Single Oral Dose Toxicity Test of Yukmijihwangtanggamibang, a Polyherbal Formula in ICR Mice

六味地黃湯加味方의 마우스 경구 단회 투여 독성 평가

박미연*

대구한의대학교 한의과대학 폐계내과학교실

Single Oral Dose Toxicity Test of Yukmijihwangtanggamibang , a Polyherbal Formula in ICR Mice

Mee-Yeon Park*

Department of Internal Medicine, College of Oriental Medicine, Daegu Haany University

The object of this study was to evaluate the single dose toxicity of Yukmijihwangtanggamibang (YMJHTGMB), a polyherbal formula have been traditionally used as prevention or treatment agent for various lung diseases including chronic obstructive pulmonary disease (COPD), in male and female mice. Aqueous extracts of YMJHTGMB (Yield = 16.33%) wasadministered to female and male ICR mice as an oral dose of 2,000, 1,000 and 500 mg/kg (body weight) according to the recommendation of Korea Food and Drug Administration (KFDA) Guidelines. Animals were monitored for the mortality and changes in body weight, clinical signs and gross observation during 14 days after dosing, upon necropsy; organ weight and histopathology of 12 principle organs were examined. As results, we could not find any mortality, clinical signs, and changesin the body and organ weight except for soft feces restricted to YMJHTGMB 2,000 mg/kg treated two male mice (2/5; 40%) at 1 day after administration. In addition, no YMJHTGMB-treatment related abnormal gross findings and changes in histopathology of principle organs were detected except for some sporadic accidental findings. The results obtained in this study suggest that the 50% lethal dose and approximate lethal dose of YMJHTGMB aqueous extracts in both female and male mice were considered as over 2,000 mg/kg, the limited highest dosage recommended by KFDA Guidelines.

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Key words :

Yukmijihwangtanggamibang

, single oral dose toxicity, mice, histopathology

* 교신저자 : 박미연, 대구시 수상구 상동 165, 대구한방병원 폐계내과학교실

․E-mail : [email protected], ․Tel : 053-770-2126

․접수 : 2010/10/27 ․수정 : 2010/11/20 ․채택 : 2011/12/14

서 론

만성폐쇄성폐질환 (chronic obstructive pulmonary disease;

COPD)은 적절한 치료에도 진행하여, 완치가 불가능하고 전세계 적으로 3 번째로 중요한 사망원인으로 예측되고 있으며

¹⁾

, 최근의 보고에 의하면 국내 유병율이 45세 성인이상에서 17.2% 이상인 중요한 질환으로 취급되고 있다

²⁾

. 특히 COPD 환자들은 점진적 인 폐기능 손상으로 인한 활동의 제한과 기능상실을 겪게 됨에 따라 자아 존중감이 저하되고 우울에 빠지게 되어, 기본적인 일 상생활과 삶의 질과 안위에 영향을 주어, 전반적인 삶의 만족에 부정적인 영향을 미치나, 양방의학에서의 치료법은 거의 증상에 대한 대증치료만으로 진행을 느리게 하는 치료법이 대부분이다

3)

. 하지만 한방외래에 내원하는 환자들의 경우는 수개월에서 수 년간 양방치료 후에도 증상의 별무변화와 호흡곤란이 점차 심해 지고, 일상생활이 가능하지 않고, 양약의 의존성이 높아져 장기 간 약물 복용으로 인한 위장장애 및 면역기능 저하를 호소하는 경우가 많다. 이러한 난치성 호흡기 질환의 한방적 치료는 환자 의 삶의 질 개선뿐만 아니라 면역력 증강에 도움이 된다. 하지만 장기간 한약복용으로 인한 신체 독성에 대한 환자의 우려가 높 은 만큼 객관적 독성평가를 통해 난치성 호흡기 질환자들의 치 료에 안전성과 유효성을 근거화 하기 위해 한의학에서는 이러한 다용처방에 대한 안전성 확보가 시급하며, 현재 한약 복합 처방 에 대한 독성 연구가 진행되고 있으나, 아직까지 근거 확보가 부 족한 실정이다

^4-9)

.

또한 전임상실험의 독성평가에 따른 안전성 확보를 통해 근

거중심의학을 위한 임상시험을 위해서라도 기존 임상에서 다용

하고 있는 한약처방에 대한 독성평가의 근거마련이 필요한 실정

Table 1. Composition of Yukmijihwangtanggamibang Used in This Study

Herbs Scientific Names Amounts (g) Producing District

Rehmanniae Radix et Rhizoma Preparata Rehmannia glutinosa var. purpurea Makino & Nemoto 16 China

Cornus Fruit Cornus officinalis Siebold et Zucc. 8 Uiseong, Kyungpook

Dioscoreae Rhizoma Dioscorea batatus Decne. 8 Andong, Kyungpook

Moutan Cortex Radicis Paeonia suffruticosa Andrews 6 China

Hoelen White Poria cocos Wolf 6 China

Alismatis Rhizoma Alisma canaliculatum A.Br. & Bouche 6 Yeongju, Kyungpook

Citri Unshii Pericarpium Citrus unshiu S.Marcov. 4 China

Asparagi Tuber Asparagus cochinchinensis Merrill 4 China

Fritillariae Cirrhosae Bulbus Fritillaria ussuriensis Maxim. 4 China

Anemarrhenae Rhizoma Anemarrhena asphodeloides Bunge 4 China

Phellodendri Cortex Phellodendron amurense RUPR 4 China

Stemonae Radix Stemona japonica Miquel. 16 China

Asteris Radix　 Aster tataricus Linne Fil.　 12 China

Total 13 Types 98

All individual herbs were purchased from Omni Herb (Korea)

Table 2. Experimental design used in this study

Group Sex No. of animals Dose(mg/kg)of Yukmijihwangtanggamibang

Vehicle control* Male 5 0

The highest dosage Male 5 2,000

The middle dosage Male 5 1,000

The lowest dosage Male 5 500

Vehicle control* Female 5 0

The highest dosage Female 5 2,000

The middle dosage Female 5 1,000

The lowest dosage Female 5 500

* Vehicle control; distilled water 20 ml/kg as vehicle in this study; All test articles in vehicle were once orally dosed in a volume of 20 ml/kg, dissolved in distilled water.

이다. 따라서 최근들어서는 한약 자체의 독성평가가 폭넓게 진행 되어 오고 있지만 독성평가는 제대로 이루어지지 않고 있다. 따 라서 양방의학에서 말하는 의약품의 독성평가에 준하여 한의학 의 처방을 적용․안전성 평가가 이루어져야 할 것으로 생각된다.

또한 최근에 들어 기능성 식품에 대한 독성검시 기준 역시 점점 강화되고 있는 실정이며, 곧 이들 역시 의약품 등과 동일한 독성 평가 수행될 것으로 생각된다

^8,11)

.

六味地黃湯加味方은『東醫寶鑑 夜嗽編

¹²⁾

에 수록된 처방으로 면역활성

¹³⁾

, 항산화

^14,15)

, 혈압강하

¹⁶⁾

및 신장보호효과

¹⁷⁾

등이 잘 알려져 있는 六味地黃湯에 知母, 黃柏, 陳皮, 貝母, 天門冬 등으로 구성된 처방이며, 六味地黃湯은 현재 기억 및 학습능력 증가

¹⁸⁾

, 항당뇨

¹⁹⁾

및 뇌 혈류개선 효과

²⁰⁾

가 알려져 있다. 또한 본 실험에 응용하는 처방은『東醫寶鑑 夜嗽編』

¹²⁾

에 百部根과 紫莞이 加味 된 처방으로 외래에서 COPD 환자에 장기간 투여로 호흡기질환 의 진행방지 및 증상의 개선을 보였으나, 안전성에 대한 객관적 근거를 확보하기 위해 일반 독성시험 중 현재 한국식품의약품안 전청 고시 제2005-60호 의약품 등의 독성시험기준

²¹⁾

에 명시되어 있는 마우스 경구 단회투여독성시험을 실시하고자 하였다.

재료 및 방법

1. 六味地黃湯加味方 추출물

본 실험에 사용된 약재는 약업사 (Omini Herb, 영천, Korea) 에서 매입한 것을 현미경하에서 관능검사를 통하여 선정하여 사 용 하였으며, 본 실험에 사용된 六味地黃湯加味方의 조성은 Table 1과 같다. 선정된 약제 1 첩 분량 (총량 98 g)을 취하여 정

제수 1,000 ㎖로 가열 추출한 후 (60℃, 3시간, 3 번), 흡인 여과한 여과액을 rotary vacuum evaporator (Rotavapor R144 Büchi Labortechnik AG, Switzerland)로 감압·농축하여, 점조성의 추출 물을 얻은 다음 programmable freeze dryer (Freezone 1;

Labconco Corp., MO, USA)를 사용하여, 동결 건조시켜 총16.00 g (수율 16.33%)의 연갈색의 물 추출물을 얻어 실험에 사용하였 다. 준비한 六味地黃湯加味方 물 추출물은 -20℃로 냉동 보관 후 실험에 사용하였으며, 본 실험에서 사용한 용매인 증류수에 100

㎎/㎖의 농도까지 비교적 잘 용해되었다.

2. 실험동물 및 사양관리

암수 각 20마리의 ICR 마우스 (6-wk old upon receipt, SLC, Japan)를 7일간의 순화과정을 거쳐 실험에 사용하였으며, 순화과 정 및 실험 전 기간 동안 온도 (20-25℃)와 습도 (30-35%)가 조절 된 사육실에서 마우스용 polycarbonate 사육상자에 5마리씩 수 용하여 사육하였고, 명암 주기 (light : dark cycle)는 12시간 주기 로 조절하였으며, 사료 (Samyang, Korea)와 음수는 자유롭게 공 급하였다. 모든 실험동물은 투여일 및 최종 부검일 18시간 전 절 식을 실시하였으며 (이 기간에도 음수는 자유롭게 공급하였다), picric acid로 개체를 식별하였다.

3. 실험군 분리 및 약물의 투여

실험동물은 군당 5마리씩 Table 2에 기록한 8그룹으로 구분

하였다. 六味地黃湯加味方은 六味地黃湯에 知母, 黃柏, 陳皮, 貝

母, 天門冬, 百部根과 紫莞이 加味된 처방으로, 현재까지 독성에

대한 보고를 찾아볼 수 없어, 한국식품의약품 안전청 고시 제

Table 3. Mortalities observed in female and male mice after single oral treatment of Yukmijihwangtanggamibang extracts

Groups Day after treatment Total*

0

^a

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Vehicle control

Male 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0/5 (0%)

Female 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0/5 (0%)

Yukmijihwangtanggamibang treated male groups

2,000 mg/kg 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0/5 (0%)

1,000 mg/kg 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0/5 (0%)

500 mg/kg 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0/5 (0%)

Yukmijihwangtanggamibang treated female groups

2,000 mg/kg 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0/5 (0%)

1,000 mg/kg 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0/5 (0%)

500 mg/kg 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0/5 (0%)

Values are expressed as number of died animals; a treatment day; * total mortalities during 14 days of observation periods – died animals/total observed animals (percentages; 5 mice per group)

200-60호

²¹⁾

에 의거하여, 설치류 최고 한계투여용량인 2,000 ㎎/

㎏을 최고 용량으로 설정하였으며, 공비 2로 1,000 및 500 ㎎/㎏

을 중간 및 저용량 투여군으로 설정하였다. 또한 암수 각각에 대 한 매체 대조군을 추가 하였다. 모든 투여군에서는 六味地黃湯加 味方 추출물을 멸균 증류수에 용해시켜 20 ㎖/㎏의 용량으로 존 데 (zonde)가 부착된 1 ㎖ 주사기를 이용하여, 강제 경구투여하 였다. 식이와 음수에 따른 약물의 흡수 변화를 최소화 하기 위해, 투여 후 대략 3시간 동안 사료와 음수 공급을 제한하였다.

4. 임상증상 및 체중의 관찰

모든 실험동물의 임상증상을 투여 전후에 각각 functional observational battery test

^22,23)

를 기초하여 동물의 행동, 자극에 대한 반응성, 각성도 및 경계성, 자세 및 보행 이상 등에 관한 일 반증상을 관찰, 기록하였으며, 투여일 이후에도 하루에 최소한 2 번씩 모든 실험동물의 임상증상을 관찰, 기록하였다. 또한 모든 실험동물의 체중을 투여전 1일, 투여직전, 투여 후1, 2, 7, 13 및 14일 (최종 희생일)에 각각 측정하였으며, 실험 시작시 개체차이 에 따른 체중의 변화를 최소화 하기 위하여, 투여일 ~ 투여 후 7 일, 투여 후 7일 ~ 13일 및 투여일 ~ 투여 후 14일간의 체중 증가 량인 증체량을 각각의 체중을 이용하여 산출하였다.

5. 부검

투여 14일 후 모든 실험동물은 이산화탄소 마취 하에 부검 을 실시하고, 주요 장기를 위주로 이상 육안소견을 각각 관찰, 기 록하였다.

6. 장기중량 측정

모든 실험동물은 육안부검 소견을 관찰 기록한 후 하기의 장기에 대한 절대 중량을 각각 측정하였으며, 체중의 변화에 수 반된 이차적 변화를 최소화 하기 위해 체중에 대한 각각의 장기 절대중량의 비율인 상대 중량을 산출하였다.

폐 (Lung), 심장 (Heart), 좌측 신장 (Kidney-left), 비장 (Spleen), 좌측 고환 (Testis-left), 간 (Liver), 췌장 비장엽 (Pancreas-splenic lobes), 좌측 부고환 (Epididymis-left), 좌측 슬 와임파절 (Popliteal lymph node-left), 좌측 난소 (Ovary-left), 뇌 (Brain) 및 자궁 (Uterus).

7. 조직병리

상기의 조직을 10% 중성포르말린에 18시간 이상 고정시킨 다음, 탈수를 거쳐 파라핀 포매 후 4 μm의 절편을 제작하였다.

이후 Hematoxylin & eosin (H&E) 염색을 실시하고, 광학현미경 하에서 이상 유무를 관찰, 기록하였다.

8. 통계처리

모든 수치는 평균 ± 표준편차로 표시하였으며, 다중비교검 증을 이용하여 통계처리를 실시하였고, 분산동질성을 Levene test를 실시하여 검증하였다. 등분산일 경우, one way ANOVA test를 실시한 다음 Scheffe test로 사후 검증을 실시하여 군간의 유의성을 측정하였다. 비등분산일 경우에는 비모수 검증인 Kruskal-Wallis H test를 실시하여 유의성이 인정된 경우에는, Mann-Whitney U (MW) test를 실시하여 군간의 유의성을 검증 하였다. 반수치사량 및 95% 신뢰한계 (confidence limits)를 Probit 방법으로 측정하였으며, 임상 증상, 육안부검 및 조직병리 학적 소견은 각각 그 정도에 따라 0 (normal), 1+ (slight), 2+

(moderate) 및3+ (severe)로 구분하였다. 통계처리 및 Probit 방 법은 SPSS for Windows (Release 14.0K, SPSS Inc., USA)를 이용 하여 평가하였으며, p-value가 0.05 이하인 경우 통계적 유의성 을 인정하였다.

결 과

1. 사망례

六味地黃湯加味方 추출물 투여와 관련 있는 사망례는 실험 전 기간동안 관찰되지 않아, 모든 실험동물 (5/5; 100%)을 최종 부검을 실시하였다(Table 3).

2. 임상증상

경미한(1+) 연변 소견(Fig. 1)이 六味地黃湯加味方 추출물 2,000 ㎎/㎏ 수컷 투여군에 국한되어, 투여 1일 후 2례 (2/5;

40%) 인정된 이외에 六味地黃湯加味方 추출물 투여와 관련된 임 상증상은 실험 전 기간동안 인정되지 않았다.

3. 체중의 변화

각각의 동일 성별의 매체 대조군에 비해, 六味地黃湯加味方 추출물 투여와 관련 있는 체중 및 증체량의 변화는 인정되지 않 았다(Fig. 2-3, Table 4).

2,000 ㎎/㎏ Male-03 Soft feces 1+ at Day 1

Fig. 1. Diarrhea detected as clinical signs.

Note that 2 male mice (2/5 40%) in 2,000mg/kg treated groups showed slight (1+) soft feces at 1 day after treatment as one of clinical signs related to Yukmijihwangtanggamibang extract treatment.

Fig. 2. Changes on the body weights during 14 Days of observation in male mice after single oral treatment of Yukmijihwangtanggamibang extracts.

No significant changes on body weights were detected in all Yukmijihwangtanggamibang extract treated male groups as compared with male vehicle control, respectively. ‡, all mice were overnight fasted; before means 1 day before injection day; 0 means just before injection; Values are expressed as mean ± S. D. of five mice

Fig. 3. Changes on the body weights during 14 Days of observation in female mice after single oral treatment of Yukmijihwangtanggamibang extracts.

No significant changes on body weights were detected in all Yukmijihwangtanggamibang extract treated female groups as compared with male vehicle control, respectively. ‡, all mice were overnight fasted; before means 1 day before injection day; 0 means just before injection; Values are expressed as mean ± S. D. of five mice.

4. 장기 중량의 변화

암컷 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.05) 췌장 절대 중량의 증가가 암컷 1,000 ㎎/㎏ 투여군에 국한되어 인정된 이외 에, 六味地黃湯加味方 추출물 투여와 관련된 의미 있는 장기중량

의 변화는 인정되지 않았다(Table 5, 6).

5. 부검소견

六味地黃湯加味方 추출물 1,000 ㎎/㎏ 투여군에 1례 (1/5;

20%) 국한된 가슴샘 충출혈 (congestion) 소견과, 폐 충출혈, 가 슴샘 위축 (atrophy), 비장 위축 또는 종대 (hypertrophy), 자궁부 종 소견이 암수 매체 대조군을 포함한 모든 실험군에 걸쳐 산발 적으로 관찰된 이외에 의미 있는 육안 부검소견은 인정되지 않 았다(Table 7, 8).

6. 조직병리학적 관찰

六味地黃湯加味方 추출물 1,000 ㎎/㎏ 투여군에 각각 1례 (1/5; 20%) 국한되어 경미한 가슴샘 충혈(Fig. 4)과 간 세포의 급 성 세포 종창 (acute cellular swelling; Fig. 5)이 인정되었고, 500

㎎/㎏ 투여군에 국한되어 슬와 임파절 낭포 형성 (Fig. 6) 소견이 1례 (1/5; 20%) 인정되었으며, 다양한 정도 (1 ~ 3+)의 폐 충출혈 (Fig. 7), 가슴샘 피질 임파구 감소(Fig. 4), 비장 임파구 감소 또는 증생 (Fig. 8), 간의 국소 지방변화 및 염증세포 침윤 (Fig. 5), 슬 와 임파절 임파구 증생 (Fig. 6) 및 자궁 점막 탈락 (Fig. 9) 소견 이 암수 매체 대조군을 포함한 모든 실험군에 걸쳐 산발적으로 관찰되었다(Table 9, 10).

Fig. 4. Histopathological changes detected on the thymus.

Note that slight (1+) to moderate (2+) decreases of lymphoid cells in thymic cortex(DE as seen vacuolation or loosening of lymphoid cells) were sporadically detected throughout most of all experimental groups tested regardless of genders including vehicle controls as sporadic finings not Yukmijihwangtanggamibang treatment related toxicological signs. In addition, one male in 1,000 mg/kg treated groups showed slight congestion of medullar regions as sporadic accidental finding. All Hematoxylin & Eosin stain; Scale bars = 160 µm.

Fig. 5. Histopathological changes detected on the liver.

Note that slight (1+) focal inflammatory cell infiltrations (IF) with/without fatty change (FA; as seen vacuolation) were sporadically detected throughout most of all experimentalgroups tested regardless of genders including vehicle controls as sporadic finings not Yukmijihwangtanggamibang extracts treatment related toxicological signs. In addition, one male in 1,000 mg/kg treated groups showed slight hepatocyte acute cellular swelling (AC; as seen hypertrophy)as sporadic accidental finding. C, central vein. All Hematoxylin & Eosin stain; Scale bars = 160 µm.

Fig. 6. Histopathological changes detected on the popliteal lymph nodes.

Note that slight (1+)hyperplasia of lymphoid cells (HP; secondary follicles) were randomly detected in the popliteal lymph nodes of female and male vehicle withYukmijihwangtanggamibang extract 2,000 mg/kg treated male groups as accidental findings not toxicological signs. In addition, one male in 500 mg/kgtreated groups showed cyst formation as sporadic accidental finding. All Hematoxylin & Eosin stain; Scale bars = 160 µm.

Fig. 7. Histopathological changes detected on the lung.

Note that slight (1+) lung focal congestional spots – thickening of alveolar lung inflammatory cell infiltration with/without focal hemorrhages were randomly detected throughout the experimental groups tested regardless of genders including vehicle controls as sporadic finings not Yukmijihwangtanggamibang treatment related toxicological signs; A, alveolar sac-respiratory bronchiole; B, bronchiole. All Hematoxylin & Eosin stain; Scale bars = 160 µm.

Fig. 8. Histopathological changes detected on the spleen.

Note that slight (1+) decreases of lymphoid cells (DE as seen loosening of red pulp cells)or hyperplasia of red pulp cells were sporadically detected throughout most of all experimental groups tested regardless of genders including vehicle controls as sporadic accidental finings not Yukmijihwangtanggamibang treatment related toxicological signs. W, white pulp; R, red pulp. All Hematoxylin & Eosin stain; Scale bars = 160 µm.

Table 5. Changes on the absolute organ weights observed in female and male mice after single oral treatment of Yukmijihwangtanggamibang extracts

Groups Absolute weights of 12 principal organs (g)

Lung Heart Thy

mus KidneyL Adrenal

gland L Spleen T/O L Liver Pan S Brain Epi L

/Uterus LN L Vehicle control

Male 0.211±

0.013 0.171±

0.021 0.058±

0.010 0.292±

0.039 0.004±

0.001 0.113±

0.032 0.124±

0.020 1.580±

0.236 0.199±

0.035 0.478±

0.016 0.053±

0.005 0.005±0.004 Female 0.193±

0.013 0.147±

0.008 0.065±

0.010 0.195±

0.016 0.006±

0.003 0.135±

0.033 0.028±

0.008 1.314±

0.134 0.170±

0.014 0.469±

0.015 0.150±

0.041 0.007±

0.004 Yukmijihwangtanggamibang treated male groups (mg/kg)

2,000 0.196±

0.030 0.164±

0.021 0.067±

0.006 0.284±

0.050 0.005±

0.004 0.149±

0.047 0.126±

0.022 1.668±

0.207 0.184±

0.015 0.472±

0.025 0.053±

0.008 0.009±

0.010 1,000 0.207±

0.014 0.184±

0.018 0.057±

0.007 0.299±

0.044 0.006±

0.003 0.116±

0.012 0.124±

0.010 1.699±

0.214 0.188±

0.015 0.479±

0.027 0.048±

0.002 0.004±

0.002 Yukmijihwangtanggamibang treated female groups (mg/kg)

2,000 0.188±

0.002 0.149±

0.007 0.072±

0.011 0.200±

0.014 0.004±

0.001 0.140±

0.042 0.021±

0.003 1.332±

0.133 0.169±

0.005 0.473±

0.008 0.147±

0.044 0.008±

0.004 1,000 0.183±

0.018 0.147±

0.014 0.063±

0.021 0.198±

0.012 0.004±

0.003 0.102±

0.018 0.028±

0.007 1.331±

0.119 0.149±

0.005* 0.476±

0.013 0.176±

0.049 0.004±

0.003

Values are expressed as mean ± S. D. of fivemice; L, left sides; T/O, testis/ovary; Pan, pancreas; S, splenic lobes; Epi, epididymis; LN, popliteal lymph node * p<0.05 as compared with female vehicle control by MW test

Table 4. Body weight gains in female and male mice after single oral treatment of Yukmijihwangtanggamibang extracts

Groups Interval

Day 0a ~ Day 7 Day 7 ~ Day 13 Day 0 ~ Day 14

Vehicle control

Male 8.44±1.89 2.52±1.13 5.10±2.07

Female 6.38±0.94 2.68±2.00 4.40±1.28

Yukmijihwangtanggamibang treated male groups

2,000 mg/kg 8.50±1.50 1.70±0.88 4.82±1.73

1,000 mg/kg 9.36±1.71 2.36±0.88 6.20±1.75

500 mg/kg 8.22±0.91 2.76±0.23 4.64±1.06

Yukmijihwangtanggamibang treated female groups

2,000 mg/kg 7.04±0.78 2.70±0.79 4.88±0.47

1,000 mg/kg 7.46±1.07 1.64±1.60 3.62±1.68

500 mg/kg 7.82±1.44 2.36±1.27 4.26±1.41

Values are expressed as mean ±S. D. g of five mice; a Day of treatment after overnight fasted

Fig. 9. Histopathological changes detected on the uterus.

Note that slight (1+), moderate (2+) or severe (3+) desquamation of uterus mucosa (DM) were sporadically detected throughout the all experimental female groups tested including vehicle control as estrus cycle not Yukmijihwangtanggamibang treatment related toxicological signs. L, lumen. All Hematoxylin & Eosin stain; Scale bars = 160 µm.

고 찰

본 연구에서는 六味地黃湯加味方은 六味地黃湯에 知母, 黃柏, 陳皮, 貝母, 天門冬, 百部根과 紫莞이 加味된 처방으로 六味地黃 湯加味方의 일반적인 독성시험 중 현재 한국식품의약품안전청 고시 의약품 등의 독성시험기준

²¹⁾

에 명시되어 있는 마우스 경구 단회투여독성시험을 실시하여, 장기투여 독성 시험과 생식․발 생독성 시험을 위시한 특수 독성시험에 대한 기초자료를 제공하 고, 안전성을 확보하고자 하였다. 한국식품의약품안전청 고시

²¹⁾

에 따라 六味地黃湯加味方 추출물 2,000, 1,000 및 500 ㎎/㎏을 단회 경구 투여한 다음 14일간 체중 및 임상증상을 관찰하였으 며, 14일 후 최종 부검을 통하여 12개의 주요 장기에 대한 장기 중량, 육안 부검 및 조직병리학적 관찰을 실시한 결과, 단회투여 독성 시험에서 설치류 최대 한계투여 용량인 2,000 ㎎/㎏까지 六 味地黃湯加味方 추출물 투여와 관련된 사망례가 인정되지 않았 으며, 六味地黃湯加味方 추출물 투여와 관련된 장기중량 및 육안 부검소견 역시 인정되지 않았고, 수컷 2,000 ㎎/㎏ 투여군의 2례 에 국한된 일시적인 연변 소견을 제외하고, 六味地黃湯加味方 추 출물 투여와 관련된 임상증상 역시 인정되지 않았다.

본 실험에서 모든 실험동물의 체중 및 장기중량은 동일한 주령의 마우스들의 정상 범주

^24,25)

에 포함되어 관찰되었으며, 수 컷 2,000 ㎎/㎏ 투여군의 2례 국한되어 투여 1일 후에 인정된 일 시적인 연변 소견은 그 출현빈도가 너무 낮아 큰 의미는 없을 것 으로 판단되나, 2,000 ㎎/㎏ 이상의 六味地黃湯加味方의 투여에 의해 설사 등 소화기 증상이 초래될 가능성은 배제할 수 없다.

한국식품의약품 안전청 고시 제 2005-60호

²¹⁾

에 따르면, 설치

류에서 투여한계 농도를 2,000 ㎎/㎏ 또는 최대 용해농도로 규정

하고 있으며, 투여 용량은 용액의 경우 20 ㎖/㎏, 현탁액인 경우

10 ㎖/㎏을 넘지 못하게 규정하고 있다. 본 실험에서 사용한 六

Table 6. Changes on the relative organ weights observed in female and male mice after single oral treatment of Yukmijihwangtanggamibang extracts

Groups

Relative weights of 12 principal organs (% vs body weights at sacrifice)

Lung Heart Thymus Kidney

L Adrenal

gland L Spleen T/O L Liver Pan S Brain Epi L

/Uterus LN L Vehicle control

Male 0.584±

0.037 0.470±

0.020 0.164±

0.044 0.802±

0.036 0.010±

0.004 0.309±

0.057 0.342±

0.047 4.340±

0.196 0.547±

0.054 1.329±

0.131 0.149±

0.027 0.014±

0.011 Female 0.645±

0.037 0.493±

0.041 0.217±

0.027 0.651±

0.063 0.020±

0.010 0.447±

0.094 0.095±

0.026 4.374±

0.182 0.567±

0.038 1.568±

0.090 0.499±

0.123 0.025±

0.014 Yukmijihwangtanggamibang treated male groups (mg/kg)

2,000 0.547±

0.069 0.459±

0.047 0.189±

0.026 0.792±

0.103 0.013±

0.012 0.423±

0.158 0.351±

0.043 4.658±

0.464 0.516±

0.065 1.331±

0.184 0.151±

0.036 0.025±

0.028 1,000 0.556±

0.015 0.494±

0.026 0.154±

0.020 0.804±

0.087 0.017±

0.008 0.312±

0.020 0.335±

0.022 4.563±

0.347 0.508±

0.051 1.292±

0.087 0.130±

0.009 0.010±

0.006

500 0.557±

0.056 0.489±

0.039 0.156±

0.043 0.795±

0.028 0.014±

0.009 0.290±

0.032 0.399±

0.078 4.832±

0.190 0.508±

0.041 1.293±

0.042 0.129±

0.032 0.009±

0.006 Yukmijihwangtanggamibang treated female groups (mg/kg)

2,000 0.621±

0.013 0.493±

0.029 0.239±

0.041 0.660±

0.044 0.013±

0.003 0.463±

0.136 0.070±

0.011 4.399±

0.390 0.560±

0.018 1.565±

0.041 0.468±

0.142 0.025±

0.014 1,000 0.633±

0.053 0.508±

0.040 0.213±

0.060 0.683±

0.058 0.013±

0.009 0.350±

0.038 0.097±

0.020 4.584±

0.218 0.514±

0.041 1.650±

0.190 0.607±

0.170 0.015±

0.011

500 0.626±

0.049 0.543±

0.074 0.155±

0.017 0.728±

0.026 0.010±

0.009 0.439±

0.071 0.077±

0.013 4.793±

0.185 0.565±

0.068 1.619±

0.153 0.632±

0.195 0.023±

0.011

Values are expressed as mean ± S. D. of five mice; L, left sides; T/O, testis/ovary; Pan, pancreas; S, splenic lobes; Epi, epididymis; LN, popliteal lymph node

Table 7. Necropsy findings observed in male mice after single oral treatment of Yukmijihwangtanggamibang extracts [Group summary]

Necropsy Findings at Sacrifice (Day 14)

Groups Vehicle

control Yukmijihwangtanggamibang extracts mg/kg)

2,000 1,000 500

Normal Lung

Congestion 3/5

2/5 4/5

1/5 4/5

1/5 4/5

1/5 Heart

Normal 5/5 5/5 5/5 5/5

Thymus Normal Atrophy Congestion

4/5 1/5 0/5

5/5 0/5 0/5

3/5 1/5 1/5

4/5 1/5 0/5 Kidney

Normal 5/5 5/5 5/5 5/5

Adrenal gland

Normal 5/5 5/5 5/5 5/5

Spleen Normal

Atrophy 3/5

2/5 4/5

1/5 5/5

0/5 4/5

1/5 Testis

Normal 5/5 5/5 5/5 5/5

Liver

Normal 5/5 5/5 5/5 5/5

Pancreas

Normal 5/5 5/5 5/5 5/5

Brain

Normal 5/5 5/5 5/5 5/5

Epididymis

Normal 5/5 5/5 5/5 5/5

Lymph nodea Normal

Hypertrophy 4/5

1/5 4/5

1/5 5/5

0/5 5/5

0/5 Others

Normal 5/5 5/5 5/5 5/5

Values are expressed as observed animals/total observed animals a Bilateral popliteal lymph nod

Table 8. Necropsy findings observed in female mice after single oral treatment of Yukmijihwangtanggamibang extracts [Group summary]

Necropsy Findings at Sacrifice (Day 14) Groups Vehicle

control Yukmijihwangtanggamibang extracts (mg/kg)

2,000 1,000 500

Normal Lung

Congestion 5/5

0/5 5/5

0/5 4/5

1/5 4/5

1/5 Heart

Normal 5/5 5/5 5/5 5/5

Thymus Normal

Atrophy 3/5

2/5 4/5

1/5 5/5

0/5 4/5

1/5 Kidney

Normal 5/5 5/5 5/5 5/5

Adrenal gland

Normal 5/5 5/5 5/5 5/5

Spleen Normal Hypertrophy

Atrophy

4/5 1/5 0/5

4/5 1/5 0/5

4/5 0/5 1/5

4/5 1/5 0/5 Ovary

Normal 5/5 5/5 5/5 5/5

Liver

Normal 5/5 5/5 5/5 5/5

Pancreas

Normal 5/5 5/5 5/5 5/5

Brain

Normal 5/5 5/5 5/5 5/5

Uterus Normal Edematous

change

3/5 2/5 4/5

1/5 2/5

3/5 2/5

3/5 Lymph nodea

Normal

Hypertrophy 4/5

1/5 5/5

0/5 5/5

0/5 5/5

0/5 Others

Normal 5/5 5/5 5/5 5/5

Values are expressed as observed animals/total observed animals a Bilateral popliteal lymph node.

味地黃湯加味方 추출물은 멸균 증류수에 100 ㎎/㎖까지 비교적 잘 용해되어, 멸균 증류수에 100 ㎎/㎖의 농도까지 용해시켜 20

㎖/㎏의 용량 즉, 2,000 ㎎/㎏을 최고 농도로 투여하였다. 육안 부검시 인정된 폐 충출혈, 가슴샘 위축, 비장 위축 또는

Table 9. Histopathological findings observed in male mice after single oral treatment of Yukmijihwangtanggamibang extracts [Group summary]

Sampled at Sacrifice (Day 14) Groups Vehicle

control

Yukmijihwangtanggamibang extracts (mg/kg)

2,000 1,000 500

Normal Lung

Congestional spot 3/5

2/5 4/5

1/5 4/5

1/5 4/5

1/5 Heart

Normal 5/5 5/5 5/5 5/5

Thymus Normal Congestion DE*

4/5 1/5 0/5

5/5 0/5 0/5

3/5 1/5 1/5

5/5 0/5 0/5 Kidney

Normal 5/5 5/5 5/5 5/5

Adrenal gland left

Normal 5/5 5/5 5/5 5/5

Spleen Normal

DE* 4/5

1/5 5/5

0/5 5/5

0/5 5/5

0/5 Testis left

Normal 5/5 5/5 5/5 5/5

Liver Normal Focal fatty changes

Focal IF Focal AC*

4/5 1/5 1/5 0/5

5/5 0/5 0/5 0/5

3/5 1/5 0/5 1/5

4/5 1/5 1/5 0/5

Pancreas splenic

Normal 5/5 5/5 5/5 5/5

Brain

Normal 5/5 5/5 5/5 5/5

Epididymis left

Normal 5/5 5/5 5/5 5/5

Lymph nodea Normal

Cyst HP*

4/5 1/5 0/5

4/5 1/5 0/5

5/5 0/5 0/5

4/5 0/5 1/5

Values are expressed as observed animals/total observed animals a Bilateral popliteal lymph node *Abbreviations of signs – DE, decreases of lymphoid cells IF, inflammatory cell infiltrations HP, hyperplasia of lymphoid cells AC, acute cellular swelling.

Table 10. Histopathological findings observed in female mice after single oral treatment of Yukmijihwangtanggamibang extracts [Group summary]

Sampled at Sacrifice (Day 14)

Groups Vehicle

control

Yukmijihwangtanggamibang extracts (mg/kg)

2,000 1,000 500

Normal Lung

Congestional spot 5/5

0/5 5/5

0/5 4/5

1/5 4/5

1/5 Heart

Normal 5/5 5/5 5/5 5/5

Thymus Normal

DE* 3/5

2/5 4/5

1/5 4/5

1/5 3/5

2/5 Kidney

Normal 5/5 5/5 5/5 5/5

Adrenal gland left

Normal 5/5 5/5 5/5 5/5

Spleen Normal

DE* HP*

3/5 1/5 1/5

4/5 0/5 1/5

5/5 0/5 0/5

4/5 0/5 1/5 Ovary left

Normal 5/5 5/5 5/5 5/5

Liver Normal

Focal IF 3/5

2/5 4/5

1/5 5/5

0/5 2/5

3/5 Pancreas splenic

Normal 5/5 5/5 5/5 5/5

Brain

Normal 5/5 5/5 5/5 5/5

Uterus Normal

DM* 3/5

2/5 3/5

2/5 4/5

1/5 3/5

2/5 Lymph nodea

Normal

HP* 4/5

1/5 5/5

0/5 5/5

0/5 5/5

0/5

Values are expressed as observed animals/total observed animals a Bilateral popliteal lymph node *Abbreviations of signs – DE, decreases of lymphoid cells IF, inflammatory cell infiltrations HP, hyperplasia of lymphoid cells; DM, desquamation of mucosa

종대, 자궁부종 소견과 조직병리학적 검사에서 관찰된 폐 충출혈, 가슴샘 피질 임파구 감소, 비장 임파구 감소 또는 증생, 간의 국 소 지방변화 및 염증세포 침윤, 슬와 임파절 임파구 증생 및 자궁 점막 탈락 소견들은 암수 매체 대조군을 포함한 모든 실험군에 걸쳐 산발적으로 관찰되었으며, 용량 의존성이 전혀 인정되지 않 아 六味地黃湯加味方 추출물 투여와 관련 없는 우발적 병소로 판 단되고, 수컷 1,000 ㎎/㎏ 투여군에서 1례에 국한되어 육안부검 및 조직병리학적 관찰 시 인정된 가슴샘 충혈 및 간 세포의 급성 세포 종창 소견과 500 ㎎/㎏ 수컷 투여군에서 1례 인정된 슬와 임파절 낭포 형성 소견 역시 출현빈도가 낮고, 용량 의존성이 전 혀 인정되지 않아, 六味地黃湯加味方 추출물 투여와 관련된 독성 증상으로 간주하기는 어렵다. 한편 이들 병소들은 정상 마우스에 서 드물게 인정되는 소견으로 알려져 있고

^26,27)

, 자궁은 estrus cycle에 따라 쉽게 변화할 수 있어

^28,29)

, 자궁 부종 및 자궁점막 탈 락 소견은 estrus cycle에 따른 이차적 변화로 판단된다.

US Environmental Protection Agency OPPTS 870.100

³⁰⁾

에 따르면 일반적으로 반수 치사량이 5,000 ~ 15,000 ㎎/㎏인 물질 을 무독성 물질로, 5,00 ~ 5,000 ㎎/㎏을 비교적 저독성 (Class

III) 물질로 규정하고 있으나, 한국식품의약품 안전청 고시 제 2005-60호 [2005], 설치류에서 투여한계 농도를 2,000 ㎎/㎏으로 제한하고 있다. 따라서 본 실험의 마우스 단회 경구투여 독성실 험에서 六味地黃湯加味方 추출물의 반수치사량 및 개략적 치사 량은 각각 2,000 ㎎/㎏ 이상으로 관찰되었다.

결 론

본 연구에서는 한국식품의약품안전청 고시

²¹⁾

에 따라 한의 학에서 오랫동안 사용되어온 대표적인 처방인 六味地黃湯에 知 母, 黃柏, 陳皮, 貝母, 天門冬, 百部根과 紫莞이 加味된 六味地黃 湯加味方의 마우스 경구 단회투여독성 시험을 실시한 결과, 단 회투여 독성 시험에서 설치류 최대 한계투여 용량인 2,000 ㎎/

㎏까지 六味地黃湯加味方 추출물 투여와 관련된 사망례가 인정

되지 않았으며, 六味地黃湯加味方 추출물 투여와 관련된, 체중,

장기중량, 육안 및 조직병리학적 변화는 인정되지 않았고, 수컷

2,000 ㎎/㎏ 투여군의 2례에 국한된 일시적인 연변 소견을 제외

하고, 六味地黃湯加味方 추출물 투여와 관련된 임상증상 역시

인정되지 않았다. 따라서 六味地黃湯加味方 추출물의 마우스에

있어서 반수치사량 및 개략적 치사량은 각각 2,000 ㎎/㎏ 이상

으로 관찰되었다.

감사의 글

이 논문은 2009년도 대구한의대학교 기린연구비지원에 의한 연구결과입니다.

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