전성을 향상시킬 수 있는 방안을 제시하였다.. 1.3 총괄국내·외 기술개발 현황 1.3.1. 국외 기술개발 현황 ○ US EPA는 benzo[a]pyrene(B[a]P)을 인간에게서 발암성이 있을 것이라 보고 B2로 분류하였 다. 인간에게서 B[a]P가 발암성이 있다는 자료는 부족하나 동물연구에서 다수의 B[a]P 투여경 로에 의한 발암성을 입증하였다(EPA).. ○ 담배연기, 지붕 재, 요리 오븐 재를 포함하여 PAHs를 함유하고 있다고 알려진 다양한 polycyclic aromatic hydrocarbons 혼합물은 인간에게 폐암을 유도하였다. 그러나 이러한 정보로서 PAHs가 발암성에 어느 정도 영향을 줄지를 측정할 수는 없다(EPA).. ○ 유럽식품안전청(European Food Safety Authority; EFSA)은 COMMISSION REGULATION (EU) No 835/2011에서 PAHs의 허용기준 설정 및 위해평가의 기준으로 benzo[a]pyrene이 유탕식품 중 다환방향족탄화수소 평가 및 공정요인 분석. 561.

(18) 사용되는 것에 타당성을 평가한 결과, benzo[a]pyrene이 검출 지표로 부족하다고 평가하였다. 따라서 4개의 PAHs에 대한 기준을 추가하고 기존 규정의 benzo(a)pyrene 최대 허용 함유량 이외 별도로 benzo(a)pyrene을 포함한 4가지 PAHs (benzo(a)pyrene, benz(a)anthracene, benzo(b)fluoranthene, chrysene)의 최대 허용 한도량을 추가로 규정하고 있다.. ○ 호주, 뉴질랜드 FSANZ에서 발표된 Survey of polycyclic aromatic hydrocarbons(PAHs) in Australian foods(White, et al. 2004)에서는 모든 식품군에 대하여 내부표준물질로 Isotopically labelled surrogate standards를 사용, 알칼리 분해 후 유기용매로 추출하고 formin acid와 silica gel column chromatography로 정제과정을 거쳐 HRGC/LRMS로 분 석했다.. ○ EFSA 논문인 Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Food(The EFSA Journal(2008)724, 1-114)에서. 분석방법은. 13. C-labelled PAHs를 내부표준물질로 하여 고체 식품이 시료인 경. 우 알칼리 분해, 유기용매로 액-액 추출을 많이 사용하고, 기름과 같은 액체가 시료인 경우 액-액 추출법을 많이 사용한다. 고체식품의 경우 pressurised liquid extraction(PLE), supercritical fluid extraction(SFE)법도 있지만 자주 쓰이지는 않는다. PAHs의 분리를 위한 정제법으로 column chromatography(GC), solid phase extraction(SPE), gel permeation chromatography(GPC)가 쓰인다. 분석기기로는 HPLC/FLD, GC/MS를 많이 사용한다.. 1.3.2. 국내 연구동향 ① 2008년 식품의약품안전청의 ‘가공식품 중 PAHs 모니터링 및 위해평가’ 에 따르면 훈제식·어육, 분유에서 PAHs를 검출하기 위해 알칼리분해방법으로 추출, Sep-Pak Florisil Cartridge로 정제하여 질소농축 후 acetonitrile 1mL로 녹여 0.45㎛ membrane filter를 통과시켜 HPLC/FLD용 시험용액으로 사용하였다. 실험에서 사용된 HPLC/FLD의 조건은 다음과 같다 (Table 5). 30종의 식품군 중 26종의 식품군에서는 8종의 PAHs가 모두 불검출이었으며, 돼지고기 석쇠 구이에서 benzo(b)fluoranthene이 1.3 ㎍/kg 로 가장 많이 검출되었다.. 562. 2013년 기초연구과제총서.

(19) Table 5. Operating condition of HPLC/FLD for PAHs analysis. Column. Supelcosil LC-PAH column (25 cm ⨉ 4.6 mm, I.D. 5 ㎛ with Supelguard LC-18. Column Temp.. 35℃. Flow rate. 1.0 ㎖/min. Solvent system. 0 min 20 min 25 min 27 min 40 min. Injection volume. 10㎕. Wavelength (Ex/Em). 0-15 min 15-26 min 26-40 min. ACN 80 % 100 % 100 % 80 % 80 %. H 2O 20 % 0 % 0 % 20 % 20 %. 254 nm/390 nm 260 nm/420 nm 293 nm/498 nm. ② 2009년 식품의약품안전청의 ‘수산물의 PAHs 모니터링’에 따르면 수산물에서 PAHs를 검출하 기 위해 시료를 알칼리 분해 후 n-hexane으로 추출하고 증류수로 세척한 다음 Sep-Pak Florisil Cartridge로 정제하여 GC/MS로 분석하였다. 실험에서 사용된 GC/MS의 조건은 다 음과 같다(Table 6). 총 280건의 수산물(어류, 두족류, 갑각류, 패류)에 대한 16종의 PAHs를 분석한 결과 어류의 평균 총 PAHs 함량은 0.29 ㎍/kg 였으며, 패류는 1.52 ㎍/kg, 두족류와 갑각류는 1.29 ㎍ /kg 이었다.. 유탕식품 중 다환방향족탄화수소 평가 및 공정요인 분석. 563.

(20) Table 6. Operating condition of GC/MS for PAHs analysis Column. DB 5MS (30m length 0.25mm, 0.25㎛). Carrier Gas. He, Constant flow = 1㎖/min. Injection volume. 1㎕, splitless. Temperature Program. 80℃/min→5℃/min→200℃(20min). Transferline temperature. 280℃. Source temperature. 200℃. Electron energy. 70eV. Ionization mode. EI. Detector. MS, SIM, 7 windows. ○ 국내에서는 식품 중 벤조피렌의 모니터링에 대한 연구로만 국한 되어 있고, 유탕처리 된 제품 의 PAHs의 오염도에 대한 오염도 모니터링 및 안전성 평가 연구는 지속적으로 필요하다.. ○ 따라서 국내에서 유통되는 농심의 유탕처리제품에 대한 PAHs함량에 대한 객관적인 오염도 모 니터링실험의 발암성 PAHs의 분리, 정제, 데이터베이스 구축이 필요하다.. 1.4 총괄연구개발과정에서 수집한 국외과학기술정보 ○ EFSA(European Food Safety Authority)가 18개국을 대상으로 실시한 조사에 따르면 식품 내의 벤조피렌을 포함한 PAHs 분석 시, 전체 조사 대상 중 43%가 GC/MS를 사용하고, 54% 가 HPLC/FLD 또는 HPLC-UV/FLD를 사용하고 있음을 보고했다(EFSA 2008).. ○ EFSA에서 95 Codex food category에 근거한 분류에 따른 식품 중에서의 benzo[a]pyrene을 포함한 PAHs의 함량 실태조사 결과, 약 47%의 검체에서 검출한계 이상의 PAHs가 검출되었 다. 각 카테고리별 대표 시료를 선정, 모니터링하여 검출한계 이상, 1, 2, 5, 10 µg/kg 이상 검출된 시료의 비율을 나타내고 benzo[a]pyrene의 농도를 중앙값과 평균 등을 함께 나타냈다 (EFSA 2008).. 564. 2013년 기초연구과제총서.

(21) ○ 2007년 Food Chemistry에 발표된 논문인 Validation(in-house and collaborative) of a method based on liquid chromatography for the quantitation of 15 European-priority polycyclic aromatic hydrocarbons in smoke flavourings: HPLC-method validation for 15 EU priority PAH in smoke condensates (104:876-887)에 따르면 GC/ MS를 이용한 15가지의 PAHs 동시 분석법이 개발되고 밸리데이션 되었지만, 그 방법은 두 이성질체인 benzo[j]fluoranthene 과 benzo[k]fluoranthene을 분류하는데 적합하지 않았다. 또한 법적 분쟁에 있어서 긍정적인 결과를 도출할 만한 독립적인 방법이 필요하므로 HPLC-UV/FLD를 이용한 분석법을 개발하고 밸리데이션 할 수 있는 방법을 개발하는 것이 필요하다고 보고하였다.. ○ 시료의 전처리는 샘플을 스파이킹 된 매트릭스 샘플을 사용하였으며 스파이킹 솔루션은 분석물 질이 희석된 헥산 용액에 들어있는 것으로 준비했다. 그리고 스탁 솔루션과 헥산, 매트릭스와 의 혼합성을 고려하여 2-propanol을 분석물질의 용매로 사용했다. 스파이킹 솔루션은 2-propanol에 들어있는 1 mL의 분석물질 용액을 사용하여 만드는데, 스파이킹 할 때 분석물 질의 양은 공시료와 5, 10 µg/kg으로 하였다. 10 g의 액체 smoke condensate를 알칼리 메 탄올 (3.2 g KOH와 32 mL MeOH의 혼합물)에서 30분동안 환류시킴으로써, 페놀과 같은 방 해물질을 비누화시켰다. 이를 cyclohexane 25 mL로 3회 추출하였다. 유기층만을 모아 무수 황산 나트륨으로 수분을 제거하고, rotary evaporator(T= 40℃, p= 100 mbar)로 유기층을 제거하였다. 이를 다시 500 µL의 cyclohexane에 녹여, 2 mL cyclohexane으로 활성화된 silica cartridge에 용출시켰다. 또 다른 500 µL의 cyclohexane으로 플라스크를 세척 후 카트 리지에 용출하며 이 때 첫 번째 용출액은 버렸다. 카트리지를 7 mL의 cyclohexane으로 용출 시킨 후 모아진 용출액을 rotary evaporator를 이용하여 용매를 제거하였다. 다시 1 mL의 acetonitrile을 넣고 1분간 교반하여 녹인 후 amber vial에 옮겨 시험액으로 사용하였다. 전 처리과정의 모식도는 Fig. 5와 같으며 분석 조건은 Table 7과 같다.. 유탕식품 중 다환방향족탄화수소 평가 및 공정요인 분석. 565.

(22) 10 g의 시료를 KOH·MeOH로 30분간 비누화 (페놀과 같은 방해물질의 제거를 위함). 󰀻 cyclohexane 25 mL로 3회 추출. 󰀻 유기층만을 모아 무수 황산 나트륨으로 수분을 제거. 󰀻 Rotary evaporator (T= 40℃, p= 100 mbar)로 유기층을 제거. 󰀻 500 µL의 cyclohexane에 녹여, 2 mL cyclohexane으로 활성화된 silica cartridge에 용출. 󰀻 또 다른 500 µL의 cyclohexane으로 플라스크를 세척 후 카트리지에 용출. 이 때 첫 번째 용출액은 버림. 󰀻 카트리지를 7 mL의 cyclohexane으로 용출. 󰀻 모아진 용출액을 rotary evaporator를 이용하여 용매 제거. 󰀻 1 mL의 acetonitrile을 넣고 1분간 교반하여 녹인 후 amber vial에 옮겨 시험액으로 사용. 󰀻 HPLC-UV/FLD Fig. 5. The procedure of PAHs determination (Food Chemistry(2007) 104:876-887).. 566. 2013년 기초연구과제총서.

(23) Table 7. The operation conditions of PAHs analysis (Food Chemistry(2007) 104:876-887) HPLC. Agilent 1100 series. Column. Pinacle Ⅱ reversed phase column for PAHs 250 x 2.1 mm, 5 µm. Injection volume. 20 µL. Flow rate. 0.3 mL / min. Mobile phase. Acetonitrile (%). Water (%). 0min. 80. 20. 30 min. 85. 15. 40 min. 100. 0. 60 min. 100. 0. 80 min. 80. 20. UVD wavelength FLD wavelength. 375 nm. 0-80 min. excitation. emmission. 270 nm. 370/420/470/500 nm (simultaneous). 또한 벨리데이션은 농도가 50-250 ng/mL 되는 농축액을 세 개 만들고 직선성의 검증과 변 화량의 동질성 확인, LOD와 LOQ는 German norm DIN 32645(DIN, 1994)를 따랐다. 회수 율과 정확성은 두 가지 방법으로 측정될 수 있는데 첫 번째는 스파이킹 한 공시료 매트릭스 샘플을 다섯 개의 레벨로 나누고 회수율을 측정된 정도와 예상된 정도의 비율을 이용해 계산 하는 것이다. 표준편차는 모든 도출된 값의 평균으로부터 계산하였다. 두 번째는 회수율과 그 와 관련된 표준편차가 다섯 개의 스파이킹 샘플과 fisher test로 얻은 변화량의 균질성에 따라 계산하였다.. ○ EFSA(European Food Safety Authority)가 2008년 보고한 자료에 따르면 식품으로부터 PAHs를 추출하는 방법은 그 식품의 matrix나 성질에 따라 좌우된다. 액-액 추출법과 유기용 매에 따른 비누화는 육류나 생선과 같은 고체상 식품에 주로 이용되는 방법이며, 액-액 추출 법은 식물성 기름과 같은 액체상 식품에도 이용되고 있다. 고체상의 식품들은 pressurised 유탕식품 중 다환방향족탄화수소 평가 및 공정요인 분석. 567.

(24) liquid extraction(PLE), supercritical fluid extraction(SPE)와 같은 추출기술로도 자동화 될 수 있으나 그 적용은 많지 않다. Column chromatography, solid phase extraction(SPE), gel permeation chromatography(GPC)는 방해물질로부터 PAHs를 분리해내는 주된 시료 정 제 기술이다. 특히 최근에는, PAH를 추출하여 정제하는 방법으로 자동화 GPC기술이 이용되 고 있다(Fontcuberta et al., 2006; Llobet et al., 2006; Fromberg et al., 2007; Renik et al., 2007).. ○ 요즘 식품에서 PAHs를 확인하기 위한 두 가지 주된 분석 방법은 HPLC/FLD와 GC/MS이며 두 방법 모두 식품에서 PAHs를 검출하는 데 있어서 충분히 감도가 좋은 방법이다. 초기에는 HPLC/UV나 HPLC/PDA, GC/FID로도 PAHs를 검출하였지만 선택성과 감도가 떨어지는 이 유로. 오늘날에는. 거의. 이용되지. 않는다.. GC. 방법에서. Programmed. Temperature. Vaporization(PTV) 주입법은 많은 양의 시료를 주입할 수 있어서 보다 낮은 검출한계를 나타 내며, 온라인 방법은 PAH 분석의 분석적 절차를 단순화 시키는데, 그 이유는 몇가지 시료 전 처리 단계를 생략할 수 있기 때문이다. 온라인 방법에서의 시료 추출은 HPLC/FLD 시스템의 분석 컬럼에 결합되어 있는 donor-acceptor 복합체 크로마토그래피 컬럼에 주입하여 사용한 다(van der Wielen et al., 2006; ISO, 2007).. ○ PAHs의 검출한계와 회수율은 혼합물, food matrix, 실험방법에 의존적이다. PAHs의 검출한 계는 보통 0.1에서 1 µg/kg이지만, 일부 PAHs는 더 낮거나 높은 검출한계를 보이며 심지어 20 µg/kg 까지 도출된다(EFSA 2007). MS/MS의 높은 선택성 때문에 MS/MS의 방법에서는 검출한계가 0.1 µg/kg보다 낮은 값을 보인다(Varlet et al., 2007). 식품에서의 대부분의 PAHs의 회수율은 HPLC와 GC 방법 모두에서 70% 이상을 보여주지만 일부 PAHs의 회수율 은 그보다 낮게 나타난다(FAO/WHO, 2006).. 568. 2013년 기초연구과제총서.

(25) 2. 총괄연구개발과제의 내용 및 방법 2.1. 주요 연구 내용. 2.1.1. 연구내용 1) 식품 중 PAHs 분석법 검토 유탕식품 중 PAHs 분석 전처리 조건의 검토를 실시한다. 그리고 기기 분석 조건을 검토하는데, HPLC/FLD, GC/MS 등 기기분석 조건 상호 비교검토를 실시하고, 시험법 validation(회수율, 정량한 계, 검출한계, 크로마토그램)을 작성한다.. (가) GC/MS를 이용한 유탕식품 중 PAHs 시험법 평가 a) 전처리 조건 시험법 확립 - 추출 및 정제 약 10 g의 시료를 전자저울을 사용하여 정밀히 달아 내부표준용액(B(a)P-d12) 100. µg/kg을 400 µL 첨가하고 n-hexane 100 mL에 녹여 분액깔대기(Ⅰ)에 옮긴다. 분액 깔대기(Ⅰ)에 N,N-dimethylformamide(DMF): water(9:1) 50 mL를 넣어 흔들어 섞 은 후 정치하여 DMF: water(9:1)층을 분해하여 다른 분액깔때기(Ⅱ)에 옮긴다. n-hexane에 DMF: water(9:1) 25 mL씩을 넣고 위와 같이 2회 되풀이하여 DMF: water(9:1)층을 분액깔대기(Ⅱ)에 합친 후 여기에 1% 황산나트륨 용액 100 mL를 넣어 섞고 n-hexane 50 mL를 넣어 흔들어 섞은 후 정치하여 n-hexane층을 분액깔때기 (Ⅲ)에 옮긴다. DMF: water(9:1)층에 n-hexane 35 mL씩을 넣고 위와 같이 2회 되 풀이하여 n-hexane층을 위의 분액깔때기(Ⅲ)에 합친다. Water 40 mL씩을 넣고 흔들 어 섞은 후 정치하여 water층 버리는 조작을 2회 되풀이한다. 층 분리가 잘 안될 경우 1시간 정도 방치한 후에 층 분리를 하였다. n-hexane층을 무수황산나트륨 약 15 g을 넣은 여과지를 사용하여 탈수여과 한 후 40℃ 이하의 수욕상에서 감압하여 약 2 mL로 농축한다. Sep-Pak silica gel cartridge는 미리 dichloromethane 10 mL 및 n-hexane 20 mL를 초당 2-3방울의 속도로 유출시킨 후 사용한다. 이 cartridge에 위의 농축액을 1 mL/min의 속도로 가한다. n-hexane 5 mL와 n-hexane:. 유탕식품 중 다환방향족탄화수소 평가 및 공정요인 분석. 569.

(26) dichloromethane (3:1) 15 mL로 각각 용출시킨 후 이 용출액을 40℃ 이하의 히팅블 럭에서 질소가스 하에 날려 보낸 후 잔류물을 dichloromethane에 녹여 전량은 200 µL 로 하고 이를 0.45 μm membrane filter로 여과하여 시험용액으로 사용한다.. b) 기기분석 - GC/MS의 측정조건 유탕식품 중 PAHs 분석을 위해 사용한 GC는 Agilent Technologies 6890N을 사용하 였으며 MS는 5975 MSD를 사용하였다. 분리를 위한 컬럼은 HP-5MS (30m x 0.25mm I.d. x 0.25µm film)을 사용하였고 오븐 온도프로그램은 다음과 같다; 100℃ (10 min) → 280℃(60℃/min, hold 10min) → 310℃(10 min, post run) 이동상 기 체로는 헬륨을 1.5 mL/min의 속도로 흘려주었다. MS source와 ms quadrupole 온도 는 각각 250℃, 180℃를 유지하였으며, SIM 모드로 분석하였다. Benzo[a]anthracene target ion은 228 m/z, qualifier는 226, 229 m/z, Chrysene target ion은 228 m/z, qualifier는 226, 229 m/z, Benzo[b]fluoranthene target ion은 252 m/z, qualifier는 253, 250 m/z, Benzo[a]pyrene 검출을 위한 target ion은 252 m/z, qualifier는 250, 253 m/z, Benzo[a]pyrene-d12 분석을 위한 m/z는 264, 260, 265 m/z로 설정하였다.. (나) HPLC/FLD를 이용한 유탕식품류 중 PAHs 시험법 확립 a) 시료 전처리 및 추출과정 알칼리분해시간에 따른 분해 효율: 계속적인 알칼리분해가 PAHs를 휘발시켜 분해효율을 감 소시킬 수 있으므로 1, 2, 3, 4, 5시간의 알칼리분해시간중의 회수율을 평가하여 최적의 알칼 리분해시간을 선정한다. 벤조피렌은 비극성이어서 극성도가 낮은 용매에서 추출 회수율이 높다. 추출용매에 따른 추출 효율: 액-액 추출 (liquid-liquid extraction) 과정에서 낮은 점도 와 끓는점이 낮은 용매가 유리하므로 toluene, cyclohexane, n-hexane등의 용매를 사용하 여 액-액 추출 효율을 평가함.. b) 시료정제과정 정제칼럼의 분액별 용출효율평가: 비극성인 PAHs와 극성방해물질의 분리에 효과적인 정제 카트리지로 알려진 florisil, silicagel, alumina A, B, N column을 이용하여 비교적 약한. 570. 2013년 기초연구과제총서.

(27) 극성을 가진 용매로 용출시킬때 극성방해물질과 분리시켜 정제시킬 수 있는 회수율이 높은 정제카트리지를 선택함. 정제칼럼의 용출량에 따른 정제효율 측정: 용출 용매의 함량을 1-4, 4-8, 8-12, 12-16, 16-20, 20-24 mL로 4 mL씩 분취하여 회수율을 평가함.. - 추출 분쇄 및 균질화 된 검체 약 10 g을 달아 1M 수산화칼륨·에탄올 용액 100 mL와 함께 둥근 바닥 플라스크에 넣고 내부표준물질 1 mL를 첨가한 후 환류냉각장치를 부착시킴. 가열추출기 (80℃)에서 3시간 동안 알칼리 분해시키고 신속히 냉각 후 헥산 50 mL를 환류냉각기를 통하여 넣어주고 에탄올:헥산(1:1)용액 50 mL를 이용해서 분액깔대기에 옮긴다. 분액깔대기에 50 mL의 물을 넣고 진탕시켜 물층과 헥산층으로 분리시킨 후 헥 산층을 분리하여 다른 분액깔대기에 받아두고 물층에 헥산 50 mL를 넣어 추출하는 과 정을 두 번 반복하여 얻은 헥산층을 모두 합친다. 헥산층에 물 100mL씩을 넣고 흔들어 섞은 후 정치하여 물층은 버리는 조작을 2회 되풀이 한다. 헥산층을 무수황산나트륨 약 15 g을 넣은 여과지를 사용하여 탈수여과한 후 40℃ 이하의 수욕상에서 감압하여 약 2 mL로 농축함.. - 정제 후로리실 카트리지는 미리 디클로로메탄 10 mL 및 헥산 20 mL를 초당 2-3방울의 속 도로 유출시킨 후 사용. 이 카트리지에 위의 농축액을 넣고 헥산 5 mL과 헥산/디클로 로메탄 (3:1) 15 mL로 각각 용출시킨 후 이 용출액을 40℃ 이하의 수욕상에서 질소가 스 하에 농축·건조한 후 잔류물을 아세토니트릴에 녹여 전량을 1 mL로 하고 이를 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 함. 추출 및 정제과정은 Fig 6에 나 타냄.. 유탕식품 중 다환방향족탄화수소 평가 및 공정요인 분석. 571.

(28) Fig. 6. Extraction and purification of PAHs analysis by HPLC-FLD.. c) 기기분석 - HPLC/FLD의 측정조건 액체크로마토그램피의 칼럼은 Supelcosil LC-PAHs (4.6 × 250 mm, 5 μm)를. 3. 5℃에서 사용하며, 20 μL를 injection 한다. 이동상은 acetonitrile과 물의 혼합액 (8:2)을 0-27분 동안, acetonitirle을 27-33분, acetonitirel을 33-37분, 다시 acetonitrile을 37-39분, acetonitrile과 물의 혼합액(8:2)를 37-39분까지 하였으며 유 랑은 0.8 mL/min 으로 한다. 검출기 파장은 0-17분까지 여기파장 254 nm/형광파장 390 nm, 17-60분까지 여기파장 254 nm/형광파장 420 nm 으로 분석함(Table 8).. 572. 2013년 기초연구과제총서.

(29) Table 8. HPLC-FLD opearation conditions for PAHs analysis Instrument. Dionex U3000 HPLC. Column type. Supelcosil LC-PAH Column(25 cm X 4.6 mm, 5 μm). Injection vol.. Mobile phase. Wave length. 20. μL. 0 27 33 37. min min min min. Acetonitrile 80 100 100 100. 39. min. 80. 0-17 17-60. min min. Excitation 254 254. Flow rate. 0.8. (nm). Water 20 0 0 0 20 Emission. (nm). 390 420. mL/min. d) 정성시험 위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피크는 동일한 측정조건에서도 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치하여야 함.. e) 정량시험 감량곡선에서 얻어진 표준물질과 내부표준물질의 피크에 대한 면적비[AS/AIS]를 Y축으로 하고 표준물질의 농도를 X축으로 하여 검량곡선을 작성하고 시험용액의 면적비[ASAM/ASAMIS]를 Y 축에 대입하여 벤조피렌의 농도를 계산함.. AS : 검량곡선표준용액의 표준물질 피크면적 AIS : 검량곡선표준용액의 내부표준물질 피크면적 ASAM : 시험용액의 PAHs 피크면적 ASAMIS : 시험용액의 내부표준물질 피크면적. 유탕식품 중 다환방향족탄화수소 평가 및 공정요인 분석. 573.

(30) (다) 분석법 밸리데이션 PAHs의 MRLs에 기준하여 정량한계(limit of quantitation, LOQ)가 잔류허용기준의 1/2을 검출할 수 있는 분석법을 개발하고, 각 분석법의 회수율은 LOQ농도, LOQ의 2배농도, LOQ의 10배 농도에서 각각 3반복으로 측정하며 80-120% 범위를 만족하도록 한다. 그리고 확립된 분 석방법의 신뢰성을 검증하기 위한 validation은 정량한계(LOQ), 회수율, 크로마토그램을 이용 하여 평가한다. 그리고 확립된 분석법을 이용하여 분석된 잔류분의 신뢰성을 확보하기 위하여 재확인용 기기분석법을 확립한다. 즉, 신뢰성이 있는지 정성적 재확인을 위하여 LC/MS, GC/MS를 이용한 기기분석법 확립한다.. a) 정량한계(Limit of quantitation) 검체 중에 포함되어있는 분석대상물의 정량이 가능한 최소량 또는 최저농도를 말한다. Visual evaluation이라고 하고, Non-instrumental methods에 적용한다. Signal-to-Noise는 알고 있는 소량의 분석물질에 대한 시그날 분석물질이 신뢰성 있게 정량될 수 있는 최소한의 농도를 확립하는 것이다. 일반적인 Signal-to-noise ratio는 10:1이다.. - S의 측정방법 적절한 수의 맹검을 분석하고 이에 대한 표준편차를 구해 분석적 background측정한다. 정량한계 범위를 포함하는 분석물질의 calibration curve를 구하고 회귀선 (regression line)의 residual σ 나 Y-절편의 σ 를 표준편차로 이용한다.. b) 회수율(Recovery) 정량한계의 결과를 바탕으로 회수율을 측정하고, 정량한계(LOQ) 농도, LOQ 2배농도, LOQ 10배 농도를 3반복 측정한다. 회수율 범위 80-120% 범위를 만족시키도록 하고, 식품 유형별 시료에 적용하여 측정한다.. c) 크로마토그램(chromatogram) 피크 분리를 확인하고 (이중피크, peak tailing여부 확인), 일정한 retention time에 피크 분리 여부를 확인한다.. 574. 2013년 기초연구과제총서.

(31) (라) 유탕식품 생산 공정의 공정요인 분석 - 유탕식품의 유탕처리 공정에서. PAHs 의 생성에 영향을 미칠 수 있는 가능 요인들을. (예: 유탕처리 온도, 유탕처리 시간, 유탕식품 원료 등) 파악하여 유탕식품 생산 공정의 안전성을 향상시킬 수 있는 방안을 제시한다.. HPLC/FLD를 이용한 PAHs 분석법 개선 및 개발. (1) 알칼리 분해시간에 따른 효율 평가 PAHs의 분석법 개선 및 개발을 위해 벤조피렌과 내부표준물질인 3-methylcholanthrene 을 지표로 삼았다. 장시간의 알칼리분해가 벤조피렌을 휘발시켜 분해효율을 감소시킬 수 있으 므로 1, 2, 3, 4 시간의 알칼리 분해 시간중의 3-methylcholanthrene의 회수율을 평가하 여 최적의 알칼리분해시간을 선정하였다. 시간에 따른 분해효율의 편차는 크지 않았으나 3시간까지는 분해시간에 따라 회수율이 증 가하였고, 알칼리분해를 4시간 하였을 때에는 회수율이 감소하여 최적의 알칼리분해시간은 3 시간 이었다(Table 9). 허수정 등(2005)에 따르면 분해시간이 3시간을 넘어갈 경우 알칼리분 해가 PAHs의 휘발을 일으켜 분해효율이 감소한 것으로 보인다.. Table 9. Recovery of 3-methylcholanthrene (5 µg/kg) for french fried potatoes (n=3). Recovery(%). 1시간. 2시간. 3시간. 4시간. 90.17±1.41. 94.53±2.23. 98.87±4.20. 97.13±3.81. (2) 정제컬럼의 충진물에 따른 용출효율 평가 PAHs 분석시 시료의 성상에 따라 다양한 정제방법이 있으나 비교적 극성이 강한 고정상을 가진 florisil, silicagel, alumina column을 이용한 정제방법이 많이 사용되고 있다. 이들은 비극성인 PAHs 화합물과 극성 방해물질의 분리에 매우 효과적이지만, 이들 컬럼을 준비하고 활성화시키는데 많은 양의 용매와 시간이 요구되는 단점이 있으므로 상업적으로 시판되고 있 는 고체상 카트리지를 사용하는 방법을 이용하여 정제효율과 분석시간 등을 줄일 수 있었다.. 유탕식품 중 다환방향족탄화수소 평가 및 공정요인 분석. 575.

(32) 컬럼에 따른 용출효율 평가 결과 florisil 카트리지 사용 시 가장 적합한 용출효율을 나타 냈다(Table 10). PAHs는 비극성이므로 florisil catridge와 매우 약한 상호작용을 하며, 비 교적 약한 극성을 갖는 용매로 용출시키면 극성 방해 물질과 분리시켜 정제할 수 있기 때문 에 좋은 용출효율을 보인 것으로 생각된다.. Table 10. Recovery of 3-methylcholanthrene (5 µg/kg) for french fried potatoes. (n=3). 카트리지. Florisil. Silica. Alumina A. Alumina B. Alumina N. recovery (%). 98.87±4.20. 80.71±5.77. 92.57±1.35. 87.23±2.30. 93.17±2.12. (2) 분석법 밸리데이션 (가) 표준용액의 제조 - 표준물질인 PAHs 4종(benzo[a]anthracene, chrysene, benzo[b]fluoranthene, benzo[a]pyrene)과 내부표준물질인 3-methylcholanthrene 표준용액을 만들어 PAHs를 단계별로 희석하는 동시에 3-methylcholanthrene을 일정량. 첨가하여. 0.5, 1, 2, 5, 10 μg/kg 의 PAHs 와 5 μg/kg 의 3-methylcholanthrene 혼합 용액을 만들어 분석에 사용하였다.. (나) 직선성 - 분석물질을 단계별로 희석하여 표준물질과 내부표준물질의 피크에 대한 면적비를 Y 축으로 하고, 표준물질인 PAHs 의 농도를 X 축으로 하여 검량선을 작성하였다. 각 각의 PAHs 에 대한 직선성 결과는 다음과 같다. 각각 PAHs 의 농도는 0.5, 1, 2, 5, 10 μg/kg인 표준용액에 내부표준물질은 5 μg/kg로 희석하여 희석된 표준용액 을 각각 시료에 가한 후 실험하였다. 검량선 작성 시 직선성을 나타내는 상관계수 (R2) 은 0.9959-0.9999 의 값을 보여 정량 분석에 적합하다고 판단되었다.. 576. 2013년 기초연구과제총서.

(33) (다) 검출한계 및 정량한계 - 각각 PAHs 의 농도는 0.5, 1, 2, 5, 10 μg/kg인 표준용액에 내부표준물질은 5 μg/kg로 희석하여 희석된 표준용액을 각각 시료에 첨가 후 실험하였다. 일반적인 signal to noise ratio는 정량한계에선 10:1, 검출한계에선 3:1으로 측정하였다. - 폴란드의 M.Ciecierska와 M.W.Obiedzinski(2010) 에 따르면 LOD의 경우 0.05-0.15 μg/kg, LOQ는 0.10-0.30 μg/kg 으로 측정되고있다.. (라) 정확성 및 정밀성 - 정확성 및 정밀성 실험은 표준물질 PAHs 의 농도가 0.5, 1, 2, 5, 10 μg/kg,. 내. 부표준물질은 5 μg/kg로 희석하여 피크에 대한 면적비로 작성하였다. PAHs 의 면적 /내부표준물질의 면적을 Y 축으로 하였으며, 표준물질의 농도는 X 축으로 나타냈다. - 일반적으로 정확성(Accuracy, %) 는 80-120% 이내이고, 정밀성(Precision, %) 은 상대표준편차 (CV, %) 가 15% 이내이어야 한다. 하루에 반복적인 작업을 3번 시행 하여 구한다. 또한 3일 동안 반복 시행하여 구한 일간 정확성, 정밀성도 시행하여 구 한다.. (마) 회수율 - 식품 중 유탕처리한 감자튀김 시료에 PAHs 표준용액 5 μg/kg 과 내부표준물질인 3-methylcholanthrene 을 5 μg/kg으로 희석하여 1mL 첨가하여 전처리를 한 뒤, 회수율을 측정하였다.. (3) 측정불확도 ○ 기기측정시 측정불확도 Standard를 n회 반복 측정하여 얻은 결과(area값)의 평균, 표준편차를 구한다.. A. type은 표준오차로 산출된 표준불확도는 아래와 같다.. 표준편차 표준불확도 =   . 이렇게 구한 표준불확도를 평균값(area값 평균)으로 나눈 것이 상대표준불확도이다.. 유탕식품 중 다환방향족탄화수소 평가 및 공정요인 분석. 577.

(34) ○ 시료측정시 측정불확도 시료를 n회 반복 측정하여 얻은 결과(area값)의 평균, 표준편차를 구한다.. 반복측정의. 불확도는 아래와 같다.. 상대표준편차 표준불확도 =   . (4) 실태조사 ○ 대상시료: 대형마트 및 인터넷상으로 구입하여 상온보관 후 분석시료로 사용하였다.. ○ 시중에 판매하고 있는 유탕처리제품을 선정하여 실태조사 실시하였다. 유탕처리제품의 종류 별 시료의 수는 Table 11에 나타내었다.. ○ 시료 조사 과정에서 시중에 판매되고 있는 유탕처리 제품들을 모니터링 하였고, 라면 중 유탕 처리되지 않은 건면은 PAHs 함량 실태조사 과정에서 표본이 되기에 부족하다 고 판단하여 제외하였다.. Table 11. Monitoring of PAHs content for deep fat fried foods.. 578. Category. Number of samples. 유탕처리 라면. 23 건. 유탕처리 스낵. 28 건. Total. 51 건. 2013년 기초연구과제총서.

(35) (가) 유탕처리 된 라면 중 PAHs 함량 실태조사 - 국내에서 시판되는 제품들을 대상으로 마트 등을 통해 구입하여 상온 보관 상태에서 실태조사를 실시하였다. 유탕처리 된 라면의 원산지는 Table 12에 나타내었다.. Table 12. Types of deep fat fried foods for monitoring analysis 제품유형. 원산지. 제품유형. 원산지. 유탕처리된 라면1. 밀(미국산, 호주산), 전분(독일산), 팜유(말레이시아산). 유탕처리된 라면 13. 밀(미국산, 호주산), 팜유(말레이시아산). 유탕처리된 라면 2. 밀(미국산, 호주산), 팜유(말레이시아산). 유탕처리된 라면 14. 밀(미국산, 호주산), 팜유(말레이시아산). 유탕처리된 라면 3. 밀(미국산, 호주산), 팜유(말레이시아산). 유탕처리된 라면 15. 밀(미국산, 호주산), 팜유(말레이시아산). 유탕처리된 라면 4. 밀(미국산, 호주산), 팜유(말레이시아산). 유탕처리된 라면 16. 밀(미국산, 호주산), 팜유(말레이시아산). 유탕처리된 라면 5. 밀(미국산, 호주산), 팜유(말레이시아산). 유탕처리된 라면 17. 밀(미국산, 호주산), 팜유(말레이시아산). 유탕처리된 라면 6. 밀(미국산, 호주산), 팜유(말레이시아산). 유탕처리된 라면 18. 밀(미국산, 호주산), 팜유(말레이시아산). 유탕처리된 라면 7. 밀(미국산, 호주산), 팜유(말레이시아산). 유탕처리된 라면 19. 밀(미국산, 호주산), 팜유(말레이시아산). 유탕처리된 라면 8. 밀(미국산, 호주산), 팜유(말레이시아산). 유탕처리된 라면 20. 밀(미국산, 호주산), 팜유(말레이시아산). 유탕처리된 라면 9. 밀(미국산, 호주산), 팜유(말레이시아산). 유탕처리된 라면 21. 밀(미국산, 호주산), 팜유(말레이시아산). 유탕처리된 라면 10. 밀(미국산, 호주산), 팜유(말레이시아산). 유탕처리된 라면 22. 밀(미국산, 호주산), 팜유(말레이시아산). 유탕처리된 라면 11. 밀(미국산, 호주산), 팜유(말레이시아산). 유탕처리된 라면 23. 밀(미국산, 호주산), 팜유(말레이시아산). 유탕처리된 라면12. 밀(미국산, 호주산), 팜유(말레이시아산). 유탕식품 중 다환방향족탄화수소 평가 및 공정요인 분석. 579.

(36) (나) 유탕처리 된 스낵 중 PAHs 함량 실태조사 - 국내에서 시판되는 제품들을 대상으로 마트 등을 통해 구입하여 상온 보관 상태에서 실태조사를 실시하였다. 유탕처리 된 스낵의 원산지는 Table 13에 나타내었다. Table 13. Types of deep fat fried foods for monitoring analysis 제품유형. 원산지. 제품유형. 원산지. 유탕처리된 스낵1. 대한민국. 유탕처리된 스낵 15. 대한민국. 유탕처리된 스낵 2. 대한민국. 유탕처리된 스낵 16. 대한민국. 유탕처리된 스낵 3. 대한민국. 유탕처리된 스낵 17. 대한민국. 유탕처리된 스낵 4. 대한민국. 유탕처리된 스낵 18. 대한민국. 유탕처리된 스낵 5. 대한민국. 유탕처리된 스낵 19. 대한민국. 유탕처리된 스낵 6. 대한민국. 유탕처리된 스낵 20. 대한민국. 유탕처리된 스낵 7. 대한민국. 유탕처리된 스낵 21. 대한민국. 유탕처리된 스낵 8. 대한민국. 유탕처리된 스낵 22. 대한민국. 유탕처리된 스낵 9. 대한민국. 유탕처리된 스낵 23. 대한민국. 유탕처리된 스낵 10. 대한민국. 유탕처리된 스낵 24. 대한민국. 유탕처리된 스낵 11. 대한민국. 유탕처리된 스낵 25. 대한민국. 유탕처리된 스낵12. 대한민국. 유탕처리된 스낵 26. 대한민국. 유탕처리된 스낵 13. 대한민국. 유탕처리된 스낵 27. 대한민국. 유탕처리된 스낵 14. 대한민국. 유탕처리된 스낵 28. 대한민국. 580. 2013년 기초연구과제총서.

(37) (5) 유탕 식품 생산 공정의 공정 요인 분석. - 유탕식품 생산 공정의 공정요인 분석. 유탕식품의 유탕처리 공정에서. PAHs의 생성에. 영향을 미칠 수 있는 가능 요인들을 (예: 유탕처리 온도, 유탕처리 시간, 유탕식품 원료 등) 파악하여 유탕식품 생산 공정의 안전성을 향상 시킬 수 있는 방안을 제시.. 유탕식품 중 감자튀김을 이용하였다. 튀김용 감자는 시중에 판매되고 있는 냉동감자 (Payette Farms 1/4〃 Shoestring, Doosan Co.,LTD., Los Angeles, CA, USA)를 이용하였고, 튀김 시 이용할 오일은 해바라기유(Dongnamfood, Ankara, Turkey), 카 놀라유(Ottogi, Co., Ltd., Seoul, Korea) 및 일반 튀김유(Dongsuh Co., Ltd., Seoul, Korea)를 이용하였다.. (가) 시료 제조 해바라기유(sunflower oil, SO), 카놀라유(canola oil, CO) 및 일반 튀김유(frying oil, FO)를 이용하여 튀김냄비에 3개의 온도를 설정하여 튀김 조리 하였으며, 5개의 시간으로 나누어 유지 500g에 유지의 5%에 해당하는 25g의 감자튀김을 사용한다.. (나) PAHs의 측정 - 추출 튀김 시간과 온도에 따라 채취한 튀김감자에서 추출한 각각의 기름 (SO,CO 및 FO) 을 PAHs 측정용 시료로 이용하였다. 즉, 시료 10g정도를 취하여 내부표준 물질인 3-methylcholanthrene을 5 μg/kg 농도로 제조하여 1 mL을 첨가한 후 환류냉각 장치를 부착시킴. 가열추출기 (80℃)에서 3시간 동안 알칼리 분해시키고 신속히 냉각 후 헥산 50 mL를 환류냉각기를 통하여 넣어주고 에탄올:헥산(1:1)용액 50 mL를 이 용해서 분액깔대기에 옮긴다. 분액깔대기에 50 mL의 물을 넣고 진탕시켜 물층과 헥 산층으로 분리시킨 후 헥산층을 분리하여 다른 분액깔대기에 받아두고 물층에 헥산 50 mL를 넣어 추출하는 과정을 두 번 반복하여 얻은 헥산층을 모두 합친다. 헥산층 에 물 100mL씩을 넣고 흔들어 섞은 후 정치하여 물층은 버리는 조작을 2회 되풀이 한다. 헥산층을 무수황산나트륨 약 15 g을 넣은 여과지를 사용하여 탈수여과한 후 40℃ 이하의 수욕상에서 감압하여 약 2 mL로 농축함.. 유탕식품 중 다환방향족탄화수소 평가 및 공정요인 분석. 581.

(38) - 정제 후로리실 카트리지는 미리 디클로로메탄 10 mL 및 헥산 20 mL를 초당 2-3방울의 속도로 유출시킨 후 사용. 이 카트리지에 위의 농축액을 넣고 헥산 5 mL과 헥산/디 클로로메탄 (3:1) 15 mL로 각각 용출시킨 후 이 용출액을 40℃ 이하의 수욕상에서 질소가스 하에 농축·건조한 후 잔류물을 아세토니트릴에 녹여 전량을 1 mL로 하고 이를 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 함.. (다) 지방산 측정 지방산 분석은 Parcerisa 등의 방법을 사용하여 튀기는 시간을 30, 60, 90, 120, 150분 으로 나누어 측정한다. 채취한 튀김 감자에서 추출한 각각의 기름(SO, CO 및 FO)을 지방산 분석용 시료로 사용하였다. 즉, 시료 0.2g을 1 N methanolic sodium methoxide 3ml를 가한 후, 100℃에서 30분 동안 흔들어주며 반응시킨 후 완전하게 냉각시킨 다음 분액깔대기 에 옮겨서 6N HCl을 가하여 위아래로 격렬히 흔들어주었다. 그 다음 5mL의 n-hexane를 가하여 혼합 및 방치하여 분리시킨 후, H2O를 가하여 중성화 시키고 용액 중 수분을 제거 하기 위해서 건조시킨 sodium sulfate를 이용하여 여과한 다음 40℃수조에서 감압 농축하 고 남아있는 용매를 질소로 제거하였다. 그 다음 14% methanolic boron trifluoride를 3mL 가하여 다시 80℃에서 5분 동안 가열하였다. 가열이 끝나면 냉각시켜 NaCl 포화용액 3mL과 n-hexane 3mL을 가하여 혼합 및 분리하여 상층액을 sodium sulfate가 들어있는 시험관에 옮겨 일정량을 취하여 GC 분석용 샘플 바이알에 담아서 GC 분석용 시료로 이용하 였다. Gas chromatography(Agilent 7890A GC, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 이용하여 3회 반복 분석하였다.. - 기기조건 지방산 분석을 위한 기기는 Gas chromatograph(Agilent Technologies 7890A gas-chromatography, Santa Clara, CA, USA)를 사용하였고, flame ionization detector를 통해 검출 하였다. 칼럼은 DB-23 (J&W, 60 m × 0.250 ㎜ i.d., 0.25 ㎛ film thickness)을 사용하였다. 분석 조건은 Table 14.와 같다.. 582. 2013년 기초연구과제총서.

(39) Table 14. 지방산 분석을 위한 GC 분석 조건 GC. Agilent Techonologies 7890A. Column. DB-23 (J&W, 60 m × 0.250 ㎜ i.d., 0.25 ㎛film thickness). Detector. FID. Carrier gas. H2. Make up gas. N2. Temp. program. 50 ℃ (1min), 25 ℃/min to 175 ℃, 4℃/min to 230 ℃ (5min). Head pressure. 230kPa constant pressure(33cm/s at 50 ℃. Detector temp.. 280 ℃. Injector temp.. 270 ℃. Split ratio. 1:20. Injection volume. 1 ㎕. (라) 산가 측정, 과산화물가 - 산가측정 유탕 처리를 하는 시간(30, 60, 90, 120, 150 min)에 따라 채취한 감자튀김에서 추 출한 각각의 기름(SO, CO 및 FO)을 시료로 이용하여 산가 측정 시료로 이용하였다. 산가는 AOCS의 Cd 3a-63법(16)에 의하여 시료 1~3 g에 100 mL의 용매(diethyl ether: ethanol＝1:1, v/v)를 가한 후 혼합하여 0.1 N KOH(potassium hydroxide)로 적정하였다.. - 과산화물가 유탕 처리를 하는 시간(30, 60, 90, 120, 150 min)에 따라 채취한 감자튀김에서 추 출한 각각의 기름(SO, CO 및 FO)을 이용하여 과산화물가 측정 시료로 이용하였다. 과산화물가는 AOCS의 Cd 8-53법(17)에 의하여 시료 3 g을 삼각플라스크에 취한 후, 30 mL의 acetic acid : chloroform(3:2, v/v)을 가하여 유지를 충분하게 용해 시킨 다음 0.5 mL의 KI 포화용액을 가하여 1분 동안 흔들면서 혼합한 후 5분간 암 소에서 방치시켰다. 반응 후 증류수 30 mL를 가하여 0.01 N Na2S2O3 용액으로 적 정하였다. 유탕식품 중 다환방향족탄화수소 평가 및 공정요인 분석. 583.

(40) 3. 총괄연구개발과제의 최종결과 및 고찰 3.1 식품 중 PAHs 실태조사 자료수집 및 안전성 검토 3.1.1. 분석방법 (1) 국내 ① 2008년 식품의약품안전청의 ‘가공식품 중 PAHs 모니터링 및 위해평가’에 따르면 훈제식·어육, 분유에서 PAHs를 검출하기 위해 알칼리분해방법으로 추출하고 Sep-Pak Florisil Cartridge 로 정제하여 질소농축 후 acetonitrile 1mL로 녹여 0.45㎛ membrane filter를 통과시켜 HPLC/FLD용 시험용액으로 사용하였다. 실험에서 사용된 HPLC/FLD의 조건은 다음과 같다 (Table 15).. Table 15. Operating condition of HPLC/FLD for PAHs analysis. Column. Supelcosil LC-PAH column (25 cm ⨉ 4.6 mm, I.D. 5 ㎛ with Supelguard LC-18. Column Temp.. 35℃. Flow rate. 1.0 ㎖/min. Solvent system. 0 min 20 min 25 min 27 min 40 min. Injection volume. 10㎕. Wavelength (Ex/Em). 0-15 min 15-26 min 26-40 min. 584. 2013년 기초연구과제총서. ACN 80 % 100 % 100 % 80 % 80 %. 254 nm/390 nm 260 nm/420 nm 293 nm/498 nm. H 2O 20 % 0 % 0 % 20 % 20 %.

(41) ② 2009년 식품의약품안전청의 ‘수산물의 PAHs 모니터링’ 에 따르면 수산물에서 PAHs를 검출하 기 위해 균질화 된 시료를 알칼리 분해하여 n-hexane으로 추출하고 증류수로 세척한 다음 Sep-Pak Florisil Cartridge로 정제하여 GC/MS로 분석하였다. 실험에서 사용된 GC/MS의 조건은 다음과 같다(Table 16).. Table 16. Operating condition of GC/MS for PAHs analysis Column. DB 5MS (30m length 0.25mm, 0.25㎛). Carrier Gas. He, Constant flow = 1㎖/min. Injection volume. 1㎕, splitless. Temperature Program. 80℃/min→5℃/min→200℃(20min). Transferline temperature. 280℃. Source temperature. 200℃. Electron energy. 70eV. Ionization mode. EI. Detector. MS, SIM, 7 windows. (2) 국외 ① EFSA 논문인 Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Food(The EFSA Journal(2008)724, 1-114)에서. 분석방법은. 13. C-labelled PAHs를 내부표준물질로 하여 고체 식품이 시료인 경. 우 알칼리 분해, 유기용매로 액-액 추출을 많이 사용하고, 기름과 같은 액체가 시료인 경우 액-액 추출법을 많이 사용한다. 고체식품의 경우 pressurised liquid extraction(PLE), supercritical fluid extraction(SFE)법도 있지만 자주 쓰이지는 않는다. PAHs의 분리를 위한 정제법으로 column chromatography(GC), solid phase extraction(SPE), gel permeation chromatography(GPC)가 쓰인다. 분석기기로는 HPLC/FLD, GC/MS를 많이 사용한다.. ② 호주, 뉴질랜드 FSANZ에서 발표된 Survey of polycyclic aromatic hydrocarbons(PAHs) in Australian foods(White, et al. 2004)에서는 모든 식품군에 대하여 내부표준물질로 Isotopically labelled surrogate standards를 사용한다. 알칼리 분해 후 유기용매로 추출하고 formin acid와 silica gel column chromatography로 정제과정을 거쳐 HRGC/LRMS로 분석한다. 유탕식품 중 다환방향족탄화수소 평가 및 공정요인 분석. 585.

(42) ③ 영국에서는 PAHs in the UK diet : 2000 total diet study samples(2002)를 발표하였다. 이 보고서에 따르면 식품 중 PAHs 의 분석은. 13. C를 내부표준물질로 사용하였고, Methanolic. Potassium hydroxide를 이용하여 알칼리 분해 후 cyclohexane을 이용하여 액-액 추출한다. Silica gel로 정제 후 HRGC/LRMS로 분석하였다.. ④ 아일랜드에서 발표한 Investigation into levels of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons(PAHs) in food on the Irish market(FSAI, 2006)에 따른 PAHs 전처리 방법은 ③과 같다.. ○ 국가별 실험방법은 Table 17에 나타내었다. 한국의 경우 내부표준물질로 3-methylcholanthrene을 사용하였으나 다른 국가에서는. 13. C을 이용하였다. 대부분의 국가에서 liquid-liquid extraction을. 사용하여 추출하였으며 용매는 주로 n-hexane 이다. 정제를 위해 한국은 florisil catridge 를 사용하였으나 아일랜드, FSA, 영국에서는 silica catridge를 사용하였다. 5개국 중 2개국 에서 HPLC/FLD를 사용하였다. 아일랜드와 영국, FSA에서는 GC/MS, HRGC/LRMS를 사 용하여 식품 중 PAHs를 분석하였다.. Table 17. Condition of PAHs analysis in each countries 전처리 방법 국가 분해. 국내. 한국. 추출. • IS: 3-Methylcholanthrene • Saponification: • Liquid-liquid n-hexane, 3 hr in extraction soxhlet. 정제. • Florisil catridge. 기기 분석 HPLC /FLD, GC/MS. • column chromatography (GC) • IS: 13C labelled HPLC • Liquid-liquid • solid phase analogues /FLD, extraction with extraction(SPE) 국외 EFSA • Saponification: Ethanolic GC/MS organic solvents • gel permeation potassium hydroxide chromatography (GPC) → automatic GPC. 586. 2013년 기초연구과제총서.

(43) 전처리 방법 국가 분해 FSANZ 국외. 아일 랜드 영국. 3.1.2.. • Isotopically labelled surrogate standards • Saponification. 추출. 정제. 기기 분석. • formic acid HRGC/ • organic solvents • silica gel column LRMS chromatography. • IS: 13C • Liquid-liquid extraction • Saponification: Methnolic potassium hydroxide • Cyclohexane. • Silica gel column HRGC/ • DMF:cyclohexane LRMS. 모니터링 결과. (1) 국내 ① 2008년 식품의약품안전청의 ‘가공식품 중 PAHs 모니터링 및 위해평가’ 에 따르면 30종의 식 품군에서 PAHs 를 검출하기 위해 내부표준물질로 3-methylcholanthrene 을 사용해 HPLC/FLD 로 분석하였다. 30종의 식품군 중 26종의 식품군에서는 8종의 PAHs가 모두 불 검출이었으며, 검출된 식품 중 PAHs의 평균농도는 훈제연어에서 benzo(b)fluoranthene 0.9 ㎍/kg, 훈제치킨에서 benzo(b)fluoranthene 0.2 ㎍/kg, benzo(k)fluoranthene 0.1 ㎍/kg, benzo(a)pyrene 0.2 ㎍/kg, 돼지고기 석쇠구이에서 benzo(b)fluoranthene 1.3 ㎍/kg, benzo(k)fluoranthene 0.3 ㎍/kg, benzo(a)pyrene 0.9 ㎍/kg 이었다.. ② 2009년 식품의약품안전청의 ‘수산물의 PAHs 모니터링’ 에 따르면 수산물에서 PAHs를 검출하 기 위해 총 280건의 수산물(어류, 두족류, 갑각류, 패류)에 대한 16종의 PAHs를 GC/MS로 분석하였다. 분석 결과 어류의 평균 총 PAHs 함량은 0.29 ㎍/kg 였으며, 패류는 1.52 ㎍ /kg, 두족류와 갑각류는 1.29 ㎍/kg 이었다. 어류 중 고등어의 8PAHs 분석결과 Chrysene의 함량이 0.004 ㎍/kg 였으며 나머지 7종의 PAHs는 불검출이었다. 패류 중 홍합과 꼬막의 8PAHs 분석결과 모두 불검출이었다. 두족류 중 오징어의 8PAHs 분석결과 Benzo(a)anthracene의 함량이 0.224 ㎍/kg, Dibenzo(a,h)anthracene의 함량이 0.007 ㎍/kg 였으며 나머지 6종의 PAHs는 모두 불검출이었다. 갑각류에서 게의 8PAHs 분석결과 Chrysene의 함량이 0.013 ㎍/kg 였으며, 새우의 경우 Benzo(a)anthracene의 함량이 0.031 ㎍/kg 이고 나머지 7종의 PAHs 는 모두 불검출이었다. 유탕식품 중 다환방향족탄화수소 평가 및 공정요인 분석. 587.

(44) (2) 국외 ① EFSA 논문인 Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Food(The EFSA Journal(2008)724, 1-114)에서는. 13. C-labelled PAHs를 내부표준물질로 하여 주로 HPLC/FLD, GC/MS로 분석. 한다. 4065건의 시료 중 분유의 시료수는 270건이었고, 초콜릿의 시료수는 148건, 코코아파 우더의 시료수는 3건, 훈제돈육의 시료수는 562건, 훈제연어의 시료수는 336건, 석쇠구이 고 기의 시료수는 53건, 어류의 시료수는 69건, 두족류의 시료수는 5건, 어류가공품의 시료수는 757건, 올리브유의 시료수는 113건이었다. 각 식품의 PAHs 함량은 아래의 table 18와 같다.. Table 18. Concentrationn of PAHs in food products. 588. benzo(a)pyrene. 4PAHs. 8PAHs. Infant food. 0.03-0.04. 0.20-0.23. 0.25-0.33. Chocolate. 0.17. 1.13. 1.45-1.49. Cocoa powder. 0.02-0.35. 1.33-2.03. 3.02-4.33. Smoked meat. 0.23-0.24. 1.84-1.88. 2.13-2.23. Smoked fish. 0.33-0.34. 2.32-2.34. 2.78-2.86. Grilled meat. 1.12-1.14. 3.23-3.27. 5.25-5.34. Fresh fish. 0.02-0.11. 0.08-0.48. 0.11-1.05. Caphalopods. 0.00-0.10. 0.01-0.39. 0.01-0.77. processed fish. 1.36-1.41. 12.46-12.74. 13.93-14.60. Pomace oil. 2.38-2.39. 23.50-3.54. 27.74-27.90. 2013년 기초연구과제총서.