[특별기획(Ⅳ)] 단백질체 분해를 위한 안정화된 트립신 고정화 시스템

서론

질량분광분석기를 이용한 단백질체(mass spectrometry based proteomics) 연구를 위해서는 단백질 분해 효

소(protease)의 한 종류인 트립신(trypsin, [그림 1]) 을 이용하여 단백질 혼합물들을 분석 가능한 펩타이 드로 잘게 나누는 과정이 필요하다. 트립신은 단백질 성을 거의 잃지 않는 것으로 확인되었다. 이는 탄소나

노튜브의 외벽에 고정화된 효소의 양이 급격히 증가 하여 나타난 현상으로 해석되며, 전자 전달효율에 있 어서는 상대적으로 저하되는 부분이 있을 수 있지만, 전자의 생성과 전달의 총합으로 나타나는 바이오 연 료전지의 특성으로 볼 때 전체적인 성능증가가 나타 난 것으로 보인다. 또한, 튜브 외벽에 효소층이 두텁게 형성됨으로써, 바깥층의 효소들이 내부 효소들에 대 해 외벽으로 작용하여, 외부로부터의 기계적 스트레 스를 완충하는 역할을 하게 된다. 또한 내부 효소들은 서로 밀집되어 있어 외부 환경에 의해 2차 결합이 끊 어지게 되어도 그 형태를 잃지 않는다는 장점이 있다 고 할 수 있다.

이와 연결되는 결과로서, 탄소나노튜브 박막상에 글루코스 산화효소를 고정화한 결과가 발표된 바 있 다. 일반적으로 효소가 안정하게 존재하는 수용액에 탄소나노튜브를 분산시키는 것은 쉽지 않은 문제이다.

이를 피하기 위하여 탄소나노튜브를 유기용매 상에서 분산시켜 이로부터 탄소나노튜브가 네트워크로 얽힌 박막으로 만들고, 이 박막상에 글루코스 산화효소를 고정화하였다[그림 3]. 단순 공유결합(CA)의 경우, 고정되는 효소의 양이 적고, 이를 증가시키기 위해 상 호결합을 도입하는 방법을 생각할 수 있다(EC). 그리 고 더 많은 양의 효소를 고정화하기 위해 효소를 박막

상으로 침전, 농축시킨 후 상호결합을 하였다(EPC).

EPC의 경우가 고정된 효소의 양이 확연하게 높다 는 것을 글루코스에 대한 센서 특성을 통하여 확인하 였으며, 그 결과 EPC가 EC와 CA에 대해 각각 10배, 100배가 증폭된 민감도를 보였다. 앞서 언급된 결과는 액상에서 고정화된 경우로, EPC가 CA에 비해 2~3 배 가량의 증폭 효과를 보인 것에 비해 매우 높은 증 가폭이라 할 수 있을 것이다. 안정성의 측면에서도 외 부의 기계적 스트레스 상에서 EPC가 20일까지 초기 민감도의 90%를 유지하는 것으로 나타났다. 이러한 경향은 전기화학적 응용방법이 유사한 바이오 연료전 지 전극에서도 역시 유사할 것으로 예상할 수 있다.

결론

지금까지 효소 기반의 바이오 연료전지에 관하여 알아보고, 실질적인 응용에 있어서의 문제점 및 그 해 결책을 예를 들어 알아보았다. 실제 바이오 연료전지 를 구현 및 이용하는 측면에서 볼 때, 기기의 단기특성 에 해당하는 전력 방출량과 같은 문제는 반드시 개선 해야 할 문제이다. 하지만 장기적인 이용에 있어 기기 의 안정성 및 가용기간을 보장하는 것이 실용적인 측 면에서 더욱 중요한 문제라 할 수 있다. 이를 위해서는 바이오 연료전지에 이용되는 효소를 안정적으로 유지, 이용하는 방법에 대한 연구가 필수적이라 하겠다.

단백질체 분해를 위한 안정화된 트립신 고정화 시스템

김 병 찬

한국과학기술연구원 환경연구본부, [email protected]

을 구성하는 아미노산인 아르기닌(arginine) 혹은 라 이신(lysine)의 C-말단(c-term)을 특이적으로 가수 분해하기 때문에, 단백질체 분석에 필요한 펩타이드 를 얻기 위한 필수 효소이다. 일반적으로 생체 시료에 서 구성 단백질들을 탐색하기 위해서는 단백질체 시 료를 트립신으로 처리하여 펩타이드로 분해하는 과정 을 거치고, 질량분석기를 통해 펩타이드의 질량과 시 퀀스 정보 등을 얻는다. 이후 단백질 시퀀스 데이터베 이스 등과 비교분석하여, 단백질체의 구성을 파악하 거나, 혹은 새로운 단백질 군을 찾는 과정이 뒤따른다.

정확한 펩타이드 분석을 위해서는 단백질체 시료의 효율적인 펩타이드화가 요구되며 따라서 안정화되고 높은 활성도를 갖는 트립신 사용이 요구된다. 본 고에 서는 단백질체 분해를 위한 트립신 적용 방법을 살펴 보고, 나노구조재료와 트립신 고정화를 이용한 트립 신 안정화 방법과 활용 예들을 소개하고자 한다.

단백질체 연구를 위한 트립신

트립신을 이용한 단백질 분해 방법은 분해가 진행 되는 매질의 환경에 따라 크게 액상 분해(in-solution digestion)와 고정상 분해(solid-phase digestion) 두 가지로 나뉜다. 고전적으로 액상 분해 방법이 많이 이 용되었는데, 액상 분해 방법은 준비된 단백질체 시료 용액에 적정량의 트립신을 첨가한 후 균질하게 교반 하며 단백질을 분해시킨다. 그러나 액상 분해 방법의 단점으로, 분석 가능한 펩타이드의 확보를 위해 다량 의 단백질체 시료가 필요하고, 충분한 펩타이드 분해

를 위해 대략 6~24 시간의 긴 반응시간이 필요하며, 긴 반응시간에도 불구하고 단백질 분해 효율이 좋지 못한 것으로 보고 되고 있다. 이를 보완하기 위해 다량 의 트립신을 첨가하기도 하는데 트립신이 자가분해 (autolysis) 되는 경향이 있어 트립신 자체의 펩타이드 조각들이 질량분석기의 강한 백그라운드 신호를 유도 하기 때문에 정확한 질량분석이 어렵다. 단백질체 시 료의 종류에 따라 종종 유기용매가 포함되는 경우도 있는데 잔류 유기용매가 트립신의 활성도를 크게 저 해하며, 단백질체 시료의 특성에 따라 온도를 높여 분 해할 경우, 고온에서 트립신 안정성이 떨어져 원하는 수준의 펩타이드 시료를 얻지 못하는 경우도 많다.

고정상 분해 방법은 고정상 물질에 트립신을 고정 화하여 단백질체를 분해하려는 것으로, 앞서 설명한 액상 분해 방법의 많은 단점을 극복할 수 있어 단백질 체 연구에 많이 적용되고 있다. 트립신을 고정상 매트 릭스에 고정화하는 것을 기본으로 하며, 트립신의 재

특·별·기·획(Ⅳ)

그림 1. 트립신의 3차원 폴리펩타이드 구조.

그림 2. 나노구조재료를 이용한 트립신 고정화 전략

[Proteomics 10 (2010) 687].

사용이 가능하고, 높은 기질-효소 반응비를 유도할 수 있으며, 액상 분해 보다 트립신의 안정성을 높일 수 있기 때문에 단시간 안에 질량분석을 위한 양질의 펩 타이드를 얻는데 적합하다. 또한 트립신의 자가분해 를 줄일 수 있다. 고정상이 담지된 반응기의 구성 방 법과 시료를 흘려주는 방식에 따라 단백질체 분해를 회분식(batch) 방식 혹은 연속 흐름(continuous flow) 방식으로 수행할 수 있다. 고정상 분해는 주로 트립신이 고정화된 매트릭스가 충진된 컬럼 상에서 이루어지는데 시료의 외부 오염으로부터 자유롭고, 대 용량의 단백질체 시료를 단시간에 분석 가능하여, 이 를 바탕으로 시료에서 단백질을 추출하는 과정, 단백 질을 펩타이드화 하는 과정, 질량분석기로 분석하는 전 과정을 온라인 자동화하려는 노력들이 진행되고 있다. 단백질체 시료의 준비와 펩타이드화된 이후의 질량분석 자동화 과정도 중요하지만 결국 펩타이드가 얼마나 효율적으로 분석 가능한 수준으로 얻어질 수 있는지가 핵심이며, 이를 위해 트립신이 장시간 높은 활성도를 유지하면서 얼마나 오랫동안 고정화될 수 있는지가 자동화 시스템을 구성하는데 가장 중요한 요인이라고 할 수 있겠다. 적절한 고정상의 선택과 고 정화 방법을 적용하여 안정화되고 활성도가 높은 트 립신을 확보해야 하며, 이를 위해 다양한 나노구조재 료를 이용한 트립신 고정화 방법이 연구되고 있다.

나노구조재료를 이용한 트립신 고정화

나노구조재료는 단위 부피, 질량당 효소가 고정화 될 수 있는 넓은 표면적을 제공해 주며, 다량의 효소 를 안정적으로 고정화하여 효소의 활성도를 극대화 할 수 있도록 한다. 고정화를 위해 선택되는 나노구조 재료의 특성에 따라 효소 단독으로는 가질 수 없는 다 양한 특성을 부여 할 수 있는 데 예를 들면 자성 입자 에 고정화된 효소는 자석 등을 이용하여 반응 후에 쉽 게 회수할 수 있고, 재사용이 가능하다. 나조구조재료 의 특성에 따라 흡착(adsorption), 공유결합(covalent attachment), 효소 코팅(enzyme coating) 방법으로

효소 고정화 전략을 선택할 수 있으며, 주로 이용되고 있는 고정화 물질은 다공성 실리카, 자성 나노 입자, 나노파이버 등을 들 수 있다[그림 2]. 이들 나노구조 재료를 트립신 고정화에 활용하는 연구들이 활발히 진행 중이다.

1) 다공성 실리카 재료

다공성 실리카(mesoporous silica)는 나노 사이즈의 공극 크기를 갖는 실리카로 합성 방법에 따라 단위 질 량당 높은 공극의 부피비와 넓은 표면적을 갖도록 제 어 할 수 있기 때문에 공극 내부에 다량의 트립신 고 정화가 가능하다. 다공성 실리카를 이용한 효소 고정 화 방법은 공극 내부에 효소가 흡착되도록하는 방법, 공극 내부에 작용기를 도입하여 공유결합시키는 방법, 그리고 공극 내부에 효소의 가교결합(cross-linking) 을 유도하여 덩어리진 효소가 공극 밖으로 빠져나가 지 못하도록 하는 방법을 선택할 수 있는데, 트립신의 경우 흡착 방법이 주로 보고가 되고 있다. 공극에 흡 착된 트립신은 공극 내부로 들어오는 단백질체 시료 와 반응하여 펩타이드를 만들고, 공극 밖으로 배출된 펩타이드를 회수한 후 질량분석기를 통해 분석하는 방법이 주로 제안되었다. 이와는 반대로 트립신을 고 정화하여 사용하는 것이 아니라 대상 단백질체 시료 를 먼저 공극 안으로 유도하여 분해 대상 시료를 농축 시키고, 이후 트립신이 공극으로 들어가 이미 공극 내 부에 자리잡고 있는 단백질을 분해하는 방법도 제안 되고 있다. 다공성 실리카 재료는 결국 수 많은 나노 사이즈 크기의 작은 리액터를 갖고 있는 것이고 작은 공간 안에서 트립신과 분해하려는 단백질체 시료와의 반응이 밀도있게 이뤄져 단시간(수분에서 1~2 시간) 에 효율적인 단백질체 분해를 진행할 수 있다. 단순 흡착에 의한 고정화는 여전히 시료 내에 다량의 트립 신과 혹은 자가분해된 트립신이 여전히 존재 할 수 있 기 때문에 분석 측면에서 어려움이 있을 수 있고, 따 라서 공극 내부에 영구적으로 트립신이 고정화되는 방법을 고려할 수 있을 것이다.

2) 나노자성입자

나노자성입자(magnetic nanoparticles)는 자성을 갖는 나노 크기의 작은 입자를 의미한다. 외부 자기장 에 의해 분리가 용이하여 효소 고정화를 위한 매트릭 스로 많은 관심을 받고 있다. 나노자성입자를 트립신 고정화 매트릭스로 선택할 경우 주로 나노자성입자의 표면에 작용기를 부여하고 공유결합을 통해 고정화하 는 전략을 택한다. 트립신이 고정화된 나노자성입자 는 on-chip 혹은 on-plate 단백질 분해에 주로 적용되 고 있다. 칩의 미세 유체 채널 내부에 충진된 트립신- 나노자성입자를 통해 단백질체 시료가 분해되고, 사 용된 나노자성입자는 자석으로 분리하여 재사용이 가 능하다. 이 역시 미세화된 채널에서 단백질체 시료와 트립신 효소 사이의 접촉 밀도가 증대되어 효율적인 펩타이드 분해가 가능하다. 나노자성입자를 트립신 고정화에 사용하는 가장 큰 장점은 반응 후 시료에서 분리 가능하다는 것이며, 따라서 최종 질량분석을 위 한 시료에는 트립신이 거의 존재하지 않는다. 칩에서 구현된 단백질 분해 시스템의 경우 10초에서 5분 이 내에 목적 단백질의 펩타이드들을 얻을 수 있었다는 보고가 있다. 이런 점에서 나노자성입자는 대용량 단 백질체 분석보다는 칩 플랫폼과 결합하여 미량의 단 백질체 시료를 얻을 수 밖에 없는 경우, 혹은 초고속 스크리닝 개념의 단백질체 분석 시스템에 적용되는 것이 적합할 것이다.

3) 나노파이버

나노파이버(nanofibers)는 전기방사법(electro- spinning)으로 제조되는 나노사이즈의 두께를 갖는 폴리머 파이버를 의미한다. 선택되는 폴리머의 종류 에 따라 다양한 나노파이버 제작이 가능하며, 파이버 표면에 다양한 작용기 도입이 가능하기 때문에 효소 를 고정화하기 위한 작용기를 추후에 따로 도입할 필 요가 없어 바로 효소 고정화에 사용이 가능하다. 따라 서 흡착, 공유결합, 코팅 등 다양한 효소 고정화 방법 을 적용하는데 있어 가장 적합한 재료로 여겨진다. 나 노파이버를 이용한 트립신 고정화 방법은 주로 효소 코팅 기법이 제안되었다. 효소 코팅 과정은 두 단계로 구성 되는데, 먼저 나노파이버 표면에 트립신을 공유 결합하여 고정화하고, 이후 가교결합(cross-linking) 이 가능한 적절한 링커를 이용하여 공유결합된 효소 주변으로 다량의 효소가 가교결합 되도록 한다. 가교 결합에 의해 응집된 트립신은 이미 나노파이버에 공 유결합된 트립신과 재결합하여 나노파이버 주변에 다

특·별·기·획(Ⅳ)

그림 3. 트립신이 코팅된 나노파이버의 SEM 이미지 (우), 트립신 코팅 과정 (좌) [Proteomics 10 (2010) 687].

그림 4. 이스트 단백질체 분해를 위한 트립신 코팅된

나노파이버의 재사용 [Proteomics 9 (2009) 1893].

량의 트립신이 코팅되는 효과를 얻을 수 있다[그림 3]. 트립신 분자들이 그물 구조로 촘촘하게 서로 연결 되어 있기 때문에 트립신 코팅의 구조적 안정성이 우 수하고, 이로 인해 효소의 안정도와 활성도가 극대화 되는 효과를 얻을 수 있다. 나노파이버에 고정된 트립 신 코팅은 약 1년 이상 초기 활성도를 유지할 수 있는 것으로 알려져 있다. 트립신이 코팅된 나노파이버는 물리적으로 시료에서 반응시킨 후 쉽게 분리가 가능 하기 때문에 액상 단백질 분해에 적용이 가능하고 지 속적인 재사용이 가능하다[그림 4]. 고온, 유기용매 등의 극한 조건에서도 트립신 용액보다 우수한 활성 도와 안정성을 보이기 때문에 다양한 환경 조건에서 얻어진 단백질체 시료의 효율적인 분석이 가능할 것 으로 보인다. 트립신이 코팅된 나노파이버를 컬럼에 충진하여 단백질 분해 컬럼을 제작한 연구도 최근에 보고가 되고 있다. 트립신이 코팅된 나노파이버 컬럼 은 공유결합에 의해 트립신이 고정화된 기존의 실리 카 혹은 폴리머 컬럼보다 장기간 안정성과 높은 활성 도, 단백질 분해를 위한 연속적인 재사용 가능성을 보

이기 때문에 온라인 자동화 단백질체 분석 시스템 개 발에 활발히 적용될 것이다.

결론

이상과 같이 단백질체 연구에서 트립신의 활용도를 살펴보았고, 효율적인 단백질분해를 위해 안정화된 트립신 확보의 전략으로 몇몇 나노구조재료를 이용한 트립신 고정화 방법을 소개하였다. 적절한 나노구조 재료의 선택을 통해 트립신에 재사용성, 자가분해 저 항성, 극한 환경 조건에서의 저항성 등 다양한 기능을 부여할 수 있다. 이용하고자 하는 단백질체 분석 시스 템과 나노구조재료에 고정화된 트립신의 적절한 조합 을 통해 효율적이고 성능이 개선된 단백질체 분석 자 동화 시스템 개발이 가능할 것이고, 단백질체 연구에 있어 활용도가 상당히 높을 것으로 기대된다. 비단 트 립신 뿐만 아니라 산업적 응용성이 높은 효소에 본 고 에서 소개된 유사한 고정화 방법을 적용하는 기술이 많이 사용될 것이다.

나노바이오촉매를 이용한 면역측정 기술

박운선, 김학성*

한국과학기술원 생명과학과 {wsp226, *hskim76}@kaist.ac.kr

서론

ELISA(enzyme linked immune-sorbent assay) 기술은 인간 질병을 조기 진단 및 치료하기 위해 개발 된 오랫동안 사용해온 기술이다. 최근 진단의 감도와 신뢰성에 대한 요구가 높아지면서 기존의 ELISA 방 법으로는 민감도나 정확성이 충분하지 못할 때가 많 다. 본 고에서는 나노입자와 효소를 접목시킨 나노바 이오촉매를 다양한 방식으로 제조하여 ELISA 방법

의 측정 성능을 향상시킨 최근의 연구와 앞으로의 발 전 방향에 대해 기술하고자 한다.

ELISA

ELISA는 잘 알려진 면역진단을 위한 분석 기술로서 항체와 항원의 특정 결합과 효소반응에 의한 신호 증폭 을 통해 측정대상 물질의 농도를 분석하는 방법이다 [그림 1]. ELISA 기술은 다양한 종류의 생화학 물질