65 책임저자：구자영, ꂕ 609-817, 부산시 남구 대연 6동 1758-16
구자영내과
Tel: 051-646-2868, Fax: 051-636-3045 E-mail: 1114jyk@hanmail.net
접수일：2006년 1월 18일, 게재승인일：2006년 2월 20일
Resveratrol의 인체 췌장암 세포주 증식 억제 효과
1고신대학교 의과대학 내과학교실, 2부산대학교 식품영양학과, 3구자영내과
이지영1․어완규1․김보경2․정근옥2․구자영3
The Inhibitory Effect of Resveratrol on the Growth of Human Pancreatic Cancer Cell Line in Vitro
Jee-Young Lee1, Wan Kyu Eo1, Boh-Kyung Kim2, Keun-Ok Jung2 and Ja-Young Koo3
1Department of Internal Medicine, Kosin University College of Medicine, Busan 602-703, 2Department of Food Science and Nutrition, Pusan National University, Busan 609-735, 3Koo Ja Young Medical Clinic, Busan 609-817, Korea
Resveratrol (3,5,4'-trihydroxystilbene), a phytoalexin, is emerging as a natural compound with anti- oxidative, anti-angiogenic and anti-carcinogenic activity and anti-inflammatory effects in animals, but only a small number of studies were done on its anti-proliferative effects, especially in pancreatic cancer.
In the present study the effects of resveratrol on the growth of human pancreatic cancer cell line, capan-1 cells were examined and the combined effects with 5-fluorouracil (5-FU) were also studied. Cell cycle distribution and apoptosis induction were evaluated to determine the mechanisms for the inhibitory effects of resveratrol. The growth of capan-1 cells was examined by counting cell number on two and four days treatment with 1, 2.5, 5, 7.5, 10, 25 and 50μM resveratrol, and 0.1 and 0.3μg/ml 5-FU, after plating capan-1 cells into 35 mm2 plastic dishes at a density of 10×104 cells/dish. The reversibility of the effects of resveratrol was examined on one day to seven days treatment with 7.5μM resveratrol after seeding 2×104 cells/dish. To examine the mechanisms for the inhibitory effects of resveratrol, cell cycle analysis was done on the cells after four days treatment with 10, 50, and 100μM resveratrol.
Resveratrol significantly inhibited the growth of capan-1 cells in a dose-dependent fashion (p＜0.05).
After removal of the resveratrol from the media, the suppressive effect of resveratrol on cell proliferation did not returned to normal, and cell count was significantly lower than that of control (p＜0.05). Re- sveratrol enhanced the inhibitory effect of 5-FU on capan-1 cells. 4) The cells accumulated at the S and G0/G1 transition of the cell cycle. Resveratrol induced apoptosis of cells and it was correlated with the concentration of resveratrol. Resveratrol significantly inhibited the growth of capan-1 cells in a dose- dependent fashion and its inhibitory effect was irreversible. The inhibitory effect of resveratrol on the proliferation of capan-1 cells may be derived from inhibition of progression from S to G2/M of the cell cycle, and from the apoptosis that is proportional to the concentration of resveratrol. Enhanced inhibitory effect of 5-FU on capan-1 cells by adding resveratrol may help avoid toxic side effect of 5-FU by decreasing its dose. In vivo study is needed. (Cancer Prev Res 11, 65-72, 2006)
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Correspondence to：Ja-Young Koo
Koo Ja Young Medical Clinic, 1758-16 Daeyeon 6-dong, Nam-gu, Busan 609-817, Korea
Tel: +82-51-646-2868, Fax: +82-62-636-3045 E-mail: hisnutrition@nambu.ac.kr
서 론
췌장암은 조기 진단이 어렵고, 수술 시행 후에도 재발 하는 경우가 많다.1) 진행성이거나 재발하는 경우에는 항 암화학요법이나 방사선 치료 등을 시도하지만 효과 면 에서 아직 만족할 만한 정도는 아니며, 그 부작용 또한 적지 않다. 따라서 새로운 항암제를 개발하려는 노력과 함께, 기존의 항암제와 병용 투여 시에 항암제의 부작용 을 줄이거나 항암 효과를 증가시킴으로써 치료 효과를 높일 수 있는 약물들에 대한 연구가 활발히 진행되고 있 다.2)
Resveratrol (3,5,4'-trihydroxystilbene)은 포도와 같은 식물 에서 진균을 포함한 감염균으로부터 자신의 몸을 보호 하기 위해 생성되는 물질인 phytoalexin의 일종으로서 포 도껍질, 적포도주, 땅콩류(nuts) 및 장과류(berries) 등에 포 함되어 있으며 중국에서 항염증성물질로 오랫동안 사용 해 왔다. 이 물질의 항산화 효과 및 심혈관계질환 예방효 과, 항암효과, 염증관련 질환 예방효과 등에 관하여 지금 까지 많은 연구가 진행되고 있다.3∼5)
Jane 등6)은 in vivo에서 resveratrol의 항암효과에 관해 처 음으로 보고하였는데, 그 이후 resveratrol의 세포증식 억 제 기전에 관한 많은 연구가 이루어졌다. Resveratrol은 에 스트로겐 수용체를 활성화하여 세포증식을 억제하고 세 포사멸을 유도하며, NO 합성효소의 inducible form (iNOS) 를 억제하며 혈관증식을 억제하고, NOS의 내피세포 isoform (eNOS)를 유도하여 p53, p21 활성, S/G2기에서 세 포주기 차단을 유발하여 세포증식 차단과 세포사멸을 초래한다. 또한 resveratrol은 세포 내 COX2의 지나친 발 현을 억제하여 종양성장을 억제한다. Resveratrol은 대개 G1/S기 경계, S기를 차단하고, 드물게는 G2/M기도 차단 하는데, 이와 같은 차단이 가역적인지, 세포사멸로 가는 첫 단계인지는 불분명하다. Resveratrol에 의한 세포주기 차단의 유전학적 연구결과 p53 형성을 촉진하여 G1/S의 단계를 차단하며, 핵산형성효소를 억제함으로써 DNA 합성을 억제하여 S기를 차단한다.7)
Resveratrol은 대장암8) 유방암,9) 백혈병,10) 악성 림프종,11) 간암,12) 식도암,13) 위암,14) 전립선암,15) 폐암,16) 난소암,17) 자궁내막암18) 등 여러 종류의 암들의 발생을 예방 및 치 료하는 효과가 있다. 그러나 췌장암을 대상으로 한 연구 는 적은 편이며,19,20) 항암제와의 병용효과에 대한보고는 없다.
이에 본 연구에서는 세포배양실험을 통하여 resveratrol 이 인체췌장암세포주(capan-1 세포주)의 증식에 미치는
효과 및 resveratrol과 기존의 항암제 5-fluorouracil (5-FU)과 의 병용효과를 조사하고, resveratrol의 췌장암세포주에 대한 증식억제에 따르는 각 세포주기별 비율을 flow cytometry를 이용하여 분석함으로써 resveratrol의 췌장암 치료 가능성을 규명하고자 이 연구를 시행하였다.
재료 및 방법 1. 재료
Resveratrol, 5-FU 및 Dimethyl sulfoxide (DMSO)는 Sigma 회사(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, RPMI 1640, fe- tal bovine serum (FBS), 0.05% trypsin-0.02% EDTA 그리고 penicillin-strerptomycin은 GIBCO사(USA)로부터 구입하여 사용하였다. Resveratrol이 포함된 용액은 각 well에 10씩 첨가하였고, 첨가할 때 DMSO 용액에 녹여 바로 사용하 였으며, 모든 실험에서 대조군에는 resveratrol 대신 동량 의 0.4% DMSO용액을 첨가하였다. 5-FU가 포함된 용액 은 각 well에 10씩 첨가하였고, 첨가할 때는 phosphate buffer saline (PBS)에 녹여 바로 사용하였으며 대조군에는 PBS를 동량 첨가하였다.
2. Capan-1 세포주 배양
인체 췌장암세포주(capan-1 세포)는 한국세포주은행(서 울의대)로 부터 분양 받아 배양하며 실험에 사용하였고, 세포 배양은 CO2 incubator (Forma, model 311 S/N29035, USA)를 사용하였다. Capan-1 세포주는 100 units/ml의 pe- nicillin-streptomycin과 10%의 FBS가 함유된 RPMI1640을 사용하여 37oC, 5% CO incubator에서 배양하였다. 배양된 각각의 암세포는 일주일에 2∼3회 refeeding하고 6∼7일 만에 PBS로 세척한 다음 0.05% trypsin-0.02% EDTA로 부 착된 세포를 분리하였다. 분리된 세포를 원심분리한 후 집적된 암세포에 배지를 넣고 피펫으로 암세포가 골고 루 분산되도록 잘 혼합하여 6∼7일마다 계대배양하면서 실험에 사용하였다. 계대배양 시 각각의 계대회수를 기록 하였고 그 수가 10회 이상일 때는 새로운 암세포를 액체 질소 탱크로부터 꺼내어 다시 배양하여 실험하였다.
3. Resveratrol의 capan-1 세포주 증식억제 효과
증식기에 있는 capan-1 세포주를 PBS로 세척한 후 0.05%
trypsin 0.02% EDTA 효소로 부착된 세포를 분리하여 원 심분리한 후 집적된 암세포를 골고루 분산되도록 잘 혼 합하여 6 well plate에 10×104 세포/well 농도로 seeding하 여 24시간 배양하였다. 암세포가 plate에 부착되었음을 확인한 후, 10% FBS가 있는 배지에 1, 2.5, 5, 7.5, 10, 25,
50μM의 농도로 resveratrol을 각각 3 well에 첨가하고 (triplicate), 37’C, 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 시료 처리한 날부터 2일 및 4일 후에, 증식된 세포를 0.05%
trypsin 0.02% EDTA 효소로 분리하여 각 세포 수를 hemo- cytometer로 측정하여, 그 세포 수를 0.4% DMSO용액을 첨가한 대조군의 세포 수와 비교하여 암세포 증식 억제 효과를 관찰하였다. 증식억제율은 대조군의 세포 수와 1, 2.5, 5, 7.5, 10, 25, 50μM의 resveratrol을 투여한 뒤 증식 된 세포수를 비교하여 계산하였다.
4. Resveratrol과 5-FU가 capan-1 세포주의 증식 에 미치는 상호작용
Resveratrol과 5-FU가 capan-1 세포주의 증식에 미치는 상호작용을 알기 위해서 증식기에 있는 capan-1 세포주 를 PBS로 세척한 후 0.05% trypsin 0.02% EDTA 효소로 부착된 세포를 분리하여 원심 분리 한 후, 집적된 암세포 를 골고루 분산되도록 잘 혼합하여 6 well plate에 10×104 세포/well 농도로 seeding하여 24시간 배양하였다. 암세포 가 plate에 부착되었음을 확인한 후, 10% FBS가 있는 배 지에 대조군, resveratrol 1, 5, 10μM, 5-FU 0.1, 0.3μg/ml, 여러 농도의 5-FU와 resveratrol의 병용 등 총 12군으로 나 누어 각 3 well에 첨가하고(triplicate), 37oC, 5% CO2 incu- bator에서 배양하였다. 부착세포는 시료 처리한 날로부 터 4일 후에, 0.05% trypsin 0.02% EDTA 효소로 분리하였 다. 그렇게 하여 분리된 세포들의 수를 hemocytometer로 측정하여 대조군과 비교하여 각 군의 암세포 증식 억제 효과를 관찰하였다. 증식 억제율은 대조군의 세포수에 대해 각각 농도의 resveratrol 또는 5-FU를 투여한 뒤 증식 된 세포 수를 비교하여 계산하였다.
5. Resveratrol의 capan-1 세포주 증식억제 효과의 가역성
Resveratrol이 capan-1 세포주에 미치는 증식억제작용의 가역성 여부를 조사하기 위해서 증식기에 있는 capan-1 세포주를 PBS로 세척한 후 0.05% trypsin 0.02% EDTA 효 소로 부착된 세포를 분리하였다. 분리된 capan-1 세포주 를 원심 분리 한 후 집적된 암세포를 골고루 분산되도록 잘 혼합하여 6 well plate에 2×104 세포/well 농도로 seed- ing하여 24시간 배양하였다. 암세포가 plate에 부착되었 음을 확인한 후, 10% FBS가 있는 배지로 갈아주면서 3 well에는 resveratrol 7.5μM을 첨가하고 다른 3 well에는 대 조군으로서 0.4% DMSO용액을 첨가하여 37oC, 5% CO2
incubator에서 다시 24시간 배양한 후에 10% FBS가 있는 배지로 갈아주면서 세포 수를 계산하였고, 그 후 1일,
3일, 5일 및 7일 째에 대조군, resveratrol을 제거한 군(I군) 및 resveratrol을 제거하지 않은 군(II군)에서 각각 증식된 세포를 trypsin으로 분리하여 각 세포수를 hemocytometer 로 측정하였다. 그렇게 측정된 세포 수를 양군간에 비교 하여 암세포 증식 억제효과의 가역성 여부를 관찰하였다.
6. Flow cytometry를 이용한 capan-1 세포주 세포 주기 분석
Resveratrol이 capan-1 세포주의 증식을 억제하는데 있 어서 세포주기의 어느 단계를 지연시키는지를 flow cyto- metry를 이용하여 2회 시행, 분석하였다. Resveratrol을 각 각 10, 50, 100μM을 첨가한 배지에서 4일간 배양된 ca- pan-1 세포주를 PBS 용액으로 세척한 후, 4oC에서 30분간 70% ethanol로 고정하였다. 고정 후 RNase A (Sigma, USA) 를 넣어서 RNA를 처리하고 DNA intercatalating dye인 propidium iodide (Sigma, USA)로 DNA를 염색하여 Becton Dickinson FACStar Flow Cytometery 및 Becton Dickinson Cell Fit 프로그램을 이용하여 세포주기를 비교 분석하였다.
7. Resveratrol에 의한 capan-1 세포주 세포사멸 검 사
Capan-1 세포주에 resveratrol을 첨가하여 48시간 배양 한 후 DAPI로 염색하였다. 이후 10분간 실내에서 배양한 뒤 PBS로 세척하고 청색필터를 사용한 형광현미경(×
400)으로 세포사멸을 확인하였다.
8. 통계학적 분석
실험 결과에 대한 분석은 일원분산분석(ANOVA) 중의 Duncan’s multiple range test를 이용하였으며, p 값이 0.05 미만일 때 의미 있는 것으로 간주하였다.
결 과
1. Resveratrol의 capan-1 세포주 증식억제 효과
배양 2일 후 Resveratrol 1μM 첨가 후 capan-1 세포주 수는 44.7×104였고, 0.4% DMSO만 첨가한 대조군의 ca- pan-1 세포주 수는 57.3×104로서 resveratrol 첨가군에서 대조군보다 capan-1 세포주 수가 더 적었다(p＜0.05). 첨 가된 resveratrol이 2.5, 5, 7.5, 10, 25, 50μM인 경우에 capan-1 세포주 수는 각각 39×104, 34×104, 32×104, 29
×104, 18×104, 10×104로서 각 농도에서 대조군 보다 capan-1 세포주 수가 통계적으로 유의하게 적었다(p＜
0.05). 배양 2일 후 resveratrol 농도와 capan-1 세포주 증식 억제효과는 상관관계가 있었다(p＜0.05)(Fig. 1). 배양 4일
후 resveratrol 1μM을 첨가한 군의 capan-1 세포 수는 124
×104로서 대조군의 136×104과 비교하여 유의하게 증식 이 억제되었다(p＜0.05). Resveratrol 2.5, 5, 7.5, 10, 25, 50 μM인 경우에 capan-1 세포주 수는 각각 98×104, 95×
104, 81×104, 62×104, 53×104, 37×104로서 각 농도에서 대조군 보다 capan-1 세포주 수가 통계적으로 유의하게 적 었다(p＜0.05). 배양 4일 후 resveratrol 농도와 capan-1 세포 주 증식 억제효과는 상관관계가 있었다(p＜0.05)(Fig 2).
2. 배양 4일째 Resveratrol과 5-FU가 capan-1 세 포주의 증식에 미치는 상호작용
5-FU 0.1μg/ml를 첨가한 군의 capan-1 세포주 수는 104
×104였고, 여기에 resveratrol 1, 5, 10μM을 첨가한 뒤의 세포 수는 각각 70×104, 56×104, 45×104로서, resveratrol
Fig. 1. The Effect of various concentrations of resveratrol on the growth of capan-1 cells. Values are the mean of two sepa- rate experiments (n=3 per experiment). Numbers of cells 2 days after incubation with various concentrations of resveratrol are significantly different (p＜0.05), and numbers of cells 4 days after incubation with various concentrations of resveratrol are signif- icantly different (p＜0.05).
R: resveratrol (μM).
Fig. 2. The effect of various concentrations of resveratrol on the growth inhibition rate of capan-1 cells. Growth inhibition rate was correlated with concentration of resveratrol at both 2 and 4 days after seeding (p＜0.05).
Fig. 3. The effect of various concentrations of resveratrol and 5-FU 0.1μg/ml on the growth of capan-1 cells 4 days after seeding. Values are the mean of two separate experiments (n=
3 per experiment). Numbers of cells 4 days after incubation with 5-FU 0.1μg/ml and various concentrations of resveratrol are significantly lower than that with 5-FU 0.1μg/ml (p＜0.05).
F: 5-FU (μg/ml), R: resveratrol (μM).
Fig. 4. The effect of various concentrations of resveratrol and 5-FU 0.3μg/ml on the growth of capan-1 cells 4 days after seeding. Values are the mean of two separate experiments (n=
3 per experiment). Numbers of cells 4 days after incubation with 5-FU 0.3μg/ml and various concentrations of resveratrol are significantly lower than that with 5-FU 0.1μg/ml (p＜0.05).
F: 5-FU (μg/ml), R: resveratrol (μM).
을 첨가한 경우에 5-FU을 단독 사용한 경우보다 세포의 증식이 더 억제되었다(p＜0.05)(Fig. 3).
5-FU 0.3μg/ml를 첨가한 군의 capan-1 세포주 수는 76
×104였고, 여기에 resveratrol 1, 5, 10μM을 첨가한 뒤의 세포 수는 각각 54×104, 30×104, 19×104로서, resveratrol 을 첨가한 경우에 5-FU을 단독 사용한 경우보다 세포의 증식이 더 억제되었다(p＜0.05)(Fig. 4).
증식억제율은 5-FU 0.1μg/ml를 첨가한 군에서 31.7%였 고, 여기에 resveratrol 1, 5, 10μM을 첨가한 뒤에는 각각
54.2, 63.2, 70.5%였다. 한편 5-FU 0.3μg/ml를 첨가한 군에 서 증식억제율은 50.3%였고, 여기에 resveratrol 1, 5, 10μM 을 첨가한 뒤에는 각각 64.5, 80.3, 87.5%였다(Fig. 5).
3. Resveratrol의 capan-1 세포주 증식억제 효과의 가역성
Resveratrol이 capan-1 세포주의 증식에 미치는 억제작 용의 가역성을 보기 위한 실험에서, 접종 후 24시간 뒤에 resveratrol을 첨가한 후 24시간 배양했다가 첨가한 re- sveratrol을 제거한 날 즉, 접종 2일째는 I군과 II군 사이의 세포 수는 각각 4.0×104 및 4.0×104로서 차이가 없었고, 대조군의 9.5×104보다는 그 수가 적었다. Resveratrol을 제거한 지 3일째, 즉 접종 4일째의 I군의 세포 수는 30.5
×104로서 대조군의 36.5×104보다 세포수가 적었고, II 군의 11.5×104에 비해서는 세포수가 많았다(p＜0.05). 그 이후부터 배양 8일째까지 I군의 세포 수는 대조군보다 적었다(p＜0.05)(Fig. 6, 7).
4. Flow cytometry를 이용한 세포주 cycle analysis
Resveratrol 10, 50, 100μM을 첨가한 배지에서 4일간 ca- pan-1 세포주를 배양시킨 군과 resveratrol 첨가 없이 배양 시킨 대조군의 세포주기를 측정을 하였다. 대조군, re- sveratrol 10, 50, 100μM에서 배양한 세포의 세포주기 분 석에서, G0/G1기는 각각 30.53%, 46.03%, 44.05%, 50.94%
였다. S기는 각각 13.73%, 16.23%, 18.89%, 22.23%였고, G2/M기는 각각 55.38%, 38.61%, 37.92%, 27.62%였다. 따 라서 resveratrol의 농도가 증가함에 따라 S기와 G0/ G1의 Fig. 5. The effect of various concentrations of resveratrol and
5-FU on the inhibition rate of capan-1 cells 4 days after se- eding. Values are the mean of two separate experiments (n=
3 per experiment).
F: 5-FU (μg/ml), R: resveratrol (μM).
Fig. 6. The effect of resveratrol withdrawal on the growth of capan-1 cells. Group I, resveratrol treatment for 24 hours followed by replacement with resveratrol-free medium; Group II, continuous resveratrol treatment without replacement with resveratrol-free medium. The means of the 3 groups are significantly different at day 4, 6, and 8 (p＜0.05).
Fig. 7. The effect of resveratrol withdrawal on the growth inhibition of capan-1 cells. Group I, resveratrol treatment for 24 hours followed by replacement with resveratrol-free medium;
group II, continuous resveratrol treatment without replacement with resveratrol-free medium.
세포수가 증가하고, G2/M기의 세포수가 감소하였다(p＜
0.05)(Fig. 8).
5. 세포사멸
Resveratrol이 10, 50, 100μM일 때 세포사멸은 각각 32.0%, 35.1%, 45.0%로 농도에 비례하여 세포사멸이 증 가하였다(p＜0.05)(Fig. 9).
고 찰
Resveratrol은 에스트로젠 수용체를 활성화하여 세포증 식을 억제하고, 세포사멸을 유도한다. 또한 resveratrol은 외부로 약제가 들어올 때 세포의 반응에 관여하는 방어 기전 중, DNA 손상을 유발하여 암 발생을 높이는 I상 반응을 억제하는 반면에, 세포의 배출작용에 관여하는 II상 반응을 촉진하여 암 예방 작용을 한다. iNOS은 암세 포에서 증가되어 있는데, iNOS는 COX2, VCAM1, ICAM1 의 증가와 잘 동반되며 병의 진행과 관계가 있다. COX2 는 염증과 세포분열 촉진물질(mitogen)에 의하여 생성이 증가되는데, 이는 종양세포의 세포사멸을 억제하고 전 이를 촉진한다. Resveratrol은 세포 내 COX2의 지나친 발 현을 억제하여 종양성장을 억제한다.7)
본 연구에서 resveratrol을 투여한 군에서 대조군에 비 하여 capan-1 세포주의 증식이 유의하게 억제되었으며, 이러한 억제효과는 resveratrol의 용량이 2.5μM일 때부터 관찰되었고, 50μM까지 농도를 단계적으로 증가시켰을
때 그 증식억제 효과는 농도에 비례하였다. 이번 연구에 서 관찰된 이러한 결과는 Ding 등의 췌장암 세포주를 대 상으로 한 연구와 비슷한 결과였다.19) 본 연구 결과는 resveratrol이 다른 인체 암 세포주들뿐 아니라, 췌장암세 포주에 대한 증식억제 작용도 가지고 있음을 나타낸 것 으로서 췌장암 환자의 치료제로 resveratrol이 유용하게 쓰일 수 있음을 시사한다.
본 실험에서 capan-1 세포주 성장이 억제된 한 원인으 로는 resvertatrol에 의해 세포주기가 차단되기 때문으로 생각된다. Resveratrol의 세포주기 차단에 대해서는 많은 연구들이 있는데 resveratrol에 12∼24시간 노출된 암세포 주는 G1/S 경계, S기를 차단하고, 드물게는 G2/M기도 차 단한다.7) Resveratrol은 iNOS를 억제하여 혈관증식을 억제 하고, ecNOS를 유도하여 p53, p21 활성, S/G2기에서 세포 주기 차단을 유발하여 세포주기 차단과 세포사멸을 초 래한다. p53은 세포주기를 진행시키는 물질인 cyclin을 억제하는 물질인 p21을 활성화시켜 G1에서 세포주기를 차단하는데, resveratrol은 p53 생성을 촉진하여 G1/S의 단 계를 차단한다. 또한 resveratrol은 DNA합성을 억제하여 S기를 차단하는데, 특히 ribonucleotide reductase, DNA polymerase를 억제하는 것이 밝혀져 있다. 본 연구에서도 resveratrol 농도를 증가시킴에 따라 G0/G1이나 S기의 비 율이 증가하고, G2/M기의 비율이 줄어들어, S기에서 G2/
M으로의 진행이 차단되는 것이 세포증식 억제의 기전으 로 보인다. 그러나 이와 같은 차단이 가역적인지, 세포사 Fig. 8. The effect of resveratrol on cell cycle phase distribution
of capan-1 cells. Exponentially growing capan-1 cells were treated with resveratrol, and flow cytometric cell cycle analysis was performed comparing untreated controls with cells treated with resveratrol for 48 hours. Values are the means of two independent determinations.
Fig. 9. Induction of apoptosis of capan-1 cells according to the concentration of resveratrol. Induction of apoptosis was evalua- ted by analyzing the presence of chromatin condensationby fluorescent microscopy using DNA-binding fluorescent dye DAPI. Treatment with 10 to 100μM of resveratrol induced chromatin condensation and nuclear fragmentation suggesting apoptosis.
멸로 가는 첫 단계인지는 불분명하다. 일부 연구에서는 resveratrol에 의한 차단은 가역적이고, 세포사멸은 없는 반면에 세포의 분화를 초래한다고 하였지만, 다른 연구 에서는 세포주기차단 뒤에 세포사멸이 이어진다고 하였 다.7)
본 실험에서 세포증식 억제작용이 비가역적이었는데, 세포주기의 진행이 차단됨과 더불어 세포사멸이 resvera- trol 농도에 비례하여 증가하였던 것으로 미루어, 세포증 식 억제의 원인으로 세포주기의 진행 억제 외에도 세포 사멸이 관여하기 때문으로 생각한다.7)
Resveratrol은 in vitro에서 5∼10μM의 농도로 유지되어 야 항암 효과를 나타낸다고 하는데,21) 본 연구에서는 2.5 μM 이상의 resveratrol이 유효농도였다. Resveratrol은 경구 로 섭취했을 5분 이내에 최고 농도에 이를 정도로 체내 흡수가 빠르지만 대사속도도 빠르다.22)
Resveratrol은 기존의 항암제와 함께 병용 투여했을 때 상승작용을 일으킨다는 보고가 있다. 간암세포주(H22 세포주)에서 resveratrol을 사용했을 때 5-FU 단독 사용했 을 때와 동등한 억제 효과가 있었고, 병용 투여하였을 때 각각 다른 세포주기에서 세포 성장을 억제함으로써 단독 투여 때보다 상승작용을 나타내었다.12) 또한 림프 종 세포주와 형질세포암 세포주에 resveratrol과 paclitaxel 을 함께 사용했을 때 상승작용이 나타난다는 보고도 있 다.11) Cal 등은 불응성 비호지킨림프종에서 gemcitabine, navelbine, cisDDP, paclitaxel, TRAIL 등의 항암제와 resver- atrol을 병용하였을 때 상승작용이 있음을 확인하였다.23) 본 연구에서는 5-FU와 resveratrol을 병용투여 했을 때 5-FU를 단독 투여했을 때에 비해서 세포성장이 더 억제 되어, 5-FU와 병용 시 resveratrol 단독 치료에 비하여 항암 효과를 상승시킬 수 있을 것으로 생각한다. 또한 동일한 정도의 억제를 하는 데 필요한 5-FU의 용량을 줄일 수 있어 5-FU 치료에 따른 부작용을 줄일 수 있을 가능성이 있다.
그러나 Resveratrol을 임상에 적용하기 위해서는 몇몇 문제점의 해결이 필요하다. Resveratrol은 고도의 지용성 이어서 지방조직 및 지방함량이 높은 조직의 영향을 받 을 수 있다. Resveratrol의 독성에 대한 연구는 동물연구에 서도 자세히 언급된 바가 없으며 인체를 대상으로 한 연 구는 없다. 또한 기존의 다수의 연구 결과 밝혀진 고농도 의 유효농도를 유지할 수 있도록 약을 투여할 수 있는가 가 미지수다. 반면에 소량의 resveratrol을 항암제와 병용 할 경우에도 항암제의 효과를 향상시킬 수 있는데, 현재 로는 resveratrol 단독보다는 소량의 resveratrol과 항암제의 병용에 대한 연구가 필요할 것으로 보인다.23,24)
결 론
Resveratrol은 농도에 비례하여 인체 췌장암세포주인 capan-1 세포주의 증식을 억제하였고, 그 증식억제 효과 가 비가역적이었다. 이와 같은 증식억제는 세포주기의 S기에서 G2/M기로의 진행 차단뿐만 아니라 세포사멸에 의한 것으로 생각한다. Resveratrol과 5-FU를 병용한 경우 에 5-FU 단독으로 사용한 경우에 비해 증식억제율이 증 가하였으므로, 췌장암 환자에게 5-FU 투여 시 병용 투여 한다면 5-FU의 용량을 줄일 수 있어 항암제의 부작용을 줄일 수 있는 효과를 기대할 수 있을 것으로 생각한다.
향후 이에 대한 in vivo 연구가 필요하다. 또한 췌장암에 효과가 있는 capecitabine이나 gemcitabine과 resveratrol의 병용 효과에 대한 연구가 필요하다.
감사의 글
이 연구는 고신대학교 의과대학 연구비의 지원에 의 한 연구결과로 이에 감사드립니다.
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