Original Article
원고 접수일 2010년 11월 31일, 게재 확정일 2010년 12월 31일 책임저자 장현석
(425-707) 경기도 안산시 단원구 고잔동 516번지, 고려대학교 안산병원 구강악안면 외과
Tel: 031-412-5370, Fax: 031-401-7125, E-mail: [email protected]
RECEIVED November 31, 2010, ACCEPTED December 31, 2010 Correspondence to Hyon Seok Jang
Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Korea University Ansan Hospital
516, Kojan-dong, Danwon-gu, Ansan 425-707, Korea
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가토 두개골 결손부에서 베타-삼칼슘 인산염 이식 시 혈소판 풍부 섬유소와 혈소판 풍부 혈장의 골형성능에 관한 연구
박정균ㆍ주현중ㆍ이의석ㆍ장현석ㆍ임재석ㆍ권종진
고려대학교 구강악안면외과
Abstract
The Effect of PRF and PRP for New Bone Formation of β-TCP in Skull of White Rabbit
Jeong Kyun Park, Hyun Jung Joo, Ei Seok Lee, Hyon Seok Jang, Jae Seok Lim, Jong Jin Kwon Dentistry of Oral and Maxillofacial Surgery, Korea University
Purpose: Addition of platelet-rich plasma (PRP) and platelet-rich fibrin (PRF) to grafting material has become widely accepted additively for bone regeneration because it can raise high expectations on it's clinical potential. The aim of this study was to evaluate the efficacy of PRP and PRF on early bone regeneration of rabbits when used in combination with beta tricalcium phosphate.
Methods: In eight rabbits, the calvarium was exposed and the two marrows were penetrated. After then these artificial bone defects were augmented with β-TCP or β-TCP with PRP or β-TCP with PRF and covered. The animals were sacrificed after four and eight weeks. Histologic findings were observed under the light-microscope and histomorphometric analysis was performed by measuring calcified area of new bone formation within the CSD.
Results: They demonstrated that new bone formation tended to be produced along the outline of graft materials. More amounts of newly bone was regenerated in β-TCP only and in combination ofβ-TCP with PRF and it was statistically significant.
In contrast, there was no significant difference between nothing apply and β-TCP with PRP groups in the relative amounts of newly mineralized bone.
Conclusion: Within the limitation of this study, it can be concluded that PRF in combination with β-TCP showed a positive effect on bone regeneration and statistically it was significant.
Key words: Platelet-rich plasma (PRP), Platelet-rich fibrin (PRF), Bone regeneration, β-TCP, New bone formation
Table 1. Experimental groups according to graft material
Group Graft material N
A (CMF) PRF＋β-TCP 4 weeks (n=2), 8 weeks (n=2) B (CMP) PRP＋β-TCP 4 weeks (n=2), 8 weeks (n=2) C (CM) β-TCP 4 weeks (n=2), 8 weeks (n=2) D (NT) Nothing 4 weeks (n=2), 8 weeks (n=2)
서 론
치조골 증대를 위한 골 이식재 중 자가골은 가장 이상적인 골 재료로 알려져 있다[1]. 그러나, 부가적인 수술 부위, 또한 채취할 수 있는 골량의 한계, 술 후 초래되는 병적 상태나 불편감 등의 단점도 있다. 이러한 문제점들을 극복하기 위해 최근에는 대체 골이식재를 사용하는 방향으로 나아가고 있으며 이를 위해 다양한 이식 골 재료에 대한 연구 개발이 활발히 진행 중이다[2].
베타-삼칼슘 인산염(tricalcium phosphate beta: β-TCP)은 많은 실험적, 임상적 연구 결과 골 전도 능력이 있는 생체 흡수성 합성 골 재료로 판명된 이식재로서[3], 훌륭한 생체 적합성 및 생물 분해 성을 가지며 bone mineral phase와 매우 유사하여 임상적인 골 증대술 등에 사용되어 왔으며[4] 최근 들어 더욱 관심을 모으고 있다. 다른 골 재료에 비해, β-TCP는 높은 수준의 순도를 지닌 균일한 화학 합성물로써 물리적, 화학적 특성이 명확 하여 그 생물학적 반응에 대해 신뢰도 높은 예측이 가능하다[5,6].
큰 다공성의 β-TCP는 세포의 부착과 성장을 유도하며 혈관 신생 과 골의 내부로의 성장을 촉진할 수 있다[7]. 이러한 특징의 β- TCP는 이식 초기에는 큰 역할을 하지 못하나 이후 신생골의 섬유주(trabeculae) 내로 완전히 혼합되기 시작함에 따라 점차적 으로 분해되어 최적의 기계적 강도를 보이는 성숙 골로 대체된다.
그러나, 한편 골유도 능력이 없으며 제한된 조직결합 처리 능력 및 느린 흡수율을 보이는 등 합성 골의 한계를 지니고 있다.
이를 극복하고자 이식 재와 다양한 보조 인자들(예, 정맥혈, 혈소 판 농축 혈장 등)을 배합시키는 것이 최근의 추세이다[8].
1998년 Marx 등[9,10]에 의해 소개된 혈소판 풍부 혈장 (platelet-rich plasma, PRP)과 혈소판 풍부 섬유소(platelet-rich fibrin, PRF)와 같이 골유도 물질을 포함한 재료를 이식재에 배합 하는 것은 상당히 전도유망한 치료 선택이다. 혈소판은 상처 치유 과정에서 매우 중요한 역할을 하는 인자이다. 이들은 상처 부위로 빠르게 이동하여 응고과정을 일으킨다[11]. 혈소판들은 혈소판 유래 성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF), 전환 성장인자-베타(transforming growth factors-β, TGF-β), vas- cular endothelial growth factor (VGEF), platelet-derived en- dothelial growth factor (PDEGF), platelet-derived angio- genesis factor (PDAF), 그리고 인슐린 유사 성장 인자-1 (insulin-like growth factor 1, IGF-1) 등을 포함하는 조직 재생 성장인자와 cytokines을 방출하며[12] 이 성장 인자들은 골 재생 에 기여하는 것으로 알려져 있으며 여러 연구를 통해 이 성장 인자들이 더 빠른 골 재생과 큰 강도를 지닌 성숙 골을 재생시키는 데 중요함이 입증되었다[12,13].
본 연구의 목적은 실험용 토끼의 두개골에 형성된 골 결손부위 에서 골 이식 실험을 통해 비교해봄으로써 β-TCP에 PRF와 PRP 를 첨가하는 경우 PRF와 PRP가 β-TCP의 구멍들 내부에서 골
재생을 촉진시킬 수 있는지의 여부를 판단하는 것이다. 즉, 본 연구를 통하여 이미 그 효과가 알려진 β-TCP의 이점이 PRP와 PRF와 배합됨으로 인해 더욱 강화될 수 있는지 확인하여 임상 적용의 가능성 및 의의를 검토해보고자 하는 것이다.
연구방법
1. 실험 동물
체중 3 kg의 뉴질랜드 화이트 수컷 토끼 8마리를 준비하였다.
본 실험에 앞서 우리에서 약 3주 동안 순응 기간을 거쳐서 스트레 스로 인한 실험 변수를 최소화시켰다. 토끼의 두개골 정중부 양쪽 에 원형의 임계 크기 결손부(critical-sized defect, CSD) [14]를 좌 우 1개씩, 총 2개를 형성하여, 첫 번째 실험군(A Group)은 PRF＋β-TCP (CMF), 두 번째 실험군(B Group)은 PRP＋β- TCP (CMP)를 이식하고 대조군 1 (C Group)은 좌측 β-TCP (CM), 대조군 2 (D Group)는 아무것도 이식하지 않았다 (NT)(Table 1). 각 군 별로 2마리씩 4주, 8주에 희생하여 총 8마리의 토끼를 실험에 사용하였다. 이렇게 하여 8마리의 토끼 두개골에 형성된 총 16개의 이식부를 A, B, C, D 네 군으로 분류하였다.
2. 골 이식재
합성골 이식재로는 CERASORB M (0.5 cc - Curasan AG, Kleinostheim, Germany)을 사용하고, 이는 순수한 β-TCP로 이루어져 있다. 본 실험에 사용한 입자의 크기는 500∼1,000μm 를 단독 또는 PRF 및 PRP와 병행하여 사용하였다.
3. 실험 방법 1) 골 이식술
토끼를 전신 마취시키기 위해서 염산 케타민(0.4 ml/kg:
Yu-han Co., Seoul, Korea)과 럼푼(0.2 ml/kg: Bayer Co., Seoul, Korea)을 4：1로 혼합하여 3 ml를 근육 내로 주입하였다.
전신마취 후 두개골 수술 부위의 모발을 제거한 후 베타딘으로
소독하고, 수술부위에 2% 염산 리도카인(1：100,000 epi-
nephrine Yu-han Co., Seoul, Korea)을 사용하여 국소 마취를
병행하였다. 절개선은 두정부 중앙에 시상축 방향으로 형성하였
Fig. 1. Surgical procedure of bone graft. (A) Prepared calvarial critical size defects. (B) Defect with CERASORB M.
Fig. 2. Surgical procedure: the 10.0 mm full-thickness defect is placed aside from the sagittal suture. CM: cerasorb M, CMP: cerasorb
M+PRP, NT: negative control, CMF: cerasorb M+PRF.다(Fig. 1A). 골막과 피부가 찢어지지 않도록 견인하였다. 정중선 을 기준으로 좌우 두 부위에 생리식염수 주수하에 trephine bur를 사용하여 원형의 결함을 한 개씩 형성시켰다. 결함 부위에 각각의 군에 해당하는 재료로 골 이식을 시행하였다(Fig. 1B)[15].
이 때 A군에는 각각의 개체에서 채취한 혈액으로부터 추출된 PRF를 약 0.8 ml씩 이식하고 B군에는 각각의 개체에서 채취한 혈액으로부터 추출된 PRP를 약 0.8 ml씩을 골 이식재에 첨가 혼합하여 적용하였다. 골 이식이 완료된 후 골막은 흡수성 봉합사 (4-0 Vicryl)로 피부는 나일론(3-0 Nylon) 봉합사로 봉합하여 수술을 마무리하였다. 술 후에는 겐타마이신 1 ml를 예방적으로 주입하였다[15].
2) PRF 및 PRP의 채취 및 적용
PRF는 골 이식술을 시행하는 날에 A군의 각 개체에서 채득한 혈액 약 5 ml씩을 원심분리기(PLACON
TM: Platelet Concentra- tor, Oscotec Inc., Cheonan, Korea)로 원심분리 시켜서 얻었 다. 우선 채득한 혈액 5 ml를 3,000 rpm하에서 10분간 원심 분리시킨 후 중간층을 선택하여 추출하여 PRF를 채취하였다.
PRP는 골 이식술을 시행하는 날에 B군의 각 개체에서 채득한 혈액 약 5 ml씩을 원심분리기(PLACON
TM: Platelet Concentra- tor, Oscotec Inc., Cheonan, Korea)로 원심분리 시켜서 얻었다.
우선 채득한 혈액 5 ml를 1차 원심분리 3분 실시 후, 혈장층인 상층 부위와 중간층(buffy coat) 부위를 선택하여 추출하였다.
추출한 혈액을 2차로 5분간 더 원심분리 시켰다. 두 단계 원심분리
Fig. 3. Histological results. (A) Negative Control (NT)-4 week, (B) CERASORB M (CM)-4 weeks, (C) CERASORB M+PRP (CMP)-4 weeks,
(D) CERASORB M+PRF (CMF)-4 weeks, (E) Negative Control (NT)-8 week, (F) CERASORB M (CM)-8 weeks, (G) CERASORB M+PRP (CMP)-8 weeks (H) CERASORB M+PRF(CMF)-8 weeks. H&E: hematoxylin & eosin staining, MT: Masson's trichrome staining.실시 후, 최종 시험관 내에서 비교적 맑고 투명한 최상층인 혈소판 희소 혈장(platelet-poor plasma, PPP)층은 버리고, 중간층 부위 와 잔여 혈구층인 최하층 부위가 남겨진 상태에서 혈소판이 풍부 한 중간층을 포함하여 추출해 내어서 PRP를 채취하였다(Fig.
2). 골 이식 시 한 개체마다 0.8 ml의 PRP를 골 이식재에 첨가 혼합하여 적용하였다.
4. 조직 형태학적 분석
골 이식 시행 4주, 8주 후 토끼를 희생시켜서 조직형태학적 분석을 실시하였다. 골 이식 부위인 원형의 결함 부위가 손상되지 않도록 주의하면서 골 이식 부위보다 넓게 주변 자가골의 일부까 지 포함시켜서 골 표본을 채취하였다.
이 골 표본을 72시간 동안 10% 중성 포르말린 용액에 고정시키 고 4시간 동안 질산으로 탈회한 후, 통상적인 방법대로 파라핀에 포매시켜 시상축 방향으로 절단하여 약 4∼5μm 두께의 절편 16개를 획득하였다. 이렇게 얻어진 절편을 poly-L-lysin을 도포 한 슬라이드에 부착하여 표본을 제작하였다. 이렇게 제작된 슬라 이드는 신생골과 주위 조직의 변화를 보기 위해 Hematoxylin-
Eosin 염색(H-E) 및 Masson's trichrome (MT)으로 염색하여 광학 현미경으로 관찰하였다(Fig. 3)[13]. 광학 현미경상의 이미 지 촬영은 올림푸스 디지털 현미경 카메라(Olympus, BX51)를 사용하고, 컴퓨터 프로그램 Image Pro Plus 6.3 (Media Cybernetics, LP, Silver Spring, MD, USA)로 촬영된 이미지 상에서 신생골의 면적 비율을 측정하였다(Fig. 4).
5. 통계 분석
통계처리는 SPSS Ver. 14.0 (SPSS, Chicago, IL, USA) 프로 그램을 사용하여 각 군의 신생골 면적 측정값 간의 통계학적 차이 t-test를 이용하여 유의수준 P ＜0.05에서 비교 분석하였다.
결 과
총 8마리의 개체가 실험에 사용되었으며 총 16개의 시편이
얻어졌다. 두개골의 결함 내부에 새로 침착된 신생골은 주로 결함
내부에 혼재해 있는 비정형의 합성골 이식재 입자를 둘러싼 주변
에서 관찰되었다. 각 시편마다 신생골이 형성된 부분의 면적을
Fig. 4. Histomorphometric measurements: (green) newly formed bone marked in an interactive manner and defined as bone surface
area (BA). (yellow) Newly formed soft tissue marked in an interactive manner Region of interest (ROI) marked in an interactive manner.(A) Negative Control (NT)-4 week, (B) CERASORB M (CM)-4 weeks, (C) CERASORB M+PRP (CMP)-4 weeks, (D) CERASORB M+PRF (CMF)-4 weeks, (E) Negative Control (NT)-8 week, (F) CERASORB M (CM)-8 weeks, (G) CERASORB M+PRP (CMP)-8 weeks, (H) CERASORB M+PRF (CMF)-8 weeks (by image pro 7.0).
Table 2. Result of measuring area of new bone formation
Group Graft material Mean (%) 4 weeks (SD) Mean (%) 8 weeks (SD)
A PRF＋β-TCP 59.022 (13.900), P=0.068 74.372 (2.832), P=0.0438
B PRP＋β-TCP 48.054 (16.198), P=0.193 68.542 (3.848), P=0.064
C β-TCP 43.008 (5.437), P=0.0498 59.242 (6.451), P=0.179
D Nothing 30.009 (1.023) 46.367 (11.255)
Fig. 5. Average new bone formation percentage per each group.
NEG: negative control, CEM: cerasorb M, CMP: cerasorb M+PRP, CMF: cerasorb M+PRF.
측정하여 합한 뒤 시편당 평균치를 구하여 다음과 같은 결과를 얻었다(Table 2).
β-TCP와 PRF를 혼합한 경우 평균 신생골 비율은 8주경 약 74.372%로 가장 많았으며 그 뒤를 β-TCP와 PRP 혼합한 경우, β-TCP만 적용한 경우가 순서대로 많았다.
대조군(D군)과 나머지 군 비교 시, 4주경 C군의 신생골 면적
비율이 통계적으로 유의성 있게 높았으며( P =0.049, P ＜0.05),
8주경 A군의 신생골 면적 비율이 통계적으로 유의성 있게 높은
결과( P =0.043, P ＜0.05)를 보였다. 또한 A군은 평균적으로 B군
보다 더 높은 신생골 면적 비율을 보였으며 이를 토대로 β-TCP는
신생골 형성에 효과가 있으며 PRF를 혼합하여 적용할 경우 더
높은 효과를 기대할 수 있다고 볼 수 있다. 또한 β-TCP에 PRP를
적용할 경우 β-TCP를 단독 적용할 경우보다 더 높은 신생골
형성 효과를 보였으나 통계적으로 유의한 차이를 보이지는 않았
고, β-TCP에 PRP를 적용한 경우보다 PRF를 적용한 경우 더
높은 신생골 형성을 기대할 수 있다고 볼 수 있다( P =0.043, P ＜
0.05)(Fig. 5).
고 찰
합성골 이식 시 PRP를 배합하는 경우 신생골량이 더 많은가에 대해서는 아직도 논란의 여지가 있다. 토끼 두개골에서 시행한 본 실험 결과 PRP가 ß-TCP에도 효과가 있을 것이라는 예상을 하였으나 PRP 배합군의 평균 면적은 ß-TCP 단독으로 사용한 경우보다 더 많았지만 그 차이가 통계적으로 유의한 수준의 것은 아니었으므로 ß-TCP 사용 시 PRP의 효과에 대해 확언하기는 어렵게 되었다.
2004년 Suba 등이 beagle dogs의 치조골 증대술에 Cerasorb (ß-TCP)와 PRP를 병용하여 그 효과를 보고자 6주, 12주, 24주 간격으로 관찰하였다[15]. 실험 결과 6주에 PRP를 병용한 군의 신생골 면적이 ß-TCP 단독으로 사용한 경우보다 더 많았으며 그 차이는 통계적으로 유의하였다. 그러나 12주째는 그 차이가 상당히 줄어들었으며 24주째에는 거의 개체간 차이가 없이 골 생성량이 비슷한 결과를 보였다. 즉, PRP의 ß-TCP 이식재에 대한 효과는 초기에 분명하다고 결론지을 수 있다.
2006년 Joseph Choukroun 등은 FDBA와 PRF를 Sinus aug- mentation에 병용하여 치유기간을 4개월까지 단축 가능하다고 주장하였고, 2007년 Schwartz-Arad 등은 Fibrin에서 Plate- let-Derived Growth Factor (PDGF), Transforming Growth Factor Beta (TGF-β), Insulin-Like Growth Factor 1 (IGF-1) 등의 growth factor가 분비되어서 PRP와 PRF를 골이식 부위에 적용할 경우 골침착의 양과 골재생의 질을 증가시킬 수 있다고 주장하였다[16]. 그러나, 이 두 실험은 platelet에서 형성된 PRP와 PRF의 골생성 촉진 가능성을 주장하였으며 ß-TCP와 혼합 시 골생성 촉진 가능성을 증명하지는 못하였다.
2009년 Meyer 등은 20명의 환자에서 33개의 상악동에 총 123개의 임플란트를 식립하는 실험을 하였고 ß-TCP와 PRP와 PRF를 혼합하여 골이식을 시행한 결과 자가골만 이식했을 경우와 비교하여 유의할만한 차이가 없다는 결과를 발표하였다[17]. 이 실험은 ß-TCP와 PRP와 PRF를 동시에 혼합하여 적용하여 자가 골 못지않은 결과를 얻음으로써 ß-TCP와 PRP와 PRF의 골생성 증대 효과를 증명하였으나 ß-TCP에 대한 PRP와 PRF의 골생성 증대 효과가 어느 것이 더 큰지는 알 수 없었다. 한편, 2009년 Kemal Findikcioglu 등은 PRP와 PPP가 bone healing에 가지 는 효과를 증명하였으며 PRP 첨가 시 Fibrin glue 보다 골생성이 우수하다고 주장하였다.
2010년 Gassling 등은 건강한 성인 10명에게서 PRP와 PRF를 추출하여 비교한 결과 PRF보다 PRP에 growth factor가 더 많이 함유되어 있다고 발표하였다[18]. 그러나, 이 실험은 임상적 적용 은 배제한 단순한 PRP와 PRF의 성장 인자를 비교한 것으로 실제 골이식재와의 결합시 PRP가 PRF보다 더 골생성 증가 효과를 가져올 것이라고 보는 것은 무리가 있다.
2010년 He 등은 14명의 성인을 대상으로 PRP와 PRF를 추출 하여 rat calvaria에 이식하여 비교한 결과 PRP가 초기에는 TGF-ß 1과 PDGF-AB를 많이 분비하였으나 시간이 지날수록 그 양이 줄어들었고 PRF의 경우 점진적으로 강력한 효과를 보였 다고 발표하였다[19]. 이 실험에서는 in vitro 에서 PRF가 PRP보 다 rat osteoblast의 증식과 분화에 더 강력한 효과를 보인다고 주장하였으나, ß-TCP와 혼합 시 어떠한 결과를 보이는지는 알 수 없었다. 본 실험에서는 초기 골이식량 증대 효과가 입증된 PRP의 ß-TCP 이식재에 대한 효과와 PRF의 ß-TCP 이식재에 대한 효과를 비교해보는데 의의가 있는 바 PRF가 PRP보다 ß-TCP 이식재에 대한 효과가 더 뛰어나다는 것을 관찰할 수 있었다.
궁극적으로 임상에서 ß-TCP를 이식재로 사용하는 경우 더 나은 효과를 보기 위해서는 ß-TCP에 PRF를 비롯한 좀 더 다양한 생체 재료를 첨가한 실험이 더 필요하리라 본다. 이와 더불어 시간 간격을 두고 실험함으로써 PRF의 효과가 최대로 나타나는 시기를 판단하여 임상에 적용할 수 있게 하는 연구가 앞으로 더 진행 되어야 하리라 생각된다.
결 론
PRP와 PRF가 ß-TCP의 골형성에 미치는 영향에 대한 본 실험 에 대해 다음과 같은 결과를 얻었다.
1. 결손 부위에 ß-TCP를 적용한 경우 통계적으로 유의하게 골형성이 증가하였다.
2. PRP를 ß-TCP와 결합하여 결손 부위에 적용할 경우 ß-TCP 단독 사용보다 골형성이 증가하였으나 통계적으로 유의 한 수준은 아니었다.
3. PRF를 ß-TCP와 결합하여 결손 부위에 적용할 경우 통계적 으로 유의하게 골형성이 증가하였다.
4. PRF를 ß-TCP와 결합하여 적용할 경우 PRP를 ß-TCP와 결합하여 적용하는 경우보다 통계적으로 유의하게 골형성이 증가 하였다.
결론적으로, 토끼의 두개골에 형성된 결함에 ß-TCP를 적용하 는 경우 골형성이 증가하였으며 PRP를 적용하는 경우보다 PRF를 혼합하여 적용하는 경우 골형성이 유의하게 증가하였으므로 ß-TCP와 PRF를 혼합하여 골결손 부위에 적용하는 것이 임상적 으로 의미가 있는 것으로 생각된다.
References
