․접수 : 2011년 7월 4일 ․수정접수 : 2011년 7월 29일 ․채택 : 2011년 8월 17일
＊교신저자 : 김종대, (706-828)대구광역시 수성구 상동 165, 대구한의대학교 한의과대학, 폐계내과학교실 전화 : 053-770-2122 팩스 : 053-770-2189 전자우편 : [email protected]
補中益氣湯의 마우스 경구 단회 투여 독성시험
김종대✽
대구한의대학교 한의과대학 폐계내과학교실
Single Oral Dose Toxicity Test of Bojungikkitang (Buzhongyiqi-tang) Aqueous Extract in ICR Mice
Jong-Dae Kim✽
College of Oriental Medicine, Daegu Haany University, Gyeongsan 712-715, Republic of Korea
Abstract
Objective : This study was to evaluate the single dose toxicity of Bojungikki-tang(Buzhongyiqi-tang, BJIKT) in male and female mice.
Method : Aqueous extracts of BJIKT were administered to female and male ICR mice as an oral dose of 2,000, 1,000 and 500 mg/kg (body weight) according to the recommendation of Korea Food and Drug Administration (KFDA) Guidelines. Animals were monitored for the mortality and changes in body weight, clinical signs and gross observation during 14 days after dosing, upon necropsy ; organ weight and histopathology of 12 principle organs were examined.
Results : we could not find any mortality, clinical signs, and changes in the body and organ weight. In addition, no BJIKT-treatment related abnormal gross findings and changes in histopathology of principle organs were detected except for some sporadic accidental findings.
Conclusion : The results obtained in this study suggest that the 50% lethal dose and approximate lethal dose of BJIKT aqueous extracts in both female and male mice were considered as over 2,000 mg/kg, the limited highest dosage recommended by KFDA Guidelines, and can be safety used in clinics.
Key words：Bojungikkitang(Buzhongyiqi-tang), single oral dose toxicity, mice, histopathology.
I. 서 론
근래 한약재 대량 생산에 따른 농약 등의 오 염과 중국산 수입에 의한 독성문제가 심각한 사회문제로 대두됨에 따라 탕약의 안전성에 대 한 국민들의 관심이 많아지고 있는 실정이다.
따라서 근래에 들어 한약 자체의 독성평가가 폭넓게 진행되어 왔으나, 한약이 장기복용 약물 이며, 또 잔류 가능성이 있는 잠재적인 독성 평가는 현재 거의 이루어지지 않고 있다. 이는 한약이 생약복합물이기 때문에 실험의 진행이 매우 어렵다는 문제점과 또 동물의 생체 내에서 약물의 동태를 파악하기 어려움이 있기 때문이 다. 하지만 오랫동안의 시행착오와 경험을 바탕 으로 확립된 처방전은 처방 자체로 하나의 의 약품과 같은 역할을 하게 되었다. 이에 따라 양 방의학에서 말하는 의약품의 독성평가에 준하 여 한의학의 처방을 적용․안전성 평가가 이루 어져야 할 것으로 생각된다.
1)이에 저자는 임상에서 補益劑로 勞役太甚 飮 食失節 身熱而煩 自汗倦怠, 脾胃氣虛로 인한 食少, 脈虛大無力, 四肢無力, 中氣下陷, 內藏下 垂 및 不能攝血 등의 증상에 광범위하게 사용하 는 보중익기탕(補中益氣湯)
2-4)의 안전성에 대한 객관적 근거를 확보하기 위해 한국식품의약품 안전청 의약품 등의 독성시험기준
4)에 명시되어 있는 마우스 경구 단회투여 독성시험을 실시하 여 유의한 결과를 얻었기에 보고하고자 한다.
II. 재료 및 방법
1. 실험동물 및 사양관리본 실험은 대구한의대학교 동물실험윤리위원 회의 승인(DHU-2010-01)을 받고 수행하였습니
다. 암수 각 20마리의 ICR 마우스(6-wk old upon receipt, SLC, Japan)를 9일간의 순화과정을 거 쳐 실험에 사용하였으며, 순화과정 및 실험 전 기간 동안 온도(20∼25℃)와 습도(30∼35%)가 조절된 사육실에서 마우스용 polycarbonate 사 육상자에 5마리씩 수용하여 사육하였고, 명암 주 기(light : dark cycle)는 12시간 주기로 조절하 였으며, 사료(Samyang, Korea)와 음수는 자유 롭게 공급하였다. 모든 실험동물은 투여일 및 최종 부검일 18시간 전 절식을 실시하였으며(이 기간에도 음수는 자유롭게 공급하였다), picric acid로 개체를 식별하였다.
2. 보중익기탕 추출물
본 실험에 사용된 약재는 약업사(Omniherb, 영천, Korea)에서 구입한 것을 현미경하에서 관 능검사를 통하여 선정하여 사용하였다. 본 실험 에 사용된 보중익기탕 1첩 분량의 조성은 Table 1과 같다. 선정된 약제 1첩 분량 (24.4g)을 취 하여 정제수 1,000ml로 60℃에서 3시간 동안 3 번 가열 추출한 후, 흡인 여과한 여과액을 rotary vacuum evaporator(Buchi Rotavapor R144, Bu- chi Labortechnik AG, Switzland)로 감압농축하 여 점조성의 추출물을 얻은 다음 programmable freeze dryer(Labconco Freezone1, Labconco Corp., MO, USA)를 사용하여 동결 건조시켜, 총 3.86g(수율 약 15.80%)의 연갈색 물 추출물 을 얻어 실험에 사용하였다. 물 추출한 보중익 기탕 동결 건조물은 -20℃의 냉장고에 보관 후 실험에 사용하였으며, 본 실험에서 사용한 용매 인 증류수에 100mg/ml의 농도까지 연갈색으로 비교적 잘 용해되었다.
3. 보중익기탕 추출물의 투여
현재까지 보중익기탕의 독성에 대한 보고를
찾아볼 수 없어, 한국식품의약품안전청 고시 제
Herbal Names Drug Names Scientific Names Amounts(g)
黃芪 Astragali Radix Astragalus membranaceus Bunge 6
人蔘 Ginseng Radix Panax ginseng C. A. Meyer 4
白朮 Atractylodes Macrocephalae Rhizoma Atractylodes macrocephala Koidzumi 4
甘草 Glycyrrhiza Radix Glycyrrhiza uralensis Fischer 4
當歸 Angelicae Gigantis Radix Angelica gigas Nakai 2
陳皮 Citri Pericarpium Citrus unshiu Markovich 2
升麻 Cimicifugae Rhizoma Cimicifuga heracleifolia Komarov 1.2
柴胡 Bupleuri Radix Bupleurum falcatum L. 1.2
Total 24.4
All individual herbs were purchases from local voucher(Omniherb, Youngcheon, Korea) after confirm the morphology under microscopy
BJIKT : Bojungikki-tang(Buzhongyiqi-tang),
Table 1. Composition of BJIKT Used in This Study
2009-116호
5)에 의거하여, 설치류 최고 한계투여 용량인 2,000 mg/kg을 최고 용량으로 설정하였 으며, 공비 2로 1,000 및 500mg/kg을 중간 및 저용량 투여군으로 설정하였다. 또한 암수 각 각에 대한 매체 대조군을 추가 하였으며, 실험 동물은 암수 각각 군당 5마리씩 실험에 사용하 였다. 모든 투여군에서는 보중익기탕 물 추출 물을 멸균 증류수에 용해시켜 20ml/kg의 용량 으로 존데(sonde)가 부착된 1ml 주사기를 이 용하여 강제 경구투여 하였다. 식이와 음수에 따른 약물의 흡수 변화를 최소화 하기 위해, 투여 후 대략 3시간 동안 사료와 음수 공급을 제한하였다.
4. 임상증상 및 체중의 관찰
모든 실험동물의 임상증상을 투여 전후에 각 각 functional observational battery test
5-6)를 기초하여 동물의 행동, 자극에 대한 반응성, 각 성도 및 경계성, 자세 및 보행 이상 등에 관한 일반증상을 관찰, 기록하였으며, 투여일 이후에 도 하루에 최소한 2번씩 모든 실험동물의 임상 증상을 관찰, 기록하였다. 또한 모든 실험동물 의 체중을 투여전 1일, 투여직전, 투여 후 1, 2,
7, 13 및 14일(최종 희생일)에 각각 측정하였으 며, 실험 시작시 개체차이에 따른 체중의 변화 를 최소화 하기 위하여, 투여일∼투여 후 7일, 투여 후 7일∼13일 및 투여일∼투여 후 14일간 의 체중 증가량인 증체량을 각각의 체중을 이 용하여 산출하였다.
5. 부검
투여 14일 후 모든 실험동물은 이산화탄소 마취 하에 부검을 실시하고, 주요 장기를 위주 로 이상 육안소견을 각각 관찰, 기록하였다.
6. 장기중량 측정
모든 실험동물은 육안부검 소견을 관찰 기 록한 후 하기의 장기에 대한 절대 중량을 각각 측정하였으며, 체중의 변화에 수반된 이차적 변 화를 최소화하기 위해 체중에 대한 각각의 장기 절대중량의 비율인 상대 중량을 산출하였다.
폐, 심장, 좌측 신장(Kidney-left), 비장, 좌측
고환(Testis-left), 간, 췌장 비장엽(Pancreas-
splenic lobes), 좌측 부고환(Epididymis-left),
좌측 하악임파절(Submandibular lymph node-
Groups Day after treatment
Total*
0a 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Vehicle control
Male 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0/5(0%)
Female 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0/5(0%)
BJIKT extract treated male groups
2,000mg/kg 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0/5(0%)
1,000mg/kg 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0/5(0%)
500mg/kg 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0/5(0%)
BJIKT extract treated female groups
2,000mg/kg 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0/5(0%)
1,000mg/kg 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0/5(0%)
500mg/kg 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0/5(0%)
Values are expressed as number of died animals
a treatment day
* total mortalities during 14 days of observation periods - died animals/total observed animals(percentages ; 5 mice per group)
BJIKT : Bojungikki-tang
Table 2. Mortalities Observed in Mice after Single Oral Treatment of BJIKT Extracts
left), 좌측 난소(Ovary-left), 뇌 및 자궁.
7. 조직병리
상기의 조직을 10% 중성포르말린에 18시간 이상 고정시킨 다음, 탈수를 거쳐 파라핀 포매 후 3μm의 절편을 제작하였다. 이후 hematoxylin
& eosin(H&E) 염색을 실시하고, 광학현미경 하 에서 이상 유무를 관찰, 기록하였다.
8. 통계처리
모든 수치는 평균 ± 표준편차로 표시하였으 며, 다중비교검증을 이용하여 통계처리를 실시 하였고, 분산동질성을 Levene test를 실시하여 검증하였다. 등분산일 경우, one way ANOVA test를 실시한 다음 Scheffe test로 사후 검증 을 실시하여 군간의 유의성을 측정하였다. 비등 분산일 경우에는 비모수 검증인 Kruskal-Wallis H test를 실시하여 유의성이 인정된 경우에는,
Mann-Whitney U(MW) test를 실시하여 군간 의 유의성을 검증하였다. 반수치사량 및 95%
신뢰한계(confidence limits)를 Probit 방법으로 측정하였으며, 임상 증상, 육안부검 및 조직병리 학적 소견은 각각 그 정도에 따라 0 (normal), 1+ (slight), 2+ (moderate) 및 3+ (severe)로 구 분하였다. 통계처리 및 Probit 방법은 SPSS for Windows(Release 14.0K, SPSS Inc., USA) 를 이용하여 평가하였으며, p-value가 0.05 이 하인 경우 통계적 유의성을 인정하였다.
III. 결 과
1. 사망례보중익기탕 물 추출물 투여와 관련 있는 사
망례는 실험 전 기간동안 관찰되지 않아, 모든
실험동물(5/5 ; 100%)을 최종부검을 실시하였
다(Table 2).
1,000mg/kg Male-03 Soft feces 1+ at Day 1 Fig. 1. Diarrhea detected as clinical signs.
Note that 1 (1/5 ; 20%) male mice treated with BJIKT extract 1,000mg/kg showed slight(1+) soft feces restricted to 1 day after treatment as one of accidental findings ; It is difficult to considered as BJIKT extract treatment related clinical signs because it did not showed any dose-relations in the present study.
BJIKT : Bojungikki-tang
2. 임상증상
경미한(1+) 연변 소견(Fig. 1)이 보중익기탕 추출물 1,000mg/kg 수컷 투여군에서만 투여 1 일 후에 국한되어 1례(1/5 ; 20%)로 인정된 이 외에 보중익기탕 물 추출물 투여와 관련된 임상 증상은 실험 전 기간 동안 인정되지 않았다.
3. 체중의 변화
각각의 동일 성별의 매체 대조군에 비해, 보중 익기탕 추출물 투여와 관련 있는 체중 및 증체 량의 변화는 관찰되지 않았다(Fig. 2∼3, Table 3).
4. 장기 중량의 변화
수컷 2,000 및 1,000mg/kg 투여군에서 비장의 절대 및 상대 중량 증가가 유의성 (p<0.01 또 는 p<0.05) 있게 관찰되었으나, 보중익기탕 추 출물 투여와 관련된 의미 있는 장기중량의 변화 는 인정되지 않았다(Table 4, 5).
5. 부검소견
다양한 정도[1∼3+]의 폐 충출혈, 가슴샘 위 축(atrophy), 비장 위축 또는 자궁부종 소견이 암수 매체 대조군을 포함한 모든 실험군에 걸 쳐 산발적으로 관찰되었다. 그리고 보중익기탕 물 추출물 수컷 2,000mg/kg 투여군에 국한되어 2례(2/5 ; 40%) 인정된 경미[1+]한 비장 종대 소 견과 암컷 1,000mg/kg 투여군에 국한되어 1례 (1/5 ; 20%) 인정된 경미한 신장 연노란색의 비 정형성 반점 소견 이외에는 의미 있는 육안 부 검소견은 인정되지 않았다(Table 6).
IV. 고 찰
보중익기탕은 李의 東垣十種醫書
8)에 처음
수록된 처방으로 補中益氣하고 升陽擧陷하는
효능이 있어 비위의 氣虛로 인한 증상과 氣虛
下陷 및 靑陽下陷의 증상을 치료하는데 사용
한다.
9)최근 실험 연구로는 간 보호 효과,
10)항
Male vehicle control
BJIKT extracts 2,000mg/kg treated male mice BJIKT extracts 1,000mg/kg treated male mice BJIKT extracts 500mg/kg treated male mice
b e fo re 0 1 2 7 1 3 s a c rific e
Body weights (g)
2 6 2 8 3 0 3 2 3 4 3 6 3 8 4 0 4 2 4 4 4 6 4 8
D a y s a fte r a d m in is te r a tio n
Fig. 2. Changes on the body weights during 14 days of observation in male mice after single oral treatment of BJIKT extracts.
No significant changes on body weights were detected in all BJIKT extract treated male groups as compared with male vehicle control, respectively.
Values are expressed as mean ± S. D. of five mice.
‡, all mice were overnight fasted ; before means 1 day before injection day 0 means just before injection
BJIKT : Bojungikki-tang
Groups Interval(g)
Day 0a ∼ Day 7 Day 7 ∼ Day 13 Day 0 ∼ Day 14 Vehicle control
Male 8.76±1.51 1.82±0.84 5.56±0.71
Female 5.52±0.55 2.70±1.94 4.90±1.35
BJIKT extract treated male groups
2,000 mg/kg 7.92±0.95 2.28±1.38 4.90±1.26
1,000 mg/kg 8.10±0.70 2.22±0.51 5.06±1.06
500 mg/kg 8.68±1.18 1.50±1.28 4.96±1.66
BJIKT extract treated female groups
2,000 mg/kg 6.36±0.92 2.02±1.03 5.02±0.23
1,000 mg/kg 5.88±1.42 2.04±1.18 4.78±1.97
500 mg/kg 5.26±1.06 1.26±1.46 3.84±0.94
Values are expressed as mean ± S. D. g of five mice
a Day of treatment after overnight fasted BJIKT : Bojungikki-tang
Table 3. Body Weight in Mice after Single Oral Treatment of BJIKT Extracts
‡
‡
Male vehicle control
BJIKT extracts 2,000mg/kg treated male mice BJIKT extracts 1,000mg/kg treated male mice BJIKT extracts 500mg/kg treated male mice
b e fo re 0 1 2 7 1 3 s a c rific e
Body weights (g)
2 6 2 8 3 0 3 2 3 4 3 6 3 8 4 0 4 2 4 4 4 6 4 8
D a y s a fte r a d m in is te ra tio n
Fig. 3. Changes on the body weights during 14 Days of observation in female mice after single oral treatment of BJIKT extracts.
No significant changes on body weights were detected in all BJIKT extract treated female groups as compared with female vehicle control, respectively.
Values are expressed as mean ± S. D. of five mice.
‡, all mice were overnight fasted ; before means 1 day before injection day 0 means just before injection
BJIKT : Bojungikki-tang
‡
‡
불안효과
11)및 항산화 작용,
12)항 알레르기 효 과,
13)면역활성 효과
14-16)및 항암효과
16-17)등이 보고 되었다.
본 연구에서는 보중익기탕 물 추출물의 일 반적인 독성시험 중 현재 한국식품의약품안전 청 고시 의약품 등의 독성시험기준
5)에 명시되 어 있는 마우스 경구 단회투여 독성시험을 실 시하여, 장기투여 독성시험과 생식․발생독성 시험을 위시한 특수 독성시험에 대한 기초자 료를 제공하고, 안전성을 확보하고자 하였다.
현재까지 독성에 대한 자료를 찾아 볼 수 없 어, 멸균 증류수에 100mg/ml의 농도까지 용해 시켜 20ml/kg의 용량 즉, 2,000mg/kg을 최고
농도로 투여하였다.
보중익기탕 물 추출물 2,000, 1,000 및 500
mg/kg을 단회 경구 투여한 다음 14일간 체중
및 임상증상을 관찰하였으며, 14일 후 최종 부
검을 통하여 12개의 주요 장기에 대한 장기
중량, 육안 부검 및 조직병리학적 관찰을 실시
한 결과, 단회투여 독성 시험에서 설치류 최대
한계투여 용량인 2,000mg/kg까지 보중익기탕
물 추출물 투여와 관련된 사망례가 나타나지
않았으며, 보중익기탕 물 추출물 투여와 관련
된 장기중량 및 육안 부검소견 역시 인정되지
않았다. 단지 보중익기탕 물 추출물 1,000mg/kg
수컷 투여군에서만 일시적인 연변 소견이 나타
Groups
Absolute weights of 12 principal organs(g)
Lung Heart Thymus Kidney L Adrenal
gland L Spleen T/O L Liver Pan S Brain Epi L
/Uterus LN L
Vehicle control
Male 0.195±
0.015
0.170±
0.008
0.059±
0.011
0.263±
0.015
0.004±
0.002
0.096±
0.007
0.141±
0.023
1.501±
0.091
0.166±
0.012
0.484±
0.016
0.051±
0.005
0.007±
0.001
Female 0.178±
0.008
0.135±
0.009
0.063±
0.010
0.181±
0.016
0.004±
0.002
0.136±
0.036
0.020±
0.007
1.202±
0.169
0.181±
0.019
0.469±
0.021
0.159±
0.072
0.003±
0.002
BJIKT extract treated male groups (mg/kg)
2,000 0.197±
0.019
0.167±
0.015
0.047±
0.018
0.287±
0.047
0.005±
0.001
0.192±
0.068a 0.117±
0.013
1.627±
0.250
0.182±
0.014
0.476±
0.022
0.049±
0.005
0.006±
0.002
1,000 0.197±
0.013
0.172±
0.006
0.056±
0.008
0.279±
0.056
0.004±
0.003
0.108±
0.018
0.121±
0.020
1.616±
0.140
0.166±
0.013
0.470±
0.019
0.049±
0.006
0.005±
0.002
500 0.193±
0.014
0.169±
0.013
0.047±
0.023
0.274±
0.035
0.002±
0.001
0.122±
0.021b 0.141±
0.015
1.632±
0.180
0.184±
0.017
0.473±
0.021
0.057±
0.009
0.006±
0.003
BJIKT extract treated female groups (mg/kg)
2,000 0.168±
0.011
0.140±
0.009
0.066±
0.013
0.172±
0.016
0.006±
0.003
0.109±
0.016
0.025±
0.004
1.179±
0.098
0.166±
0.016
0.467±
0.028
0.153±
0.033
0.006±
0.003
1,000 0.169±
0.009
0.143±
0.013
0.060±
0.015
0.174±
0.017
0.005±
0.002
0.120±
0.031
0.023±
0.008
1.142±
0.100
0.163±
0.020
0.461±
0.008
0.129±
0.027
0.005±
0.002
500 0.162±
0.010
0.138±
0.009
0.074±
0.011
0.176±
0.021
0.004±
0.001
0.122±
0.016
0.027±
0.003
1.170±
0.037
0.161±
0.007
0.461±
0.010
0.128±
0.028
0.007±
0.005
Values are expressed as mean ± S. D. of five mice
L, left sides ; T/O, testis/ovary ; Pan, pancreas ; S, splenic lobes ; Epi, epididymis ; LN, submandibular lymph node BJIKT : Bojungikki-tang
* p<0.01 and #p<0.05 as compared with male vehicle control by MW test
Table 4. Changes on the Absolute Organ Weights Observed in Mice after Single Oral Treatment of BJIKT Extracts
Groups
Relative weights of 12 principal organs (% vs body weights at sacrifice)
Lung Heart ThymusKidney L
Adrenal
gland LSpleen T/O L Liver Pan S Brain Epi L /Uterus LN L
Vehicle control
Male 0.535±
0.031
0.469±
0.022
0.162±
0.030
0.723±
0.049
0.012±
0.006
0.265±
0.016
0.390±
0.071
4.134±
0.287
0.458±
0.035
1.334±
0.071
0.139±
0.015
0.019±
0.002
Female 0.593±
0.019
0.449±
0.026
0.210±
0.030
0.602±
0.056
0.012±
0.006
0.455±
0.138
0.067±
0.027
3.994±
0.445
0.606±
0.082
1.562±
0.059
0.535±
0.260
0.011±
0.006
BJIKT extract treated male groups (mg/kg)
2,000 0.547±
0.028
0.466±
0.025
0.130±
0.049
0.794±
0.078
0.014±
0.004
0.541±
0.200a
0.325±
0.021
4.518±
0.552
0.509±
0.056
1.328±
0.086
0.137±
0.009
0.016±
0.006
1,000 0.544±
0.025
0.474±
0.019
0.155±
0.021
0.771±
0.149
0.010±
0.007
0.298±
0.039
0.335±
0.053
4.472±
0.462
0.459±
0.035
1.299±
0.060
0.134±
0.014
0.014±
0.005
500 0.534±
0.057
0.466±
0.045
0.126±
0.054
0.756±
0.094
0.005±
0.002
0.338±
0.064a
0.389±
0.042
4.480±
0.224
0.507±
0.042
1.307±
0.121
0.156±
0.023
0.016±
0.008
BJIKT extract treated female groups (mg/kg)
2,000 0.566±
0.044
0.471±
0.030
0.224±
0.044
0.578±
0.047
0.022±
0.009
0.367±
0.054
0.086±
0.011
3.977±
0.299
0.559±
0.061
1.576±
0.080
0.516±
0.117
0.020±
0.010
1,000 0.571±
0.045
0.482±
0.058
0.201±
0.037
0.588±
0.085
0.016±
0.007
0.405±
0.101
0.079±
0.028
3.839±
0.273
0.550±
0.083
1.556±
0.126
0.432±
0.086
0.016±
0.007
500 0.554±
0.042
0.471±
0.031
0.251±
0.034
0.602±
0.069
0.014±
0.005
0.417±
0.057
0.091±
0.012
3.993±
0.043
0.549±
0.014
1.573±
0.052
0.435±
0.093
0.025±
0.017 Values are expressed as mean ± S. D. of five mice
L, left sides ; T/O, testis/ovary ; Pan, pancreas ; S, splenic lobes ; Epi, epididymis ; LN, submandibular lymph node BJIKT : Bojungikki-tang
* p<0.01 as compared with male vehicle control by MW test
Table 5. Changes on the Relative Organ Weights Observed in Mice after Single Oral Treatment of BJIKT Extracts
Male Mice
Groups Vehicle control BJIKT extracts (mg/kg)
2,000 1,000 500
Lung Normal Congestion
3/5 2/5
4/5 1/5
3/5 2/5
5/5 0/5 Thymus
Normal Atrophy
4/5 1/5
4/5 1/5
5/5 0/5
4/5 1/5 Spleen
Normal Atrophy Hypertrophy
4/5 1/5 0/5
3/5 0/5 2/5
4/5 1/5 0/5
5/5 0/5 0/5
Female Mice
Groups Vehicle control
BJIKT extracts(mg/kg)
2,000 1,000 500
Lung Normal Congestion
4/5 1/5
4/5 1/5
4/5 1/5
4/5 1/5 Thymus
Normal Atrophy
4/5 1/5
5/5 0/5
5/5 0/5
5/5 0/5 Kidney
Normal
Atypical light yellow foci
5/5 0/5
5/5 0/5
4/5 1/5
5/5 0/5 Spleen
Normal Atrophy
4/5 1/5
5/5 0/5
5/5 0/5
5/5 0/5 Uterus
Normal
Edematous change
2/5 3/5
3/5 2/5
4/5 1/5
3/5 2/5 Values are expressed as observed animals/total observed animals
BJIKT : Bojungikki-tang
Table 6. Necropsy Findings Observed in Mice after Single Oral Treatment of BJIKT Extracts
B A
Vehicle control Male-04 CG 1+ Vehicle control Female-05 CG 1+
2,000mg/kg treated Male-02 CG 1+ 2,000mg/kg treated Female-05 CG 1+
1,000mg/kg treated Male-02 CG 1+ 500mg/kg treated Female-05 CG 1+
Fig. 4. Histopathological changes detected on the lung.
Note that slight(1+) lung focal congestional spots(CG)－thickening of alveolar lung inflammatory cell nfiltration with/without focal hemorrhages were randomly detected throughout the experimental groups tested regardless of genders including vehicle controls as sporadic findings not BJIKT treatment related toxicological signs.
A, Alveolar sac-respiratory bronchiole B, Bronchiole
BJIKT : Bojungikki-tang All Hematoxylin & Eosin stain Scale bars = 160µm.
Vehicle control Male-05 DE 1+ Vehicle control Female-05 DE 1+
2,000mg/kg treated Male-02 DE 1+ 500mg/kg treated Male-02 DE 1+
Fig. 5. Histopathological changes detected on the thymus.
Note that slight [1+] decreases of lymphoid cells in thymic cortex (DE ; as seen vacuolation or loosening of lymphoid cells) were sporadically detected throughout experimental groups including vehicle controls as sporadic findings not BJIKT treatment related toxicological signs.
M, Medulla C, Cortex
BJIKT : Bojungikki-tang All Hematoxylin & Eosin stain Scale bars = 160µm.
M C
C
Vehicle control Male-03 IF-FN 1+ Vehicle control Female-01 IF-FN 1+
2,000mg/kg treated Female-02 IF-FN 1+ 1,000mg/kg treated Male-02 IF-FN 1+
1,000mg/kg treated Female-02 FN-IF 1+ 500mg/kg treated Male-03 IF-FN 1+
Fig. 6. Histopathological changes detected on the liver.
Note that slight[1+] or moderate[2+] focal necrosis(FN) and inflammatory cell infiltrations(IF) were sporadically detected regardless of genders including vehicle controls as sporadic finings not BJIKT extracts treatment related toxicological signs.
C, Central vein
BJIKT : Bojungikki-tang All Hematoxylin & Eosin stain Scale bars = 160µm.
1,000mg/kg treated Male-01 CY 1+ 500mg/kg treated Male-05 CY 1+
1,000mg/kg treated Female-02 FN-IF 2+ High magnification of left square area
Fig. 7. Histopathological changes detected on the kidney.
Note that slight [1+] cyst formation (CY) was detected in one male treated with BJIKT extract 1,000 and 500mg/kg, and one female mice treated with BJIKT extract 1,000mg/kg showed slight focal abscess formation (AB), respectively as one of accidental sporadic finding ; they did not showed any dose-relations in the present study.
BJIKT : Bojungikki-tang All Hematoxylin & Eosin stain Scale bars = 160µm.
Male Mice
Groups Vehicle control BJIKT extracts (mg/kg)
2,000 1,000 500
Lung Normal
Congestional spot
3/5 2/5
4/5 1/5
3/5 2/5
5/5 0/5 Thymus
Normal Cortex DE*
4/5 1/5
4/5 1/5
5/5 0/5
4/5 1/5 Kidney
Normal
Focal cyst formation
5/5 0/5
5/5 0/5
4/5 1/5
4/5 1/5 Spleen
Normal Red pulp HP*
5/5 0/5
3/5 2/5
5/5 0/5
5/5 0/5 Liver
Normal
Focal IF‐FN*
3/5 2/5
5/5 0/5
4/5 1/5
4/5 1/5
Female Mice
Groups Vehicle control BJIKT extracts (mg/kg)
2,000 1,000 500
Lung Normal
Congestional spot
4/5 1/5
4/5 1/5
4/5 1/5
4/5 1/5 Thymus
Normal Cortex DE*
4/5 1/5
5/5 0/5
5/5 0/5
5/5 0/5 Kidney
Normal
Focal abscess formation
5/5 0/5
5/5 0/5
4/5 1/5
5/5 0/5 Liver
Normal
Focal IF‐FN*
3/5 2/5
4/5 1/5
4/5 1/5
5/5 0/5 Values are expressed as observed animals/total observed animals
*Abbreviations of signs–DE, decreases of lymphoid cells; HP, hyperplasia of lymphoid cells; IF, inflammatory cell infiltrations; FN, focal necrosis
BJIKT: Bojungikki-tang
Table 7. Histopathological Findings Observed in Mice after Single Oral Treatment of BJIKT Extracts
났고, 이외에는 보중익기탕 물 추출물 투여와 관련된 임상증상 역시 나타나지 않았다.
수컷 2,000 및 500mg/kg 투여군에서 나타난 비장 중량의 증가는 조직병리학적 검사결과, 적 색 수질내 임파구 증가가 인정되어, 이미 알려 져 있는 보중익기탕 물 추출물의 면역활성 효
과
14-16)등의 약리효과에 기인된 증상으로 추정
되어, 독성 증상은 아닌 것으로 판단된다. 한편 비장 중량을 제외하고, 본 실험에 사용한 모든 실험동물의 체중 및 장기중량은 동일한 주령의 마우스들의 정상 범주
18-19)에 포함되어 관찰되 었다. 또한 수컷 1,000mg/kg 투여군에서만 1례 나타난 연변 소견은 출현빈도가 비교적 낮고, 투여 1일 후에 국한되어 일시적으로만 나타났 고, 용량 의존성 역시 인정되지 않아 보중익기 탕 물 추출물 투여와 관련된 임상 증상은 아닌 것으로 생각된다.
육안 부검소견 상 관찰된 폐 충출혈, 가슴샘 위축, 비장 위축 또는 자궁부종 소견과 조직병 리학적 검사에서 관찰된 폐 충출혈, 가슴샘 피질 임파구 감소 또는 간의 국소 괴사 및 염증세포 침윤 소견들은 암수 매체 대조군을 포함한 모든 실험군에 걸쳐 산발적으로 관찰되었고 용량 의 존성이 인정되지 않아 보중익기탕 물 추출물 투 여와 관련 없는 우발적 병소로 생각된다. 그리 고 암컷 1,000mg/kg 투여군에서 육안부검 관찰 때 1례로 관찰된 신장의 연노란색의 비정형성 반점은 조직병리학적 관찰 결과 신장의 표면에 위치한 경미한 국소 농양 소견으로 판단되었으 나, 용량 의존성이 인정되지 않아 보중익기탕 물 추출물 투여와 관련된 독성 증상은 아닌 것으로 생각되었다. 또한 조직병리학적 검사에서 수컷 1,000 및 500mg/kg 투여군에 국한되어 각각 1례 (1/5 ; 20%)씩 관찰된 신장 낭포형성 소견 역시 출현빈도가 낮고 용량 의존성이 전혀 인정되지 않아서 보중익기탕 물 추출물 투여와 관련된 독
성 증상으로 간주하기 어려웠다. 한편 이들 병소들은 정상 마우스에서 드물게 인정되는 소 견으로 알려져 있고,
20-21)자궁은 estrus cycle에 따라 쉽게 변화할 수 있어,
22-23)자궁 부종 소견은 estrus cycle에 따른 이차적 변화로 추정된다.
US Environmental Protection Agency OPPTS 870.100
24)에 따르면 일반적으로 반수 치사량이 5,000∼15,000mg/kg인 물질을 무독성 물질로, 500∼5,000mg/kg을 비교적 저독성(Class III) 물 질로 규정하고 있으나, 한국식품의약품 안전청 고시 제 2009-116호,
5)설치류에서 투여한계 농 도를 2,000 mg/kg으로 제한하고 있다. 따라서 본 실험의 마우스 단회 경구투여 독성실험에서 보중익기탕 추출물의 반수치사량 및 개략적 치 사량은 각각 2,000mg/kg 이상으로 관찰되었다.
V. 결 론
본 연구에서는 한국식품의약품안전청 고시에 의거하여 임상에서 많이 사용하고 있는 보중익 기탕의 마우스 경구 단회투여 독성시험을 실시 한 결과, 단회투여 독성시험에서 설치류 최대 한 계투여 용량인 2,000 mg/kg까지 보중익기탕 물 추출물 투여와 관련된 사망례가 인정되지 않았 으며, 보중익기탕 추출물 투여와 관련된, 체중, 장기중량, 육안 및 조직병리학적 변화는 인정되 지 않았다. 수컷 1,000mg/kg 투여군에 국한되어 1례(1/5 ; 20%) 인정된 일시적인 연변 소견을 제외하고는 보중익기탕 물 추출물 투여와 관련 된 임상증상 역시 관찰되지 않았다.
따라서 보중익기탕 물 추출물의 마우스에 있
어서 반수치사량 및 개략적 치사량은 각각 2,000
mg/kg 이상으로 관찰되었으므로 보중익기탕은
비교적 안전한 약물로 판단된다.
감사의 글
