사랑과 열정으로 더불어 함께 하는 세상 만들기 - 율촌재단(栗村財團)

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(1)천연항균물질에 의한 식중독균 억제 및 Biofilm 형성 억제. 정 현 정. 인하대학교 식품영양학과. 1. 서론 • 식중독(Foodborne disease)은 섭취한 음식물의 독성 물질로 인해 생기는 증후군으로서 원인에 따라 세균 자체에 의한 감염이나 세균에서 생산된 독소에 의한 세균성 식중독과 자연계에 존재 하는 동물성이나 식물성 독소에 의한 자연독 식중독 그리고 인공적인 화학물에 의해 발생하는 화학성 식중독으로 나눌 수 있다(Greig and Ravel, 2009).. • 최근 식품산업의 급격한 발전과 식품의 세계화 및 인스턴트 식품의 대량화 등으로 식중독에 의 한 식품 안전 사고가 세계적으로 증가하고 있으며, 우리나라에도 단체급식의 증가로 집단 식중 독의 발생으로 인한 피해가 증가하고 있으므로, 효과적인 식중독균 억제 방안이 필요하다.. • 한국의 경우 2008~9년에 일시적인 감소 추세를 보이다 2010년 이후 다시 증가 추세를 나타내 고 있으며, 주로 Escherichia coli, Salmonella spp., Staphylococcus spp., Yersinia spp. 등에 의한 세균성 식중독이 주로 발생하고 있다. 또한, 외식 및 집단 급식의 증가로 인해 식중 독 발생 규모가 커져 식품으로 인한 사고의 예방을 위해 식품의 안전 관리의 중요성이 증가하고 있다 (윤시몬, 2012). 특히 식품 산업 분야에 있어 바이오필름은 생산 공정에서 지속적으로 식 품의 오염을 유발하는 것으로 알려져 있다.. • 바이오필름은 고체 표면에 부착된 미생물과 미생물이 분비한 중합체(EPS; extracellular polymeric substances)의 결합층이다(노아름과 박권삼, 2009; Kim et al., 2009; 김진영 등, 2011; Jahid and Ha, 2012). Biofilm은 표면에 강하게 부착되어 있어 제거가 어렵고, 생체내에서는. 636. 2013년 기초연구과제총서.

(2) 접촉에 의한 만성 염증의 원인이 되고, 식품가공환경에서도 표면으로부터 지속적으로 미생물을 방출하기 때문에 유해 미생물의 저장소와 같은 역할을 하므로 공중 보건상 매우 큰 문제를 야기 할 수 있다. 바이오 필름은 각종 열과 pH와 같은 외부 환경에 저항성이 커 식품 안전에 위험을 미치고 있다. 이러한 바이오필름을 제거하기 위한 고압 세척, 초음파, 스팀 등의 다양한 연구가 진행되고 있다(Scheie and Petersen, 2004).. • 소비자는 합성 보존료를 이용한 식품의 사용을 꺼리므로 안전성의 문제가 없는 천연항균물질의 개발과 이용은 가공식품의 저장성 향상 및 안전성 확보라는 점에서 필연적이다. 천연항균물질은 식중독균 뿐만 아니라 국민보건에 영향을 주는 충치균 억제에도 적용이 가능하다.. • 현재 벤조산, 소르빈산과 같은 인공 합성품이 미생물의 증식을 억제하는 보존제로서 사용되어 왔 으나, 식품첨가물에 대한 소비자의 인식의 증가에 따라 소비자들의 이와 같은 물질에 대한 불신 이 커지고 있다. 또한 이와 같은 보존제는 발암성, 상피세포 손상, 간독성 등 부작용이 보고됨에 따라(Okubo et al., 2001; 김인숙과 전창진, 2005; 이성훈 등, 2006; 황재웅 등, 2006), 안전 성에 대한 문제 역시 지속적으로 언급되고 있어 최근 천연 첨가물에 대한 소비자의 요구가 증가 하고 있다. 이에 부응하며 부작용이 적으면서 인체에 무해한 천연물의 개발이 시급한 실정이다.. • 식품보존에 이용하는 첨가물은 특유의 맛이나 냄새가 없어야 하며 항균력이 약한 것은 사용할 수 없다. 식물은 주로 다양한 유용성분을 함유하고 있으며 자기방어의 수단으로서 항균성물질을 생산한다고 알려져 있어 항균 활성물질을 찾으려는 시도가 계속되어 왔으며, 주로 천연 항균제 로서 사용되고 있는 물질에는 무화과, 오레가노, 마늘, 프로폴리스, 차 추출물 등이 있다 (안봉 전, 1999; 이주연 등, 2001; 윤인숙, 2009).. • 프로폴리스는 꿀벌들이 식물의 진액물질을 채취하고 침을 첨가하여 결합하여 만든 물질로, 꿀벌 들이 벌집 출입구에 발라 외부로부터의 균의 유입을 막기 위해 사용하던 전통적으로 항균작용, 항곰팡이작용, 항바이러스작용 등의 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 프로폴리스 내의 플라보 노이드가 항균효과를 갖는 것으로 보고되어 왔으며 (조정순 등, 2005; 박선일 등, 2011; Josep and Arrate, 2012), 특히 프로폴리스는 그람 음성균에 비해 그람 양성균에 더 강력한 항균 효과와 생육 저해 효과를 나타내는 것으로 보고되었다(Bankova et al., 1999; 박헌국 등, 2008; 박선일 등, 2011; Josep and Arrate, 2012). 또한 프로폴리스는 구강구취균에 대해 서 로 항균력을 갖는다고 보고되었다(Amoros et al., 1992; Bonhevì et al., 1994).. • 치아우식증 (Dental caries)은 구강 내 치아에 남아 있는 당이 세균에 의해 산으로 변하여 치아 를 부식시키는 질병으로 St. mutans와 같은 세균에 의한 세균성 질환이다. 세균에 의한 구취의 주요 성분으로는 황화수소, 메틸머캅탄과 같은 휘발성 황화합물과 아민류, 페닐화합물이 있다.. St. mutans는 균체에 치아우식증의 원인 효소인 glucosyl transferase(GTF)를 가져 당으로부. 천연항균물질에 의한 식중독균 억제 및 Biofilm 형성 억제. 637.

(3) 터 비수용성 글루칸(glucan)을 형성하고, 비수용성 글루칸은 치아표면에 부착되어 치아 우식증 을 유발한다. Porphyromonas gingivalis는 성인형 치주질환의 원인균이자 독성이 강한 것으로 알려져 있으며, St. mutans와 St. sobrinus는 치아 우식의 원인이 되는 것으로 보고되었다 (Park et al., 2001; Lee et al., 2008; Ophori et al., 2010).. • 치면세균막은 치아 표면에 생기는 대표적인 바이오필름이다. 구강 내 미생물은 치면에 부착하여 치면 세균막을 형성하므로, 구강병의 예방과 치료에 있어 구강구취균의 성장을 억제하여 치면세 균막 형성을 억제하기 위한 방법 및 구강위생용품에 대한 연구에 대한 필요성이 증가하고 있다. 현재 구강청정제로서 chlorohexidine (CHX), cetylpyridinium chloride (CPC) 등이 사용되고 있으며, 다량 섭취 시 복통 유발, 반점치 등의 문제점이 있으며 CHX는 부작용으로 치아에 착색 을 유발하고 미각 이상을 유발 시키는 것으로 알려져 있다.. • 따라서 최근 부작용 없이 천연물을 이용한 구강 질환 억제에 대한 연구에 대한 관심이 높아지고 있 다(Lee et al., 1994; Baek, 2007). 보고된 연구 중에서 다양한 자생식물 추출액 중 Ginkgo. biloba, Sophora flavescens, Betula schmidtii 등 19종의 추출액이 P. gingivalis에 대해 효과를 나타냈으며, Llex integra, Pinus thunbergii, Camellia japonica, Morus bombycis 등 85종의 추출액에서 St. mutans에 대해 효과가 있었다는 연구가 있다(Baek, 2007). 오레가노 정유의 주성 분으로서 향료의 원료 및 살균제로서 작용하는 carvacrol[2-methyl-5(1-methylethyl)phenol]는 치아우식증의 원인균에 대해선 항균작용이 뛰어나지만, 구강조직 세포에 대해서 세포독성이 있다는 보고가 있으며 (Park et al., 2012), 인진쑥에서 추출한 쑥 추출물이 St. mutans, St. gordoii,. P. gingivalis 등의 구강구취균에 항균효과를 나타내는 것을 확인했으며, 특히 P. gingivalis에 대 해 가장 항균효과가 크게 나타났다(채규창 등, 2009).. • 본 연구에서는 항균력이 있다고 보고된 천연식품을 선별하여 식중독균과 충치균에 대한 항균력 을 검색하고, 그 중 식중독균과 충치균에 대해 우수한 항균력을 가지며, 식용이 가능한 천연항 균물질을 선정하고, 항균 특성 및 조건을 연구하여, 식품에 효과적으로 적용 가능한 농도를 조 사하고, 식품 가공조건에서 이들의 안정성을 연구하여 다양한 식품에 응용하고자 한다.. • 또한 각 균의 바이오필름을 형성시켜 프로폴리스의 바이오필름에 대한 저해 능력을 평가하였다. 기존의 항균물질의 항균성 평가에 대한 연구는 주로 부유 세균을 중심으로 이루어졌다. 하지만 대부분의 미생물은 일반적인 실제 환경에서 바이오필름의 형태로 존재하므로 바이오필름 상태로 존재하는 균에 대해 항균성을 평가하는 것이 중요한 의미를 갖게될 것으로 사료된다.. • 선정된 천연항균물질의 부유상태에서의 식중독균과 충치균에 대한 inhibition과, 가혹한 환경에 대해 훨씬 강한 저항력을 갖는 bilfilm 형성에 대한 억제기작을 연구하고, 항균물질에 의한 미생물 세포의 형태학적 변화 (TEM) 및 Biofilm 형성 억제를(SEM) 전자현미경을 이용하여 관찰하고자 한다.. 638. 2013년 기초연구과제총서.

(4) • 본 연구를 통하여, 식중독균과 충치균의 Biofilm 억제에 효과적인 천연항균물질을 개발하여, 현 재 사용되고 있는 저감화방법의 한계를 극복하고, 식품에 효과적으로 적용하고, 나아가 식품안 전에 기여할 수 있는 방안을 구하고자 한다.. 2. 연구 내용 • 허브, 향신료 및, 천연식품에 존재하는 천연항균물질 screening 및 항균활성 검색 ▪ 항균력이 보고된 10 종의 천연식품의 항균력 screening 및 항균 활성 비교 ▪ 사용균주 선정; 식품에 오염가능한 대표적인 식중독균 (그램 양성균 3종, 그램 음성균 3종, 충치균 3종). ▪ agar diffusion assay를 이용하여 항균력을 비교하여 우수 항균물질 2종을 선정.. • 선정된 우수 항균물질의 추출 방법 확립 및 항균활성 시험 ▪ 추출방법 확립 및 각 분획의 항균성 비교: 물과 용매를 이용하여 추출용매별 농도에 따른 최적 추출 방법 확립, 용매별 추출액의 수율 및 시험균주에 대한 항균성 비교. ▪ 추출물질의 열과 pH에 대한 안정성 측정: 가열(60~100℃), pH 변화(5-9)가 추출물의 항 균성에 미치는 영향을 조사하여, 항균성이 유지되는 조건 규명. • 우수 항균물질 추출물의 항미생물성 시험 ▪ 시험균에 대한 최소저해농도 측정 (Minimum Inhibition Concentration): Agar diffusion assay 방법이용. ▪ 식중독균과 충치균의 천연항균물질에 대한 sensitivity 시험: 최소저해농도 이상의 농도를 가했을 때, 프로폴리스의 미생물의 생육에 대한 효과를 조사. ▪ 우수 항균물질 추출물의 식중독균과 충치균의 biofilm 형성 억제시험. • 우수 천연항균물질 추출물의 항균성 전자 현미경 관찰 ▪ 식중독균과 충치균의 부유상태에서의 항균물질 처리에 따른 세포학적 변화 관찰 (전자현미경 관찰 : TEM). ▪ 항균물질 처리에 따른 식중독균과 충치균의 Biofilm 형성 억제 (전자현미경 관찰: SEM). 천연항균물질에 의한 식중독균 억제 및 Biofilm 형성 억제. 639.

(5) 3. 실험 재료 및 방법 • 허브, 향신료 및, 천연식품에 존재하는 천연항균물질 screening 및 항균활성 검색 실험에 사용된 10 종의 천연식품을 문헌고찰을 통하여 오미자, 삼백초, 인진쑥, 재피, 송화가 루, 생강나무, 솔잎, 어성초, 까마중을 선정하고, 프로폴리스는 위델스에서 생산한 프로롤리스원액 을 사용하였음.. • 균주 그램양성균은 Bacillus cereus ATCC 10876, Listeria monocytogenes ATCC 19114,. Staphylococcus aureus ATCC12600이며, 그램 음성균은 Enterobacter sakazakii ATCC 29544, Salmonllea Typhimurium DT 104, Escherichia coli O157:H7 ATCC 35150, 충치균 은 Staphylococcus mutans KCTC 3065, Staphylococcus sobrinus KCTC 5134, P.. gingivalis KCTC 5352를 사용하였다. 균주는 stock culture 상태로 -80℃에서 저장 보관하였으며 실험에 사용하기 위해서 tryptic soy broth (TSB, Difco Laboratoties, Detroit, MI, USA) 배지를 이용하였다. Stock culture 상태의 균주는 실험에 사용하기 전에 TSB 배지에 37 ℃에서 18시간동안 2번 배양을 통해 세포를 활성화 시킨 후 실험에 사용하였다.. • 프로폴리스의 항균활성 시험 접종한 균과 프로폴리스가 잘 퍼질 수 있도록 TSB 100 ml에 Bacto agar (TSB, Difco Laboratories) 0.75 g을 넣어 121 ℃에서 30분 가열하여 멸균시킨 후 soft TSA를 만든다. TSB 에서 37℃에서 18시간 배양한 각 균 현탁액을 soft TSA에 분주하여 균의 최종 농도가 105105CFU/ml가 되도록 만들었다. 프로폴리스는 2배 희석을 통하여 2.2, 1.1, 0.56, 0.28, 0.14 mg/µl 의 5단계의 농도를 준비하였다. 각 균이 분주된 0.75% soft TSA에 멸균된 유리 실 린더를 올린 후 희석한 각 농도의 프로폴리스를 10 µl씩 주입하였다. 주입 후에 희석액이 잘 스며 들 수 있도록 실온에서 4시간 방치하였고 그 후 37℃에서 18시간 배양하였으며 모든 실험은 3번 반복하였다.. 640. 2013년 기초연구과제총서.

(6) • 액체배지를 이용한 균의 프로폴리스에 대한 감수성 시험 한천확산법를 통해 각 균의 프로폴리스에 대한 감수성을 확인한 후 비교적 프로폴리스에 감수성이 높다고 판단되는 B. cereus (ATCC 10876), L. monocytogenes (ATCC 7644), En. sakazakii (ATCC 29544), St. mutans (KCTC 3065), St. sobrinus (KCTC 3308, KCTC 5134), P. gingivalis (KCTC 5352) 를 균 배양액의 농도가 105105 CFU/ml가 되도록 TSB에 희석하여 접종하였다. 희 석된 균 배양액 900 µl에 각 농도가 다른 프로폴리스 (0.22, 0.06, 0.01 mg/µl)을 100 µl씩 접 종하여 처리 후 37 ℃에서 배양하였다. 대조 군으로는 멸균한 증류수 100 µl를 처리하여 사용하 였다. 각 균에 대한 프로폴리스의 항균활성은 배양 후 생성되는 집락(colony)의 수를 통해 확인하 였으며, 균은 TSA에 도말하여 균의 생육을 확인하였다. 모든 실험은 3번 반복하였으며 평균값을 이용하였다. 실험방법은 Kim과 Chung(2011)의 방법을 참고하여 진행하였다.. • 프로폴리스의 열과 pH 안정성 프로폴리스의 열 안정성을 조사하기 위하여 프로폴리스 0.55 mg/µl을 각각 40, 60, 80 그리고 100℃에서 10분 동안 가열처리 하였다. TSB 100ml에 bacto agar 0.75 g을 넣어 121 ℃에서 30분 가열하여 멸균시켜 만든 soft TSA에 TSB에서 37 ℃에서 18시간 배양한 각 균 현탁액 0.1 ml를 soft TSA에 분주하여 균의 최종농도가 105105 CFU/ml가 되도록 만들었다. 열처리한 프로 폴리스는 멸균된 실린더를 soft TSA에 올린 후 각각의 시료를 10 µl씩 주입한 후 실온에서 4시 간 흡수 시킨 후 37 ℃에서 18시간 배양하였으며 모든 실험은 3번 반복하였다. 프로폴리스의 pH 변화에 따른 항균력을 조사하기 위해 위와 같은 방법으로 만든 soft TSA에 pH를 각 4, 6, 8 그리고 10으로 조정한 프로폴리스 0.55 mg/µl을 각각 10 µl씩 분주하여 실온 에서 4시간 흡수 후 37 ℃에서 18시간 배양하였으며, 모든 실험은 3번 반복하였다.. • 바이오필름 ▪ 바이오필름 형성 바이오필름을 형성하기 위해 스테인리스 쿠폰(가로 20 mm, 세로 10 mm, 두께 0.2 mm, 대광금속명판, Daegu, Korea)은 사용 전에 스테인리스 표면에 묻어있는 기름과 이물질을 제거 하기 위해 하룻밤 동안 살균제(유한락스; Seoul, Korea)에 담가두었다. 그 다음 멸균 펩톤수로 세척 후 121 ℃에서 15분간 멸균하여 사용하였다. 각 균의 바이오필름 형성은 스테인리스 쿠폰을 이용하였으며, Nguyen과 Yuk(2013)의 방법 을 참고하여 실행하였다. 30 mL의 TSB에 37 ℃에서 18시간 배양한 각각의 균주 (B. cereus 천연항균물질에 의한 식중독균 억제 및 Biofilm 형성 억제. 641.

(7) ATCC 10876, L. monocytogenes ATCC 19114, S. aureus ATCC 12600, E. coli O157:H7 ATCC 35150, Sal. Typhimurium DT 104, En. sakazakii ATCC 29544, St. mutans KCTC 3065, St. sobrinus KCTC 5134, P. gingivalis KCTC 5352)를 10 µl를 주입하고 멸 균한 스테인리스 쿠폰을 투입하여 37 ℃에서 7일간 배양하였다. 스테인리스 쿠폰은 1, 4, 7일 째에 꺼내어 바이오필름의 형성을 확인하였다. 바이오필름 형성 후 스테인리스 쿠폰에 살짝 부 착되어있는 균을 제거하기 위해 멸균수 1 ml에 1분간 2회 세척하였다. 세척한 쿠폰은 10 g의 glass bead(4 mm)와 9 ml의 멸균수와 함께 vortexing (Max, 1 min)하여 스테인리스 쿠폰에 부착되어 있는 균을 떨어트리는 과정을 가졌다. 제거과정을 거친 균 혼탁액 1 ml를 10배 희석 과정을 통해 희석하여 TSA에 도말하여 37 ℃에서 18시간 배양 후 균의 생육을 확인하였다. 배 양 후 생성되는 집락(colony)의 수로 바이오필름의 형태로 부착되어 있던 균의 수를 확인하였다.. ▪ 프로폴리스 처리 7일간 배양한 스테인리스 쿠폰을 배양엑에서 제거한 후, 1 ml의 프로폴리스 (1.1, 0.55, 0.14 mg/µl)로 처리하여 37 ℃에서 배양하였다. 대조군은 프로폴리스를 처리하지 않은 채 37 ℃에서 배양하여 사용하였다. 각 쿠폰 샘플은 15, 30, 60분씩 처리하였으며, 그 이후의 과정은 위의 균 제거 과정의 세척 이후의 vortexing 단계부터 동일하게 처리하였다. 프로폴리스의 바 이오필름 저해 능력은 배양 후 생성되는 집락(colony)의 수를 통해 확인하였다.. • 투과전자현미경 관찰. St. mutans KCTC 3065와 P. gingivalis KCTC 5352에 프로폴리스가 어떤 영향을 미치는지 TEM을 통해서 확인하였다. St. mutans KCTC 3065에 0.555 mg/µl의 프로폴리스를 세시간 처 리한 균과 대조군으로는 처리하지 않은 균을 사용하였으며, P. gingivalis KCTC 5352는 프로폴 리스 2.22 mg/µl을 세시간 처리한 균과 처리하지 않은 균을 대조군으로 하여 사용하였다. 투과전 자현미경(Transmission electron microscopy, TEM) 관찰을 위한 표본의 채집을 위해 8000 rpm에서 3분간 원심분리 한 후, 상등액을 따라내고 펠릿을 세포의 단백질 고정을 위해 Modified Karnovsky’s fixative 2% paraformaldehyde와 2% glutaraldehyde가 함유된 0.05M sodium cacodylate buffer (pH 7.2)를 이용해서 실온에서 2시간 동안 세포를 고정하였다. 이후 0.05M sodium cacodylate buffer (pH 7.2)를 10분 동안 실온에서 보관 후 씻어내는 과정을 세 번 반 복하였고 지방의 고정을 위해 2% osmium tetroxide가 함유된 0.05M sodium cacodylate buffer (pH 7.2)를 사용하여 2시간 동안 실온에서 보관하여 세포를 재 고정하였다. 고정 후 증류. 642. 2013년 기초연구과제총서.

(8) 수로 2번 세척한 후 세포의 1차 염색을 위해 0.5% uranyl acetate를 이용하여 4 ℃에서 18시간 보관하였다. 이후 10분 간격으로 실온에서 에탄올 30, 50, 70, 80, 90, 100, 100, 100%를 이용 하여 탈수과정을 가졌다. 100% Propylene oxide를 15분 간격으로 2번 이용하여 transition과정 을 가졌다. Propylene oxide와 Spurr’s resin을 1:1, 0:1, 0:1 비율로 맞춘 후 각각 2시간, 12 시간, 2시간 동안 Penetron Shaker를 이용하여 반응 시켰다. 반응 후 새로운 resin으로 교체한 표본은 70 ℃에서 24시간 동안 건조 한 후 TEM (LIBRA 120, Carl Zeiss, Germany)을 이용하 여 관찰하였다.. • 전계방출주사현미경(Field-emission scanning electron microscopy, FE-SEM)관찰 7일간 형성한 B. cereus (ATCC 10876), E. coli O157:H7 (ATCC 35150), St. mutans (KCTC 3065)의 바이오필름에 프로폴리스의 영향을 확인하기 위해 전계방출주사현미경(Field-emission scanning electron microscopy, FE-SEM)을 통해 확인하였다. 각 바이오필름에 1. 1mg/µL 농 도의 프로폴리스를 60분간 처리하여 사용하였으며, 대조군으로는 프로폴리스를 처리하지 않은 스 테인리스 쿠폰을 사용하였다. 샘플은 단백질 고정을 위해 냉장온도(5 ℃)에서 2시간 동안 Karnovsky’s fixsation을 처리한 후, 0.05M sodium cacodylate buffer (pH 7.2)을 10분간 냉 장온도에서 보관하여 세척과정을 가졌으며, 이를 세 번 반복하였다. 세척한 시료는 2% osmium tetroxide와 0.1M cacodylate buffer를 1:1로 혼합한 후 냉장온도에서 2시간 처리하여 지방을 고정한 후 증류수로 2번 세척하였으며 각각의 에탄올(30-100%, 100%, 100%)로 10분간 실온에 서 처리하여 탈수과정을 가졌다. 탈수과정이 끝난 시료는 hexamethyldisilazane을 이용하여 10 분간 2회 반복하여 건조과정을 거진 후(Specimen drying), Sputter coater(BAL-TEC/SCD 005: PT coater 조건 timer 200)을 이용하여 시료의 코팅 작업을 거친 후 FE-SEM(Focused Ion Beam(FIB), Carl Zeiss, Germeny)를 이용하여 관찰하였다.. • 통계처리 각 실험 결과는 SAS Package (Statistical Analysis System, version 9.2. SAS Institute Inc. Cary, NC, U.S.A.)를 이용하여 분산분석 (Analysis of variance), Duncan의 다중 범위 검정 (Duncan’s multiple range test)를 실시하였다. 이 때 유의수준은 5%로 하였다.. 천연항균물질에 의한 식중독균 억제 및 Biofilm 형성 억제. 643.

(9) 4. 실험결과 및 고찰 • 식중독균과 충치균에 대한 항균활성 검색 본 과제의 목표는 다양한 식품에 이용가능한 한국 천연항균물질을 검색하여 식중독균과 충치균 에 대한 항균력을 조사하고, 천연항균물질 extract의 주요 식중독균과 충치균 억제 및 식중독균과 충치균의 biofilm 형성을 억제하는 것이다. 이를 위하여 실험에 사용된 10 종의 천연식품을 문헌고찰을 통하여 오미자, 삼백초, 인진쑥, 재 피, 송화가루, 생강나무, 솔잎, 어성초, 까마중을 선정하고, 프로폴리스는 위델스에서 생산한 프로 롤리스원액을 사용하였다. 항균성 결과, 오미자, 인진쑥, 재피, 송화가루, 솔잎, 프로폴리스 등이 그램양성균, 그램음성균, 충치균에 우수한 항균성을 보였음.. • 우수 항균물질의 추출 방법 확립 및 각 분획의 항균활성 시험 추출방법 확립 및 각 분획의 항균성 비교: 천연재료 중 항균성이 있는 것을 수집하여 용매와 물로 추출한 후, 식품에 오염가능한 대표적인 식중독균및 충치의 원인 미생물에 대하여 agar diffusion assay 실험을 통해 항균력을 테스트하였다.. Figure 1. Agar diffusion assay of S. mutans and Bacillus cereus. 644. 2013년 기초연구과제총서.

(10) 각 균의 Overnight culture를 0.75% soft TSA에 도말한 후 프로폴리스를 1/2 배율로 serial dilution하여 10㎕씩 주입하였다. 이후 냉장고에서 2시간 보관하여 diffusion 시킨 후 37 ℃에서 18시간 배양시켰다. 배양 후 항균 물질에 대한 sensitivity를 비교하였음. Figure 1에서는 S.. mutans와 B. cereus ATCC 10876의 프로폴리스에 대한 민감도를 보여주었다. Table 1과 2는 본 과제에서 추출한 천연항균물질과 프로폴리스의 9균에 대한 항균력과 수율을 보여준다. 항균성 결과, 오미자, 인진쑥, 재피, 송화가루, 솔잎, 프로폴리스 등이 그램양성균, 그램 음성균, 충치균에 우수한 항균성을 보였다.. Table 1. Antimicrobial activity of tested antimicrobial substances from Korea against foodborne and oral microorganisms. L. monocytogenes ATCC 19114. B. cereus ATCC 10876. S. aureus ATCC 12600. 60% 60% 60% n-hexane 열수추출 n-hexane 열수추출 n-hexane 열수추출 EtOH EtOH EtOH 오미자. +. +. +. +. 삼백초. +. +. +. +. 인진쑥. +. +. +. 재피. +. +. +. + +. +. 송화가루. +. +. +. +. 생강나무. +. +. +. +. +. 솔잎. +. +. +. +. +. +. +. +. 어성초 까마중. + +. +. + + +. +. 천연항균물질에 의한 식중독균 억제 및 Biofilm 형성 억제. 645.

(11) E. coli O157:H7 ATCC 35150. E. sakazakii ATCC 29544. S. Typhimurium DT104. 60% 60% 60% n-hexane 열수추출 n-hexane 열수추출 n-hexane 열수추출 EtOH EtOH EtOH 오미자. +. 삼백초. +. +. +. +. +. +. 인진쑥. +. +. 재피. +. +. 송화가루. +. 생강나무. +. 솔잎. +. +. +. +. + + +. +. + +. +. +. +. +. 어성초. +. +. 까마중. +. +. St. sobrinus KCTC 5134. St. mutans KCTC 3065. +. +. P. gingivalis KCTC 5352. 60% 60% 60% n-hexane 열수추출 n-hexane 열수추출 n-hexane 열수추출 EtOH EtOH EtOH 오미자. +. 삼백초. +. 인진쑥 재피. +. +. +. +. +. +. +. +. 송화가루. +. 생강나무. +. 솔잎. +. +. +. +. +. +. +. + +. 어성초. +. +. 까마중. +. +. 646. 2013년 기초연구과제총서.

(12) Table 2. Yield of extraction of antimicrobial activity . 추출 수율 (%). 시료명. 60% EtOH. 95% n-hexane. 열수추출. 오미자. 51.64. 9.34. 55.82. 재피나무. 21.88. 9.20. 16.86. 삼백초. 19.24. 7.02. 17.56. 생강나무. 9.92. 0.92. 9.30. 송화가루. 16.62. 1.78. 21.32. 인진쑥. 12.16. 1.10. 13.38. 솔잎. 28.10. 5.40. 21.92. • 프로폴리스의 항균활성 시험 식중독을 야기하는 병원성 균과 구강구취균에 대한 프로폴리스의 항균활성은 한천확산법을 통해 실험하였다 (Table 3). 프로폴리스의 항균력은 배양 후 접종한 프로폴리스의 주변에 생기는 저지환의 크기로 판별하였 으며 저지환의 크기가 클수록 항균력이 큰 것으로 간주하였다. 프로폴리스는 그람 음성균에 비해 그람 양성 균과 구강구취균에 활성이 더 크게 나타나는 것을 확인 할 수 있었다. 특히 B. cereus 와 St. sobrinus가 프로폴리스에 가장 민감하게 반응하였다(Figure 1). 프로폴리스의 농도가 진할 수록 접종 부위 주변에 나타나는 저지환의 직경이 넓었으며 이를 통해 균에 대한 프로폴리스의 항 균력은 농도의존적임을 확인할 수 있었다.. 천연항균물질에 의한 식중독균 억제 및 Biofilm 형성 억제. 647.

(13) Table 3. Antibacterial effects of propolis (propolis 10 ㎕) Propolis concentration (mg/㎕). G+. G-. Oral microorganisms. 2.22. 1.11. 0.55. 0.275 0.138. B. cereus ATCC 10876. +++. +++. ++. ++. +. L. monocytogenes ATCC 19114. ++. +. +. -. -. S.aureus ATCC 12600. +++. -. -. -. -. E.sakazakii ATCC 29544. +. -. -. -. -. S. Typhimurium DT104. ++. +. -. -. -. E. coli O157:H7 ATCC 35150. ++. +. -. -. -. S. mutans KCTC 3065. ++. +. +. +. -. S. sobrinus KCTC 5134. +++. +++. +++. ++. +. P. gingivalis KCTC 5352. +. +. +. +. +. 또한 한천확산법을 통해 균에 대해 저해가 나타나는 최소한의 농도인 최소저해농도(minimum inhibitory concentration; MIC)을 나타내었다(Table 4). 그람 음성균은 주로 1.11~2.22 mg/µl 의 MIC의 비교적 높은 농도에서 MIC를 형성했으며 그람 양성 균은 0.138~2.22 mg/µl, 구강구 취균 0.138 ~ 0.275 mg/µl의 MIC로 낮은 농도에서 MIC를 형성하였다. 역시 그람 음성균의 MIC가 구강구취균과 그람 양성균의 MIC보다 높은 농도에서 형성됨을 확인할 수 있었다.. 648. 2013년 기초연구과제총서.

(14) Table 4. Antibacterial effects of propolis (propolis 10 ㎕) MIC (mg/㎕). G+. B. cereus ATCC 10876. 0.138. L. monocytogenes ATCC 19114. 0.55. S. aureus ATCC 12600. 2.22. E. sakazakii ATCC 29544. 2.22. S. Typhimurium DT104. 1.11. E. coli O157:H7 ATCC 35150. 1.11. S. mutans KCTC 3065. 0.275. S. sobrinus KCTC 5134. 0.138. P. gingivalis KCTC 5352. 0.138. G-. Oral microorganisms. Rhim et al.(2002)은 구강 병원균과 그람 양성균, 그람 음성균, 효모균에 대한 프로폴리스의 에탄올 추출물의 항균력이 20 µg/mL 부근에서 형성하였다고 보고하였으며, Kim et al. (1995)이 보고한 St. mutans에 대한 프로폴리스 에탄올 추출물의 최소 저해 농도 0.13~1 mg/mL 보다 훨씬 높은 농도였다. 이는 항균활성 측정법과 프로폴리스의 접종량 등에 대한 차이에 의한 것으로 추측된다. Artika et al.(2011)은 캔디에 프로폴리스를 첨가하였을 때 프로폴리스의 함량을 6%(w/v) 정도 첨가하였을 때부터 항균성을 나타내었다고 보고하였으며, Elaine et al.(2002)가 P. gingivalis의 MIC가 0.25 µg/mL라고 보고한 것과 비교하여 비교적 본 실험의 결과와 비교적 유사한 수준이었다.. • 우수 천연항균물질의 열과 pH에 대한 안정성 실험 (가) 항균성 시험에서 우수한 항균성을 보인 오미자, 인진쑥, 재피, 송화가루, 솔잎, 프로폴리스 중, 가장 효과가 좋은 프로폴리스를 선택하여 열과 pH에 대한 안정성을 시험하였다. Table 5 는 프로폴리스를 가열처리 (40~100 ℃)와 pH의 변화(4~10)를 달리하였을 때 항미생물성의 변화측 정한 결과이다. 프로폴리스 0.555 mg/㎕을 각각 40, 60, 80 그리고 100 ℃ 에서 10분 동안 열 처리한 것과 프로폴리스의 pH를 각각 4, 6, 8, 그리고 10으로 조절한 프로폴리스를 준비하여 agar diffusion assay를 하였다. 천연항균물질에 의한 식중독균 억제 및 Biofilm 형성 억제. 649.

(15) 가열 후엔 그람 양성균에 대해선 비교적 높은 온도에서 가열하였음에도 프로폴리스가 활성을 나 타나는 것을 확인할 수 있었으며 구강구취균에 대해서는 열처리에 따라 활성을 잃는 모습을 확인 할 수 있었다. 또한 그람 음성균에 대해서는 열처리를 하기 전과 비교하여 항균력이 나타남을 확 인할 수 있었다. 프로폴리스의 일반 pH는 pH 5 정도이며 pH를 4, 6, 8 그리고 10으로 조절하고 프로폴리스의 활성이 감소하는 모습을 확인할 수 있었다. 비교적 pH 4와 pH 8에서는 약하게 항균 활성을 유지 하는 것으로 나타났으며 또한 열처리 후의 프로폴리스와 마찬가지로 그람 음성 균에 비교적 효과 가 있음을 확인할 수 있었다. Chung et al.(2003)은 멸균 식염수에 50%(w/v) 마늘 착즙액과 100 ℃에서 30분간 열처리한 마늘 착즙액을 15종의 식중독균과 젖산균에 접종하여 항균력을 조사하였다. 생마늘의 경우 식중독 균과 젖산균에 대해 강하게 항균력을 나타냈으나 열처리를 한 마늘의 경우 비교적 활성을 잃는 모 습을 보였다. Park et al.(1995)은 열처리한 돌산갓 추출물이 4가지 균에 대해 열에 매우 안정하 다고 보고하였으며, 60~120 ℃에서 오미자 에탄올 추출물을 1시간씩 처리한 결과 항균력의 변화 가 열처리 전과 비슷하게 안정하다고 보고하였다. Yoon et al.(2010)은 모자반 에탄올 추출물이 식품의 부패 및 식중독 관련된 균주 16종에 대해 모자반 에탄올 추출물이 121 ℃에서 15분간 열 처리한 것과 pH를 2~10의 범위로 조정하여도 안정하다고 보고하였다. 류충호(1997)는 S. aureus,. E. coli 의 균에 85 ℃에서 20분간 열처리 한 홍삼 액기스의 동일한 항균활성을 관찰하였으며 항 균성 물질에 대해서 열에 안정한 것으로 보아 비단백질 성이며 에테르 분획 및 에틸아세테이트 분 획에 존재하는 수용성 물질일 것으로 추측하였다. 정강현(2001)은 오미자의 에탄올 추출물을 1시 간씩 60~120 ℃의 범위에서 열처리 하였다. 열처리 온도가 올라갈수록 추출물의 색이 변색되었 으나 항균력의 변화는 나타나지 않아 열에 안정한 물질임을 증명하였으며, 이소영 등(2009), 김동 현 등(2012) 역시 지충이(Sargassum thunbergii)의 에탄올 추출물이 121 ℃에서 15분간 열처리 하여도 항균력에 변화가 없으며 pH 역시 2~8 범위 안에서는 안정하다고 보고했다. 그 외에 감태 추출물, 패 추출물, 와송, 홀스래디쉬 등이 열에 안정하며, 폭넓은 pH 범위에서도 항균성이 유지 된다고 보고된 바 있다. 하지만 홍삼의 경우 열처리 한 후 사포닌이 활성을 잃고 산성 조건에서 사포닌이 분해되는 현상을 발견하였다(Krishnananda and Shyamalava, 2000; Choi et al., 2008; Kim et al., 2009; Lee et al., 2009; Jung et al., 2011).. 650. 2013년 기초연구과제총서.

(16) Table 5. Antimicrobial activity of heat treated and acid controlled propolis Heat treatment. Acid treatment. microorganisms 40℃. 60℃. 80℃ 100℃. pH4. pH6. pH8. pH10. B. cereus ATCC 10876. ++. ++. ++. ++. -. -. -. -. L. monocytogenes ATCC 19114. +. +. ++. ++. +. +. +. +. S. aureus ATCC 12600. +. +. +. -. -. +. +. +. S.t yphimurium DT 104. ++. ++. ++. +. +. +. +. +. En. sakazakii ATCC 29544. +. +. +. -. +. +. +. -. E. coli O157:H7 ATCC 35150. ++. ++. ++. -. +. +. +. +. S. mutans KCTC 3065. -. -. -. -. -. +. +. -. S. sobrinus KCTC 5134. -. +. -. -. -. +. +. -. P. gingivalis KCTC 5352. +. -. +. -. -. +. -. -. • 천연항균제의 식중독균과 충치균의 생육저해 기작 규명 실험 5. 각 균의 Overnight culture를 균 배양액 농도가 10 CFU/ml가 되도록 TSB에 희석한 희석액 에 농도를 다르게 조절한 프로폴리스 (900, 225, 56.25 mg/㎕)를 접종하여 37 ℃에서 배양함. 대조군으로는 멸균된 증류수를 처리하였다. 일정시간마다 균을 채취하여 TSA에 도말한 후 37 ℃ 에서 18시간 배양하여 프로폴리스의 각 균에 대한 항균활성은 배양 후 생성되는 conoly 를 계수 하여 나타내었다. 실험결과는 3번씩 반복하여 평균값을 나타내었다. 실험결과, 프로폴리스가 첨가 되지 않은 대조군이 시간이 지남에 따라 균수가 증가하는 것에 비해 프로폴리스의 농도가 높을 수 록 짧은 시간 내에 균이 크게 사멸하는 모습을 보였다. 그람 양성균과 구강구치균이 그람 음성균 에 비해 프로폴리스에 더 민감도가 높았던 항균성 결과와 같이, 그람양성균과 구강구치균은 시간 이 흐름에 따라 급격히 사멸하였다. 그람 음성균의 경우엔 균의 사멸곡선이 비교적 완만하게 나타 났으며, E. sakazaki ATCC 29544의 경우, 정균 작용을 가지는 것으로 보였다.. 한천확산법에서 큰 활성을 보였던 균 중에서 그람 양성균은 B. cereus, L. monocytogenes와 그람 음성 균 En. sakazakii를 상대로 배양액 내에서 프로폴리스가 균의 생육을 저해하는 과정을. 천연항균물질에 의한 식중독균 억제 및 Biofilm 형성 억제. 651.

(17) 확인하였으며, 그 결과는 Figure 2에 나타내었다. 전반적으로 프로폴리스는 농도에 따라 균에 대 해 정균 작용과 살균작용을 갖는 것을 확인 하였다. 사용된 프로폴리스의 농도는 0.22, 0.06, 0.01 mg/µl이며 프로폴리스의 농도가 높을수록 균의 사멸 속도가 빠르고 사멸 정도가 크게 나타나 프로폴리스의 항균력은 농도의존적이었다. 그람 양성균인 B. cereus와 L. monocytogenes 중에서도 비교적 L. monocytogenes가 사멸 속도가 더 빨랐다. B. cereus에 대해 프로폴리스는 성장을 저해 하는 정균 효과를 보였으나, L. monocytogenes에 대해서는 0.22, 0.06 mg/µl의 두 개의 농도에서 살균 효과를 확인하였다. B. cereus와 L. monocytogenes의 세포에 프로폴리스 0.22 mg/µl를 처리한 결과 시간에 따라 유의적인 차이를 보이면서 감소하였으며 (P<0.01), En. sakazakii 역시 유의적으로 감소하는 모습을 보였다(P<0.05).. Park et al.(2008)은 수용성 프로폴리스가 156.3 ppm 이하의 농도에서 B. cereus의 생육을 저해하기 시작하며 312.5 ppm 이상에서 사멸시키는 모습을 발견했다고 보고하였다. 한천확산법에 서 그람 음성균 중에서 비교적 큰 활성을 보였던 En. sakazakii를 상대로 감수성을 시험하였으며 프로폴리스가 En. sakazakii를 상대로 정균 효과를 나타냄을 확인하였다. 0.22 mg/µl의 프로폴리 스 농도에서 B. cereus와 En. sakazakii에 대한 영향을 비교해 보았을 때 두 균에 대해 프로폴리 스는 정균 효과를 가졌으며 6시간 안에 log 4~5 CFU/ml 정도가 감소하는 것을 확인하였다.. 액체 배지 내에서 B. cereus, L. monocytogenes, En. sakazakii에 대한 프로폴리스의 항균력 은 고체 배지에서 MIC와 비교하였을 때 고체 배지에서 보다 낮은 농도로 프로폴리스가 액체 배지 에서 더 강한 감수성을 보였다. 고체 배지에서 그람 양성균이 0.138 ~ 0.55 mg/µl, 그람 음성균 이 2.22 mg/µl정도에서 MIC가 형성되는 것에 비해 액체 배지에서 최소 0.01 mg/µl에서도 프로 폴리스에 의해 균의 생육 저해 효과를 확인하였다. Son(2003)은 E. coli, B. cereus, S. aureus,. B. subtilis 등에 프로폴리스의 사멸 효과를 조사했다. 미생물의 생육에 영향을 미치는 효소의 활 성의 억제를 통해 항균활성이 나타나며 그람 양성 균에 대한 항균 효과가 더 우수하다고 보고하였다.. 4종의 구강구취균에 대해 균 배양액 내에서 프로폴리스의 항균력에 대한 결과는 Figure 3에 나 타내었다. 구강구취균은 식중독을 야기하는 병원균들에 비해 프로폴리스에 민감한 것으로 확인되 었다. 또한 고체 배지를 통한 agar diffusion assay에서의 결과에서 확인한 바와 같이 액체 배지 에서도 다른 구강구취균에 비해서 P. gingivalis가 같은 농도의 프로폴리스에서 상대적으로 사멸 정도가 낮은 모습을 확인 할 수 있었다. 가장 높은 농도인 0.22 mg/µl에서 다른 구강구취균이 사 멸효과를 갖는 것에 비해 P. gingivalis에 대해서는 정균 효과를 갖는 것을 확인하였다(P<0.01).. 652. 2013년 기초연구과제총서.

(18) 또한 0.06, 0.01 mg/µl의 프로폴리스에서 처리한 결과 대조군과 비교해 보았을 때 유의한 차 이를 보이는 것을 확인 하였다(P<0.05). P. gingivalis를 제외한 구강구취균의 경우 프로폴리스 농도 0.22 mg/µl에서 처리한 결과 2~3시간 내에 사멸하는 것을 볼 수 있었다. 또한 St.. mutans에 비해 St. sobrinus가 좀 더 낮은 농도의 프로폴리스에도 민감하게 반응 하는 모습을 확인할 수 있었다. 또한 식중독을 야기하는 병원균과 마찬가지로 고체 배지에서 0.138 ~ 0.275 mg/µl의 농도에서 MIC를 형성한 것에 비해 낮은 농도에서 감수성을 나타내는 것을 확인 할 수 있었다. 따라서 각 균들은 프로폴리스에 고체배지에서보다 액체 배지에서 더 민감하게 반응한다고 추측할 수 있었다. 본 실험 결과 프로폴리스가 식중독을 야기하는 병원균과 구강구취균에 있어 프 로폴리스 농도와 처리 시간에 따라 정균 효과 혹은 살균 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.. Kim and Chung(2011)의 보고에 따르면 B. cereus 세포에 프로폴리스 7.2, 1.8, 0.45 mg/ml의 농도에서 처리하였을 때 시간에 따라 균이 감소하였으며, 1.8, 7.2 mg/ml의 농도에서 100분 이 내에 모두 살균 효과를 보였다. 이는 실험 결과와 비슷한 양상이었으며 본 실험에서 B. cereus에 대해 프로폴리스가 정균 효과를 가진 것과 비교하여 살균 효과가 나타난 것은 접종한 프로폴리스의 양 등의 차이에 의한 것으로 보인다. 오레가노의 에탄올 추출물을 Sal. Typhimurium, L. monocytogenes에 처리하여 전반적으로 균의 증식의 억제를 확인되었으며, Sal. Typhimurium의 성장이 좀 더 많이 억제됨을 확인한 연구 보고가 있다(Choi and Rhim, 2008).. 천연항균물질에 의한 식중독균 억제 및 Biofilm 형성 억제. 653.

(19) Figure 2. Inhibition of foodborne pathogens in TSB in the presence of propolis at 37 ℃. (◆) no propolis; (■) propolis 0.22 mg/µl; (▲) propolis 0.06 mg/µl; (X) propolis 0.01 mg/µl. 654. 2013년 기초연구과제총서.

(20) Figure 3. Inhibition of oral microorganisms in TSB in the presence of propolis at 37 ℃. (◆) no propolis; (■) propolis 0.22 mg/µl; (▲) propolis 0.06 mg/µl; (X) propolis 0.01 mg/µl. 천연항균물질에 의한 식중독균 억제 및 Biofilm 형성 억제. 655.

(21) 656. 2013년 기초연구과제총서.

(22) • 투과전자현미경 관찰 프로폴리스의 세포에 대한 영향을 알아보기 위해, 프로폴리스에 비교적 감수성이 높았던 St. mutans KCTC 3065 (Figure 4)와 감수성이 낮았던 P. gingivalis KCTC 5352 (Figure 5)를 투과전자현 미경(TEM)을 통해 관찰하였다. 프로폴리스 농도는 앞선 시험 결과를 토대로 p. gingivalis KCTC 5352는 2.2 mg/µl, St. mutans KCTC 3065는 0.56 mg/µl의 농도로 처리하였다.. Figure 4는 P. gingivalis KCTC 5352를 관찰한 것으로 Figure 4(a)는 프로폴리스 처리를 하 지 않은 세포로 세포가 단단한 세포벽으로 감싸져 있는 모습을 확인할 수 있으며 세포 바깥쪽에 펩티도글루칸층 역시 확인할 수 있었다. 세포가 타원형과 원형인 이유는 박편 과정을 거치면서 세 포를 얇게 절단하여 생긴 모양으로 추측하였다.. Figure 4(b)는 프로폴리스를 세시간 처리한 후의 세포의 모습으로 세포벽이 얇아지고 붕괴된 모습을 확인 할 수 있었다. 또한 세포벽이 붕괴되면서 세포 내부의 물질이 밖으로 유출된 것을 볼 수 있었다. 유사하게 Kim et al.(2007)은 피톤치드를 P. gingivalis 현탁액에 첨가하여 배양하였 을 때 처리 전엔 세포의 내막과 외막이 발견되고 세포질 내의 밀도가 높게 나타났으나 피톤치드를 처리하였을 때 세포질 내의 내용물이 사라지는 모습을 발견하다. 또한, 농도가 증가함에 따라 내 막과 외막 두 개의 막만 존재하는 세포의 수가 증가하는 모습을 발견하였다고 보고하였다.. 천연항균물질에 의한 식중독균 억제 및 Biofilm 형성 억제. 657.

(23) Figure 4. Transmission electron photomicrograph of untreated (a) and propolis treated (b) Porphyromonas gingivalis KCTC 5352. St. mutans KCTC 3065의 TEM 결과사진은 Figure 5에 나타내었으며, 프로폴리스를 처리하 지 않은 세포 (a)의 경우 마찬가지로 세포벽과 세포질의 경계가 뚜렷하고 세포질을 세포벽이 감싸 고 있는 모습을 발견할 수 있었다. (b)는 프로폴리스 처리를 한 St. mutans KCTC 3065이며 세 포 벽이 얇아지고 세포벽과 세포질의 경계가 흐려지고 세포 내부의 물질이 빠져나오는 것을 확인 할 수 있었다. 또한, P. gingivalis에 비해 세포벽의 붕괴 정도가 크며, 세포 내부 물질의 유실 정도가 더 컸다. 본 실험을 통해 프로폴리스를 구강구취균에 처리하였을 때 세포벽이 붕괴되고 세포질 내부물질 들이 빠져 나와 세포의 붕괴를 유발하여 균의 활성을 잃게 함을 확인할 수 있었다.. 658. 2013년 기초연구과제총서.

(24) Figure 5. Transmission electron photomicrograph of untreated (a) and propolis treated (b) Streptococcus mutans KCTC 3065. Kim과 Chung(2011)은 프로폴리스가 B. cereus 세포에 처리하면 세포를 팽창시켜 세포벽을 붕괴시키고 전반적인 세포의 분해를 유도하고 균이 이분법 하며 분열하는 과정에 작용하여 균의 증식에 영향을 미친다고 보고하였다.. 천연항균물질에 의한 식중독균 억제 및 Biofilm 형성 억제. 659.

(25) • 천연항균물질을 이용한 식중독균과 구강균 바이오필름 억제 ▪ 바이오필름 형성 6종의 식중독균과 3종의 구강구취균의 스테인리스 쿠폰에서의 바이오필름 형성 과정은 다음 과 같다(Figure 6-8). 각각의 샘플은 7일간 배양하였으며, 1, 4, 7일째에 꺼내어 확인하였다. 배양 초기 각 균들은 3~5 log 수준의 균이 존재하였으며, 7일간의 배양 후에 식중독 균의 경 우 7~9 log 수준의 균이 검출되었다. 구강구취균의 경우 배양 7일 후에 6~7 log 수준의 균이 검출되었다. 균들은 4일째부터 급격한 성장을 나타내었다. 본 실험에서는 스테인리스 쿠폰에 바 이오필름을 형성시켰으나 기존의 대부분의 연구는 microtiter plate assay를 이용하거나 glass wool을 이용한 것이 대부분이었다. 특히 glass wool은 바이오필름 형성시 세균의 분리가 편리 하여 바이오필름 연구에 주로 사용한다. Glass wool에 형성된 B. cereus 은 48시간 후 10 log 수준의 바이오필름을 형성하였으며 비교적 본 실험보다 더 많은 양의 바이오필름이 빠른 시 간 내에 형성되었다 (Lee et al., 2006; Kim et al., 2011; Lee et al., 2013). 액체 배지에서 각 균은 어느 정도 성장기를 보이다가 시간이 흐를수록 일정기간 대수기를 거친 후 사멸하는 기작을 보이는데 반해 스테인리스 쿠폰에 부착된 균의 수는 7일간의 배양기 간 동안 점점 증가하는 추세를 보였다. 이는 Lee et al.(2006)의 보고에서 glass wool에 형성 한 바이오 필름의 균 수가 증가하는 모습과 일치하는 형태였다. 이와 같이 바이오필름의 균수가 점차 증가하는 이유는 바이오필름으로 부착된 세포가 바이오필름 내에서 계속 증식을 하거나 부 유 상태의 균들이 기존에 형성되어있던 바이오필름에 추가적으로 부착되면서 생긴 것으로 사료 된다. 또한 바이오필름은 배지에 첨가되어 있는 성분에 의해 영향을 받는다. 염화칼슘, 질산칼 슘, 황화칼슘이 포함되어 있는 배지에서는 바이오필름의 형성이 촉진되었다. 하지만 비교적 바 이오필름의 형성능이 우수하다고 평가되는 LB broth에서도 염류 첨가시 생성량이 저조해지는 것으로 나타났다(Noand Park, 2009).. 660. 2013년 기초연구과제총서.

(26) Figure 6. Biofilm formation of gram positive foodborne pathogens at 37 ℃ for 7 days.. 천연항균물질에 의한 식중독균 억제 및 Biofilm 형성 억제. 661.

(27) Figure 7. Biofilm formation of gram negative foodborne pathogens at 37 ℃ for 7 days.. 662. 2013년 기초연구과제총서.

(28) Figure 8. Biofilm formation of oral microorganisms at 37 ℃ for 7 days.. 천연항균물질에 의한 식중독균 억제 및 Biofilm 형성 억제. 663.

(29) • 프로폴리스의 바이오필름 저해 효과 각각 1.1, 0.55, 0.14 mg/µl 농도의 프로폴리스를 각 균에 15, 30, 60분씩 처리하여 나타내 었다(Figure 9-11). 이전의 액체 상태의 균 현탁액에 프로폴리스를 처리하여 균의 사멸 기작을 확인한 것에 비교하여 상대적으로 균의 사멸효과는 나타나지 않았다. 본 실험에서는 액체 배지에 서 좀 더 오랜 시간 프로폴리스 처리를 하였지만 Kim and Chung(2011)이 비슷한 농도와 시간 으로 B. cereus 세포에 프로폴리스 처리를 한 것과 비교하여도 저해 효과가 크지 않았다. 그람 음성균으로 이루어진 바이오필름보다 그람 양성균과 구강구취균으로 이루어진 바이오필름이 프로 폴리스에 더 크게 저해되는 모습을 나타내었다. 그람 양성균과 구강구취균의 경우 처리 15분 후에 는 거의 저해되는 모습이 보이지 않다가 30분 처리 후부터 저해되는 모습이 나타났으며, 1시간 처리 후 대체적으로 3 log 수준의 균이 저해되는 모습을 볼 수 있었다.. 그람 음성균 역시 그람 양성균과 구강구취균 만큼의 저해 효과는 나타나지 않았지만 1~2 log 수준의 균이 저해되는 모습이 나타났다. 특히 E. coli O157: H7와 P. gingivalis의 경우 거의 저 해되는 모습이 나타나지 않았다. P. gingivalis는 이전의 액체 배지와 한천확산법 실험방법과 유사 하게 프로폴리스에 큰 저항력을 나타내 저해 효과가 미미한 편이었다. Lee et al.(2011)는 구강양 치액이 치면세균막의 형성을 억제함을 보고하였다. Lee et al.(2011)의 보고와 본 실험에서 확인한 프로폴리스의 구강구취균에 대한 저해효과를 활용하여 구강양치액에 프로폴리스를 첨가함으로서 치 면세균막 형성 억제 효과에 시너지 효과를 나타낼 수 있을것으로 사료된다. 치면세균막에 회향추출 물이 plaque를 감소시키며, B. cereus의 바이오필름에 10, 20, 50% 농도의 에탄올과 10%의 NaCl로 30분간 처리하여 저감화 효과를 확인하였다(Kim et al., 2008; Lee et al., 2013).. 식중독과 구강질환의 예방을 위해 부유 세균의 감소뿐만 아니라 바이오필름의 형성을 억제하는 것이 중요하다. 따라서, 바이오필름이 형성되기 전에 지속적으로 유지, 관리하는 것이 중요하므로 이에 대한 연구가 지속되어야 할 것으로 사료된다. 본 연구에서는 각각의 균을 이용하여 in vitro 실험을 진행하였다. 실제 생활에 있어 한 종류의 균이 바이오 필름을 형성하여 존재하기 보다 다 양한 균이 상호작용함으로서 바이오필름을 형성하기 때문에 다양한 균 복합체의 바이오필름에 대 한 연구가 필요할 것으로 사료된다. 또한 프로폴리스를 이용한 본 연구를 통해 확인한 저감화 효 과를 이용하여 다른 처리와 병행하여 hurdle technique으로서 바이오필름을 제어할 수 있는 방법 을 개발할 수 있을 것으로 사료된다.. 664. 2013년 기초연구과제총서.

(30) Figure 9. Inhibitory effect of propolis on biofilms of gram positive foodborne pathogens at 37 ℃ (■) no propolis ; (▲) propolis 1.11 mg/µL ; (X) propolis 0.55 mg/µL; (Җ) propolis 0.14 mg/µL. 천연항균물질에 의한 식중독균 억제 및 Biofilm 형성 억제. 665.

(31) Figure 10. Inhibitory effect of propolis on biofilms of gram negative foodborne pathogens at 37 ℃ (■) no propolis ; (▲) propolis 1.11 mg/µL ; (X) propolis 0.55 mg/µL; (Җ) propolis 0.14 mg/µL. 666. 2013년 기초연구과제총서.

(32) Figure 11. Inhibitory effect of propolis on biofilms of oral microorganisms at 37℃ (■) no propolis ; (▲) propolis 1.11 mg/µL ; (X) propolis 0.55 mg/µL; (Җ) propolis 0.14 mg/µL. 천연항균물질에 의한 식중독균 억제 및 Biofilm 형성 억제. 667.

(33) • 전계방출주사현미경 (Field-emission scanning electron microscopy, FE-SEM)관찰 프로폴리스가 세포벽을 붕괴시켜 사멸시키는 모습을 TEM으로 관찰하여 보고된 있다(Kim and Chung, 2011; Kim and Chung, 2013). 본 연구에서는 B. cereus, E. coli O157: H7와. St. mutans에 프로폴리스 처리를 한 후 FE-SEM을 이용하여 관찰하였다(Figure 12-14). B. cereus의 경우(Figure 12), 프로폴리스 전 각 균이 실타래와 같은 분비물과 함께 얽혀있는 모습이었다. 1시간의 프로폴리스 처리 후에 처리 전과 같은 실타래가 비교적 적게 보였으며 세포 에 구멍이 생기고 찌그러지는 등 모양의 변화가 나타났다.. E. coli O157:H7는 덩어리의 균들이 한데 뭉쳐있던데 반해 프로폴리스 처리 후 균 주변을 프 로폴리스가 감싸고 있는 모습이 발견되었다. 하지만 다른 두 균과 비교하여 프로폴리스 처리 후 세포 모양의 변화는 크게 발견하지 못했다. 이전의 실험에서 프로폴리스가 E. coli에 큰 저해효과 를 나타내지 못했던 결과와 비교하여 프로폴리스가 E. coli 세포 자체에 미치는 영향이 미미한 것 으로 추정된다.. St. mutans는 프로폴리스 처리 후 가장 확실한 변화가 나타나 프로폴리스 처리 후 균의 모양 이 가장 크게 변화했으며 세포벽에 가장 큰 손상이 발견되었다. 이는 앞의 실험에서 St. mutans 에 대해 프로폴리스의 저해 효과가 컸던 것과 유사한 결과였다. 현미경 사진을 통해 발견된 균과 다른 구 형태의 물질은 스테인리스 쿠폰에 바이오필름이 형성되면서 생긴 변형물이거나 전처리 과 정에서 생긴 물질일 것으로 추측하였다.. 본 연구를 통해 세포의 바이오필름이 다른 부유 세균에 비해 균과 균이 서로 뭉쳐 덩어리의 모 습으로 존재하는 것을 확인하였다. 또한 프로폴리스 처리 후에 바이오필름 형태의 세포에 프로폴 리스가 세포벽을 용해시켜 손상시키거나 세포 모양 자체의 변화를 유도하여 활성을 잃게 하는 것 으로 사료된다.. 668. 2013년 기초연구과제총서.

(34) Figure 12. Field-emission scanning electron microscopy of untreated (a) and propolis treated (b) Bacillus cereus ATCC 10876 biofilm. Figure 13. Field-emission scanning electron microscopy of untreated (a) and propolis treated (b) Escherichia coli O157:H7 ATCC 35150 biofilm. 천연항균물질에 의한 식중독균 억제 및 Biofilm 형성 억제. 669.

(35) Figure 14. Field-emission scanning electron microscopy of untreated (a) and propolis treated (b) Streptococcus mutans KCTC 3065 biofilm. 5. 요약 및 결론 천연 항균 물질인 프로폴리스의 식중독균과 구강구취균에 대한 항균 능력을 알아보고 농도와 시 간에 따른 사멸 기작을 살펴보았다. 또한, stainless coupon에 7일간 형성한 바이오필름에 대해 프로폴리스의 저해 효과를 확인하였다. 그 결과는 다음과 같다.. • 프로폴리스는 식중독균(Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, MRSA, Salmonella Typhimurium, Escherichia coli, Pseudomonas fluorescence, Enterobacter. sakazakii)과 구강구취균(Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus, Porphyromonas gingivalis) 중 그람 양성 균과 구강구취균에 강한 항균효과를 가졌으며, 그 중 B. cereus와 St. sobrinus에 가장 강한 항균 효과를 나타냈다. • 액체 배지에서 프로폴리스의 농도와 처리 시간이 증가함에 따라 균의 수가 유의하게 감소하였다 (P<0.05). 프로폴리스의 최소저해농도(MIC) 결과와 비교하여 프로폴리스의 항균력은 고체 배지 보다 액체 배지에서 더 강했다. 따라서 프로폴리스가 각 균에 대해 살균 효과와 정균 효과를 나 타냄을 확인하였다. 구강구취균에 프로폴리스를 첨가하여 TEM 사진을 관찰한 결과 프로폴리스 는 세포벽을 붕괴시켜 세포의 활성을 잃게 함으로서 항균력을 나타냄을 확인하였다.. 670. 2013년 기초연구과제총서.

(36) • 프로폴리스를 열 처리한 결과, 가열 후에도 그람양성균과 구강구취균에 대해 약간의 항균작용을 유지하였으며, 그람 음성균에 대해 열처리 전과 비교하여 약간의 활성을 나타내었다. 프로폴리 스의 pH를 조절하여 활성을 실험한 결과 비교적 프로폴리스의 항균력이 감소하는 모습을 볼 수 있었으며, 그람 음성 균에는 약간의 항균력이 생김을 확인하였다.. • 6종의 식중독균과 3종의 구강구취균을 37 ℃에서 7일간 배양하여 sta스테인리스 쿠폰에 바이오 필름을 형성하였다. 배양 7일 후 5~8 log 수준의 균이 형성되는 모습이 발견되었으며 배양기 간이 증가할수록 형성되는 바이오필름 역시 증가하였다.. • 7일간 배양한 스테인리스 쿠폰에 프로폴리스 처리 후 E. coli O157:H7와 P. gingivalis를 제 외한 다른 균이 2~3 log 수준 정도 감소 효과를 나타내었다. FE-SEM을 통해 프로폴리스의 저해 효과는 형성된 바이오필름의 세포벽을 용해시켜 활성을 잃은 것에 의함을 확인하였다.. • 본 연구를 통해, 프로폴리스가 식중독균과 구강구취균에 항균 활성을 나타냄을 확인하였으며, 식중독균과 구강구취균이 형성한 바이오필름에도 저해 효과를 나타냄을 확인하였다. 따라서 본 연구의 결과는 프로폴리스가 식중독균과 구강구취균의 바이오필름과 관련하여 식중독과 충치를 예방하고 제거하기 위한 프로폴리스에 기반한 항균제 개발에 대한 가능성을 제시한다. 또한, 본 연구를 통해 기존의 구강청정제에 프로폴리스를 첨가하여 기존의 구강청정제에 첨가되는 인공 합성품의 양을 줄이고, 구강구취균에 대한 항균력을 증가시킴으로서 시너지 효과를 갖게할 것으 로 사료된다.. • 바이오필름은 항생제에 대한 저항성이 높기 때문에 바이오필름이 형성되면 치료를 위해 더 많은 항생제를 사용해야 한다. 본 연구를 통해 형성된 바이오필름에 항생제와 함께 프로폴리스를 처 리함으로서 사용하는 항생제의 양을 줄일 수 있을 것이라고 사료된다. 또한, 부유 세균에 대한 프로폴리스의 항균성을 통해 프로폴리스가 바이오필름 형성 초기에 관여하여 식품 공정에 있어 미생물의 성장을 억제하여 바이오필름 형성을 초기에 막을 수 있을 것으로 사료된다.. • 본 연구에서는 각각의 균에 대한 실험을 진행하였으나, 바이오필름은 실제 환경에서 한가지 균 에 의해 형성되는 것이 아니라 다양한 균 복합체에 의해 형성되므로 다양한 균 복합체를 이용한 연구가 필요할 것으로 사료된다.. 천연항균물질에 의한 식중독균 억제 및 Biofilm 형성 억제. 671.

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(43) Appendix. 678. 2013년 기초연구과제총서.

(44) Table 1. Inhibition of vegetative cells of Bacillus cereus in TSB broth in the presence of propolis at 37 ℃ Propolis concentration (mg/µl) control. 1) 2). 3). Surviving bacterial population(mean log CFU/ml)1) 0hour. 1hour. 2hour. 3hour. 4hour. 6hour. 6.45±1.32wa2) 6.45±1.32wa 6.53±1.36wa 6.52±1.38wa 7.22±0.84wa 7.37±0.93wa wa3). xb. 4.03±0.18. xb. 3.72±0.36. xc. 1.01±1.76. yc. 0.93±1.60. xc. 0.22. 6.45±1.32. 0.93±1.60. 0.06. 6.45±1.32wa 6.45±1.32wa 4.58±0.83xab 5.23±1.80wab 3.24±0.29xbc 1.89±1.72xc. 0.01. 6.45±1.32wa 6.45±1.32wa 4.82±0.80xabc 5.41±1.65wab 3.67±0.39xbc 2.91±0.51xc. The data shown are the means of experiments, expressed as mean ± standard deviation a-c: Different superscript means significant differences among samples in each time by Duncan’s multiple range test at 5% w-z: Different superscript means significant differences among samples in each propolis concentration by Duncan’s multiple range test at 5%. Table 2. Inhibition of vegetative cells of Listeria monocytogenes in TSB broth in the presence of propolis at 37 ℃ Propolis concentration (mg/µl) control. Surviving bacterial population(mean log CFU/ml)1) 0hour. 1hour. 2hour. 3hour. 4hour. 6hour. 5.33±0.71wa2) 5.33±0.71wa 5.90±0.96wa 5.90±0.96wa 6.00±1.00wa 6.30±0.97wa wa3). xb. 2.62±0.58. yb. 1.53±1.33. 4). 0.22. 5.33±0.71. N.D.. N.D.. N.D.. 0.06. 5.33±0.71wa 5.33±0.71wa 3.70±0.07xb 3.70±0.07xb 1.98±1.71xc. 0.01. 5.33±0.71wa 5.33±0.71wa 3.92±0.03xb 3.92±0.03xb 2.86±0.53xb 1.49±1.31xc. N.D.. 1). The data shown are the means of experiments, expressed as mean ± standard deviation a-c: Different superscript means significant differences among samples in each time by Duncan’s multiple range test at 5% 3 ) w-z: Different superscript means significant differences among samples in each propolis concentration by Duncan’s multiple range test at 5% 4) N.D=not detected 2). 천연항균물질에 의한 식중독균 억제 및 Biofilm 형성 억제. 679.

(45) Table 3. Inhibition of vegetative cells of Enterobacter sakazakii in TSB broth in the presence of propolis at 37 ℃ Propolis concentration (mg/µl) control. 1). 2). 3). Surviving bacterial population(mean log CFU/ml)1) 0hour. 1hour. 2hour. 3hour. 4hour. 6hour. 5.83±0.24wa2) 5.83±0.24wa 6.09±0.60wa 6.09±0.60wa 6.26±0.58wa 6.34±0.56wa wa3). xab. 3.77±0.67. xbc. 3.20±0.52. ybc. 2.82±0.85. yc. 1.11±1.93. yc. 0.22. 5.83±0.24. 1.11±1.93. 0.06. 5.83±0.24wa 5.83±0.24wa 3.49±0.40xbc 3.49±0.40xybc 3.11±0.57xyc 1.20±2.07xyc. 0.01. 5.83±0.24wa 5.83±0.24wa 4.04±0.21xb 4.039±0.21xb 3.95±0.27xb 3.77±0.24xb. The data shown are the means of experiments, expressed as mean ± standard deviation a-c: Different superscript means significant differences among samples in each time by Duncan’s multiple range test at 5% w-z: Different superscript means significant differences among samples in each propolis concentration by Duncan’s multiple range test at 5%. Table 4. Inhibition of vegetative cells of Streptococcus mutans KCTC 3065 in TSB broth in the presence of propolis at 37 ℃ Propolis concentration (mg/µl) control. 1) 2). 3). 4). Surviving bacterial population(mean log CFU/ml) 0hour. 1hour. 2hour. 3hour. 1). 4hour. 6hour. 3.45±0.53wa2) 3.45±0.53wb 3.96±0.07wab 3.96±0.07wab 4.74±1.31wab 5.27±1.01wa. 0.22. 3.45±0.53wa3) 2.84±0.13wb 2.42±0.20yb. 0.06. 3.45±0.53. 0.01. 3.45±0.53wa 3.45±0.53wa 3.28±0.33xa 3.28±0.33xa 3.28±0.53xa 1.94±1.69xa. wa. wa. 3.45±0.53. yab. 2.73±0.38. N.D. yab. 2.73±0.38. N.D.. N.D.. 2.26±0.31xb. N.D.. The data shown are the means of experiments, expressed as mean ± standard deviation a-c: Different superscript means significant differences among samples in each time by Duncan’s multiple range test at 5% w-z: Different superscript means significant differences among samples in each propolis concentration by Duncan’s multiple range test at 5% N.D=not detected. 680. 2013년 기초연구과제총서.