Simultaneous Determination of Doxifluridine and 5-FU in Liver and Intestine Tissue Using LC/MS/MS

LC/MS/MS를 이용한 원숭이 및 비글견의 간 및 장관 조직에서의 Doxifluridine과 대사체 5-FU 동시분석법 개발

우영아·김기환·정은주·김충용^# 안전성평가연구소

(Received October 24, 2007; Revised January 11, 2008)

Simultaneous Determination of Doxifluridine and 5-FU in Liver and Intestine Tissue Using LC/MS/MS

Young-Ah Woo, Ghee Hwan Kim, Eun Ju Jeong and Choong-Yong Kim

^#

Korea Institute of Toxicology, Daejeon 305-343, Korea

Abstract

— A liquid chromatographic method with tandom spectrometric detection (LC/MS/MS) for the simultaneous determination of doxifluridine and its active metabolite, 5-fluorouracil (5-FU) was developed over the concentration range of 5~2000 ng/ml, respectively. Doxifluridine, 5-FU and internal standard, 5-chlorouracil (5-CU), were extracted from liver and intestine tissue via protein precipitation. Acetonitrile was used as the extraction solvent and the supernatant was evap- orated and reconstructed in mobile phase. Optimum chromatographic separation was achieved on a Agilent Zorbax C

18

(100 mm×2.1 mm, 3.5

µ

m) column with mobile phase run in isocratic with methanol : water (20 : 80, v/v). The flow rate was 0.2 ml/min with total cycle time of 5 min. The lower limit of quantification was validated at 5.0 ng/ml of liver and intestine tissue, for both doxifluridine and 5-FU, respectively. The intra-day and inter-day precision and accuracy of quality control (QC) samples were <11% coefficient of variation and <7% relative error from theoretical concentration for both analytes.

In addition, the special designed stability study was performed, because the metabolism of doxifluridine occurs spon- taneously even in ice bath for monkey liver. The stability of doxifluridine in liver and intestine of monkey and beagle dog was compared. It was found that bioanalytical validation could not be performed for the monkey liver; however, beagle dog’s liver has relatively low speed of metabolism compared to monkey liver and instead of monkey liver, beagle dog’s liver could be used for the validation. Bioanalytical validation could be performed in monkey intestine. Eventually, this developed method for liver and intestine will be useful in support of the toxicokinetic and pharmacokinetic studies of doxifluridine and 5-FU.

Keywords □

doxifluridine, 5-FU, LC/MS/MS, monkey, beagle dog, liver, intestine, simultaneous determination, stability

약물의독성학적연구나약리학적연구를위해서는약물의흡 수

,

^분포

,

^대사

,

^{배설에대한포괄적인이해가필요하고}

,

^이에대

상조직에서의약물과대사체의분포나축적을확인할수있는 분석법이필수적이다

.

특히

,

반복투여의경우에는

,

조직축적의 가능성이있어혈중농도와는별도의확인이필요하지만

,

^인체를

대상으로실험하는것은불가능하므로

,

같은영장류인원숭이를

이용한연구가실제

ADME

예측을함에유용하게사용될수있

다

.

^{이러한목적으로본연구에서는항암제독시플루리딘및}

5-

FU

의조직축적확인을위한분석법을개발하였다

.

독시플루리 딘은주로대장암에약효를나타내는약물로서

,

^{그대상조직이}

장관조직으로

,

^{본연구에서는간조직과장관조직중의독시플}

루리딘과

5-FU

를

LC/MS/MS

를이용하여신속하게선택적으로

분석할수있는방법을개발하였다

.

독시플루리딘

(doxifluridine)

은플루오로피리미딘

(fluoropyri- midie)

유도체로서항암효과를가진

5-FU(fluorouracil)

의독성을 감소시키고치료효과를증대시킬목적으로합성되었으며

,

^결장

암

,

직장암

,

유방암등의치료에많이쓰이고있는항암제중의 하나이다

.

독시플루리딘자체로는항암효과를가지고있지않고

,

디옥시리보푸라노실

(deoxyribofuranosyl)

^{기가티미딘포스포릴라}

아제

(thymidine phosphorylase, TP)

에의해종양조직에서선택

#본논문에관한문의는저자에게로

(

^전화

) 042-610-8051 (

^팩스

) 042-610-8172

(E-mail) [email protected]

적으로떨어져나감으로서

, 5-FU

^{형태인활성화된대사형태로서}

항암효과를나타내는

5-FU

^{의전구체이다}

. 5-FU

^는

TS(thymidylate

synthase)

를저해시키고세포내뉴클레오타이드생합성을방해

하여항암효과를나타낸다

.

¹⁾

5-FU

^는

20

^{년이상항암제로서널}

리사용이되었고

,

독성을줄이고치료효과를높이기위한여러 가지형태의전구약물이개발되어왔다

.

독시플루리딘은

5-FU

의전구약물로서주로경구로투여되며정상적인조직에비교 하여다양한형태의종양조직에서높은농도로발견되는

TP

에

의해

5-FU

로전환된다

.

²⁾하지만

,

독시플루리딘도정상적인세포

에도존재하는

TP

^에의해

5-FU

^{로전환이되며}

,

^설사

,

^소화기출

혈

,

백혈구감소등항암제의독성이여전히나타나는문제점이 있다

.

이러한항암제의경우

,

^{현실적으로정상적인사람의체내동}

태를파악하기어려운점이있기때문에사람과유사한실험동 물로서 원숭이같은 영장류를 이용하여약물동태

/

독성동태

(pharmacokinetics/toxicokinetics)

^{를평가하는기술이필수불가}

결한요소이다

.

이러한약물동태

/

독성동태를파악하기위해서는 약물을분석할수있는분석법이필요함에따라

,

^{이전연구에서}

LC/MS/MS

^{를이용한원숭이혈액중에존재하는독시플루리딘}

과

5-FU

동시분석법을보고한바있다

.

³⁾

지금까지독시플루리딘과

5-FU

^{에대한분석은주로}

HPLC-

UV

^법이나

LC/MS/MS

^{를이용한방법이보고되었다}

.

^보고된분

석법은주로

5-FU

를분석하는방법으로써

,

^4-6)독시플루리딘과

5-

FU

^{를동시에분석하는방법으로보고된}

HPLC-UV

^{법은한시료}

를분석시독시플루리딘과

5-FU

^{의극성차이로인하여복잡한}

고상추출과정을거치고

,

한시료당

20

분이소요되는긴

LC

분

석시간의단점이있다

.

^7,8)

LC/MS/MS

^{를이용하여독시플루리딘}

과

5-FU

^{를동시에분석한방법또한}

LC

^{분석시간이}

12

^분이고

5-

FU

에대한최저정량한계치

(lower limit of quantification, LLOQ)

가

50 ng/ml

^{로상대적으로높은값을나타내고있다}

.

⁹⁾

주로분석법은혈중독시플루리딘이나

5-FU

^{를분석하는방법}

으로서간조직이나장관조직중에분포되어있는약물을간단 하고신속하게분석하는방법은거의보고되어있지않다

.

^그러

므로

,

본연구에서는원숭이간조직이나장관조직에존재하는 독시플루리딘과

5-FU

을동시에분석할수있도록선택적으로감

도가높은

LC/MS/MS

^{방법을이용하고}

,

^{효과적인크로마토그래}

피법을이용하여한시료당분석시간을

5

분이내로분석할수있 도록개선하였다

.

이전에본연구팀에의해발표한원숭이혈액중독시플루리

딘및대사체

5-FU

의분석에서는액상추출법을사용하였지만

,

조직시료에 적용시효율적인추출효율을유도할수없었고

,

LLOQ

^{또한조직에서의존재량이혈중보다매우낮을것으로예}

상되므로

,

보다낮은농도로분석하기위해유기용매에의한단 백질침전법을이용한새로운시료전처리조건을확립하였다

.

조직중의구조상극성차이가많이나는독시플루리딘과

5-FU

를동시에시료전처리할수있도록적절한추출용매를사용 하였고

,

동시에간편하게많은시료수를분석할수있도록

96-

well filtering plate

^{를이용하여전처리에소요되는시간을단축}

시켰다

.

또한

, LC

분석시간을

5

분이내로단축하여신속하고정

확하게두가지물질을동시에정량할수있는분석법을개발 하였다

.

또한원숭이간조직의경우

,

공시료에독시플루리딘을첨가

하자마자

5-FU

등으로대사되는현상이발견되어

,

간조직분석

을위해서비글견의간조직을사용하였다

.

^{독시플루리딘과}

5-FU

의간및장관조직안정성을시간과온도를달리하여원숭이 및비글견에서비교하였다

.

실험 방법

시약및기구

본연구에서사용한표준물질인독시플루리딘

(99.3%)

은신풍 제약에서공급받았으며

,

^대사체인

5-FU

^는

Sigma-Aldrich

^사

(MA, USA)

^{에서구입하였다}

.

^{내부표준물질로사용한}

5-CU(chlorouracil)

도

Sigma-Aldrich

사

(MA, USA)

에서구입하였고

,

이동상용매로

사용된메탄올은

J. T. Baker(HPLC grade, USA)

^{에서구입하였}

다

. 2

^{차증류수는}

Milipore-Milli Q

^TM

(Tokyo, Japan)

^{를이용하여}

제조하였다

. Speedvac(Thermo, USA)

을사용하여

,

시료전처리 중유기용매를제거하였다

.

LC tandom mass spectrometry

시료의분석에는

Agilent HP 1100 series liquid chromatograph/

API 3200 Qtrap mass spectrometer(Applied Biosystems, USA)

를사용하였다

.

질량분석기의이온화방식에는전기분무이 온화

(electrospray ionization, ESI)

^{법을사용하였다}

. HPLC

^분석

에서 컬럼은

C

18

(Zorbax XDB, Agilent)

^으로

10 mm(length)

^×

2.1 mm(i.d.)

×

3.5

µ

m(particle size)

를사용하였으며

,

이동상으로

는메탄올

/

^물을

20 : 80(v/v)

^{의비율로등용매분리조건으로}

5

^분

동안분리하였고

,

유속은

0.2 ml/min

로하였다

. MS

조건에서는

multiple reaction monitoring(MRM)

모드에서독시플루리딘은

245

^→

108, 5-FU

^는

129

^→

42, 5-CU

^는

145

^→

42

^{의조건에서검출}

하였고

,

음

(negative)

이온화모드에서각각의

collision energy

는

-28, -30

및

-28 V

를사용하였다

. Source

온도는

500

^o

C

로하였고

, declustering potential

^{은세이온모두}

-30 V

^로하였고

, entrance potential

은

-10 V

로하여분석하였다

.

시료전처리

본실험에서는원숭이

(Macaca fascicularis)

간및장관조직과

비글견

(Canis familiaris)

의장관조직을사용하였다

.

간조직의

경우

,

^{원숭이간조직공시료에독시플루리딘첨가하자마자대사}

가일어나독시플루리딘이손실되기때문에비글견의간조직으 로대체하여실험을진행하였고

,

장관조직은원숭이의것을사 용하였다

.

^{분석법개발을위해간조직을두배}

(

^중량

/

^용량

)

^의인

산완충액

(pH 6.8)

을넣고

,

장관조직은네배

(

중량

/

용량

)

의인산 완충액

(pH 6.8)

을넣어

homogenizer(Powergen 700, Fisher)

로 분쇄하여준비하였다

.

^{여기서조직시료}

50

^µ

l

^{를취하여단백질을}

제거하기위해

acetonitrile 150

µ

l

와내부표준품

(5-CU, 40 ng/ml) 50

µ

l

^를넣어

96-well membrane filter plate(Protein precipitation FF, Fisher Scientific)

^{에넣어혼합기}

(CM 1000, EYELA)

^로

2

^분간

섞어 주었다

.

이것을 감압 여과하여 감압농축기

(SPD 1010,

Thermo)

^{를이용하여용매를제거하였다}

.

^{잔사에이동상}

100

^µ

l

^로

넣어용해시킨다음

,

^여기서

10

^µ

l

^를취해

HPLC

^{에주입하였다}

.

검량선작성

독시플루리딘과

5-FU

^{표준품을이동상과메탄올에녹여}

100

µ

g/ml

로한다음

,

이표준액을적당한범위로희석한다음

,

공조 직에

1/9

^{비율로첨가하여독시플루리딘과}

5-FU

^의농도가

5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000 ng/ml

^{가되도록표준조직시}

료를만들었다

.

개발한분석법의정확성

,

정밀성

,

안정성을확인

하기위하여

,

^{세가지종류의}

QC

^{시료를같은방법으로}

15, 400,

1600 ng/ml

^{가되도록조제하였다}

.

분석법검증

(Bioanalytical method validation)

개발된분석법은검량선작성용표준시료이외에별도로조제 한

QC

시료를저농도

(15 ng/ml),

중농도

(400 ng/ml),

고농도

(1600 ng/ml)

^{를이용하여정확성}

(accuracy %)

^과정밀성

(coefficient of

variance %)

을확인하였다

.

일간정밀성을확인하기위하여

, 3

일

동안같은방법으로분석한결과를평가하였으며

.

본방법의간 조직및장관조직시료에서의회수율을평가하였다

.

^시료전처

리후안정성평가를위해

,

^{시료전처리후자동시료주입기}

, 4

^o

C

에서

24

시간보관후변화를평가하였다

.

조직안정성평가

간조직과장관조직에서의분석물질

,

독시플루리딘과

5-FU

의 안정성을평가하기위하여

,

^{원숭이및비글견의간조직}

,

^원숭이

장관조직에독시플루리딘과

5-FU

를각각첨가하여온도

(ice bath,

실온

, 37

^o

C)

및시간

(0, 1, 2, 3, 4 hr)

에따른변화를확인하였다

.

결과 및 고찰

혈청중독시플루리딘과대사체인

5-FU

^{의분석법검증}

선택성 − 본연구에서개발한분석조건에서독시플루리딘과

5-FU

의분석을방해할수있는간조직과장관조직중에존재

하는내인성물질이나간섭물질에의한영향을조사하기위하여

LLOQ

에해당하는시료의크로마토크램을확인하였다

. Fig. 1(a)

및

(b)

에서확인할수있듯이독시플루리딘의경우

,

간조직및 장관조직의공시료에서는분석물질의피크를없음을확인하였 다

. 5-FU

의경우

, Fig. 1(c)

및

(d)

분자량이적기때문에혈액중 의아미노산등의내인성물질에의한간섭영향피크가보이기 는하지만

,

^{분석물질에비해상대적으로매우적고}

,

^{실제분석결}

과에서도영향이없음을확인하였다

.

이런결과를통하여본연 구에서개발한분석방법이독시플루리딘및

5-FU

^{를생체시료}

내에서선택적으로분석할수있음을확인할수있었다

.

^독시플

루리딘과

5-FU

의머무름시간은각각

2.8

분

, 1.6

분이었으며

,

내

부물질로사용한

5-CU

^는

1.9

^분이었다

(Fig. 2).

^{세분석물질모}

두

3

^{분이내에피이크를확인할수있었고}

,

^{한시료당분석시간}

을

5

분내에분석법검증을수행하였다

.

직선성

,

^정확성

,

정밀성 − 독시플루리딘과

5-FU

^분석시

, 1/x

^에

대한가중치로단순회귀분석하였을때각각

5 ng/ml~2000 ng/

ml

에서직선성을나타내었고회귀계수는모두

0.999

이상이었다

. 5

^{회분석한검량선용표준생체시료에대한정확성과정밀성을}

Fig. 1 −

Chromatogram of (a) blank liver sample in doxifluridine

analysis mode (b) blank intestine sample in doxifluridine

analysis mode (c) blank liver sample in 5-FU analysis mode

(d) blank intestine sample in 5-FU analysis mode.

Table I

^{에나타내었다}

.

^{또한각각의분석물질에대한정확성과}

정밀성은별도의저농도

(15 ng/ml),

^중농도

(400 ng/ml),

^고농도

(1600 ng/ml)

에해당하는각각

6

개의

QC(quality control)

시료로 평가하였으며

,

일간정밀성은

3

일동안측정하였다

.

측정결과는

Table II

^{에서볼수있듯이}

,

^{간조직에서일내정확성및정밀성}

은

,

독시플루리딘은

97.6~103.4%

의정확성과

, 5.2~8.9%

의

CV

값을나타내었고

, 5-FU

는

94.3~104.6%

의정확성과

3.3~8.2%

의

CV

^{값을나타내었고}

,

^{장관조직에서는독시플루리딘은}

93.7~

102.1%

의정확성과

, 4.9~9.4%

의

CV

값을나타내었고

, 5-FU

는

97.9~100.7%

의정확성과

2.6~7.7%

의

CV

값을나타내었다

.

일간정확성및정밀성의경우

,

^{간조직에서는독시플루리딘}

은

97.0~103.2%

의정확성과

, 7.1~8.0%

의

CV

값을나타내었고

, 5-FU

는

96.0~103.2%

의정확성과

4.2~10.3%

의

CV

값을나타내 었고

,

^{장관조직에서는독시플루리딘은}

93.8~101.6%

^의정확성

과

9.5~9.8%

의

CV

값을나타내었고

, 5-FU

는

95.7~106.5%

의정

확성과

7.0~9.3%

^의

CV

^{값을나타내었다}

.

최저정량한계 − 최저정량한계는검량선의직선성을유지하면 서공조직시료에서나타날수있는피크의강도의

5

배이상이 되는농도로결정하였다

.

^{검량선용농도에서가장낮은농도에}

해당하는최저정량한계에해당하는

5 ng/ml

^에서의

5

^회분석결

과는

Table III

에나타난것처럼간조직에서독시플루리딘의경

우

,

^정확성은

92.4%, CV

^값은

11.2%

^이었고

, 5-FU

^의경우는

,

^정

확성은

96.4%, CV

값은

6.7%

이었고

,

장관조직에서독시플루리

딘의경우

,

정확성은

93.5%, CV

값은

9.6%

이었고

, 5-FU

의경우 는

,

^정확성은

102.1%, CV

^값은

8.6%

^이었다

.

Fig. 2 −

LC/MS/MS chromatogram of (a) doxifluridine (b) 5-FU C) 5-CU at standard liver tissue sample of 10 ng/ml.

Table I −

Linearity and accuracy of doxifluridine and 5-FU for calibration curve samples in liver (a) and intestine tissue (b)

(a) Liver tissue Concentration

(ng/ml) Doxifluridine 5-FU

Accuracy (%) CV (%) Accuracy (%) CV (%)

0005 092.4 11.2 096.4 06.7

0010 098.3 10.5 104.1 06.8

0020 096.6 11.3 110.7 10.6

0050 101.8 07.8 096.1 05.4

0100 105.9 05.3 099.0 11.4

0200 102.5 03.3 097.4 03.5

0500 101.2 07.5 097.1 06.3

1000 106.2 01.8 101.9 04.0

2000 097.9 01.4 100.4 01.4

(b) Intestine tissue Concentration

(ng/ml) Doxifluridine 5-FU

Accuracy (%) CV (%) Accuracy (%) CV (%)

0005 093.5 9.6 102.1 8.6

0010 103.3 8.5 096.4 8.9

0020 098.9 6.1 100.8 5.0

0050 099.9 9.6 097.9 1.9

0100 103.9 9.1 099.9 7.5

0200 099.0 7.7 099.1 6.0

0500 106.9 6.0 103.6 2.7

1000 102.0 8.0 098.1 4.9

2000 098.0 4.4 099.8 2.2

Table II −

Intra- and inter-accuracy and precision for doxifluridine and 5-FU in liver and intestine tissue

Tissue Analytes Conc.

(ng/ml)

Intra-day (n=6) Inter-day (n=6) Accuracy

(%) CV

(%) Accuracy

(%) CV

(%) Liver Doxifluridine 0015 097.6 5.2 097.0 7.8 0400 099.2 8.9 101.2 8.0

1600 103.4 6.3 103.2 7.1

5-FU 0015 104.6 8.2 103.2 10.3

0400 094.3 3.3 098.2 4.2

　

1600 094.3 4.6 096.0 4.4

Intestine Doxifluridine 0015 102.1 4.9 101.6 9.0 0400 099.3 8.0 097.9 9.8 1600 093.7 9.4 093.8 9.5

5-FU 0015 100.7 6.5 106.5 7.0

0400 097.9 2.6 098.8 7.2

1600 100.3 7.7 095.7 9.3

Table III −

Accuracy and precision for LLOQ (5 ng/ml) samples (n=5)

Liver tissue Intestine tissue Doxifluridine 5-FU Doxifluridine 5-FU

Accuracy (%) 92.4 96.4 93.5 102.1

SD 00.5 00.3 00.4 000.4

CV (%) 11.2 06.7 09.6 008.6

회수율 − 저농도

(15 ng/ml),

중농도

(400 ng/ml),

고농도

(1600

ng/ml)

^{에해당하는시료}

(n=6)

^{를준비하여회수율을검토하였다}

.

회수율을구하는방법은확립된분석방법으로준비한시료의피 크면적

(A)

과공혈청에분석물질을첨가하지않고시료전처리 를마친후의분석물을첨가한후측정한피크면적

(B)

^의상대

적비율로측정하였다

.

^{10)간조직에서독시플루리딘의회수율은}

95.8%

이고

, 5-FU

의회수율은

97.3%

이었으며

,

장관조직에서독

시플루리딘의회수율은

76.8%

이고

, 5-FU

의회수율은

93.7%

이 었다

.

^{이러한결과로부터본실험에서개발한분석법이양호한}

회수율을나타냄을알수있었고

,

실제생체시료분석시높은회 수율로보다정확한결과를도출할수있는가능성을시사하였다

.

시료전처리후안정성 − 저농도

(15 ng/ml),

^중농도

(400 ng/ml),

고농도

(1600 ng/ml)

에해당하는각각

3

개의시료를모든전처리

과정을거친다음

,

^{자동시료주입기안에서}

, 4

^o

C, 24

^{시간보관후}

독시플루리딘과

5-FU

^{의안정성을확인하였다}

.

^그결과

, Table IV

에서알수있듯이

,

간조직및장관조직모두

,

시료전처리후 정해진조건에서독시플루리딘과

5-FU

^{모두안정함을알수있}

었다

.

이전연구로혈액중독시플루리딘과

5-FU

의분석에서본저 자등은커다란극성차이를가진독시플루리딘과

5-FU

^를동시

에혈액으로부터추출할수있도록에틸아세테이트와이소프로 필알콜의조합에의한액상

-

액상추출법을개발하였다

.

하지만

,

본방법을간조직과장관조직시료전처리에적용하였을경우

,

효과적인추출효율을얻기어려웠고

,

조직의경우

,

혈중농도보 다미량의매우낮은농도가예상되므로

,

이전에개발했던액상

-

액상추출법을적용하기어려웠다

.

^그러므로

,

^{보다효율이좋은}

방법을개발하고자

,

유기용매에의한단백질침전법을사용하였 다

.

사용한용매는메탄올

,

아세토니트릴을비교한결과

,

메탄올 보다는조직의경우

,

^{아세토니트릴을사용했을때좋은분석결}

과를얻을수있었다

.

또한

, 96-well filter plate

를사용함으로써 신속하고효과적으로여러개의시료를분석할수있는방법을 개발하였다

.

조직안정성평가

(stability test)

간조직 − 독시플루리딘은세포에서

Fig. 3

^과같이

5-FU

^로대

사되어약효활성을나타낸다

.

그러므로

,

간조직세포에서도생 체내에서의대사의진행을예상할수있다

.

본연구에서는간

조직생체시료중독시플루리딘과

5-FU

^{두가지분석물질의농}

도분석법을확립하는과정에서매우흥미로운사실을발견하였 다

.

공시료로확보한간조직시료에독시플루리딘을첨가하여 표준시료를제조하는과정에서첨가한독시플루리딘이급격히

손실되어사라지는현상을확인할수있었다

.

^이것은

thymidine

phophorylase

에의해원숭이의간조직공시료에독시플루리딘

을첨가하는경우

,

^{에너지의공급없이자발적으로}

5-FU

^로의대

사가진행됨을예상할수있었고

,

^{이러한사실은본연구에서입}

증이되었다

.

본연구에서는간조직및장관조직의공시료에독시플루리

딘과

5-FU

^{를단독으로주가하여독시플루리딘의손실양과대사}

에의해생성되는

5-FU

의양을측정하였으며

,

또한

5-FU

의변

화의유무도측정하였다

.

^{대사의온도에따른영향을측정하기}

위해서

, ice-bath,

^실온

, 37

^o

C

^{의세가지온도조건에서}

, 0

^에서

4

시간동안

1

시간간격으로시간에따른농도변화를분석하였다

.

또한원숭이간조직시료를이용하여표준시료를제조하기 어렵기때문에대체할수있는비글견간조직시료를확보하였 고

,

원숭이간조직에서의안정성 평가와동일한평가를거쳐

validation

^{용간조직시료로사용할수있는지확인하였다}

.

^실험

결과로는

ice bath

^{상에서도독시플루리딘이대사되어}

5-FU

^로대

사됨을알수있었고

,

대사는원숭이간조직과비글견간조직 에따라그속도가현저히다름을알수있었다

.

원숭이와비글견을비교한결과

,

원숭이의경우에는

Fig. 4(a)

및

(b)

에서볼수있듯이

, ice bath

상에서

1

시간후에절반가량이

5-FU

^{로변환되어소실되는것을알수있었다}

.

^실온과

37

^o

C

^에서

는

1

시간안에모든양이소실되었다

.

대부분이

5-fluorouracil

로

변화되는것을확인할수있었고

,

약

10%

정도는다른대사체로

손실되었다

.

^종

(species)

^{이다른비글견에서의독시플루리딘의대}

사는

Fig. 4(c)

및

(d)

에서알수있듯이

,

독시플루리딘을간조

직공시료에첨가하였을때

,

원숭이와는달리

, ice bath

위에서는 대사가진행되지않음을확인할수있었고

,

^실온이나

37

^o

C

^에서

는마찬가지로급격하게독시플루리딘이소실되는것을확인하였 고

,

^{그속도는원숭이에비해서현저히느리다는것을알수있었}

다

.

^{또한원숭이간조직에서는소실되는대부분의독시플루리딘}

이

5-FU

로대사되는반면

,

비글견간조직에서는손실되는양의

일부분만이

5-FU

로대사된다는차이를발견할수있었다

.

Table IV −

Postpreparative stability of doxifluridine and 5-FU for 24 hr at 4

^o

C (n=3)

Relative concentration (%) Doxifluridine (ng/ml) 5-FU (ng/ml)

15 400 1600 15 400 1600

Liver 95.1 103.6 100.9 111.3 100.4 96.4

Intestine 95.9 111.5 093.0 103.4 106.4 97.8

_{Fig. 3 −}

Metabolism of doxifluridine into 5-FU.

원숭이간조직에첨가한

5-FU

는

Fig. 5

에서볼수있듯이

, 1

시간동안은온도나시간에관계없이다른형태로소실되거나대 사되지않는다는것도확인하였고

, 2

시간이후로는점점그농 도가낮아짐을알수있었다

.

^{그속도는온도가높은조건일수록}

빨리소실됨을확인할수있었다

.

^{또한소실되는}

5-FU

^가

prodrug

의형태인독시플루리딘으로는변환하지않는것도확인하였다

.

또한

, 5-FU

^{는비글견간조직에서}

,

^{위와실험과동일하게세}

가지온도

, ice, RT, 37

^o

C

^에서

, 0~4

^{시간동안확인하였을때}

, Fig.

5(b)

에서알수있듯이

,

비글견의경우는

, 5-FU

의소실이나타나

지않았다

.

이러한이유로본실험에서는

,

^{분석법확립과}

validation

^을위

하여독시플루리딘과

5-FU

두가지경우모두비글견간조직

을이용하여공시료로이용하고

,

^{온도조건은}

ice bath

^상에서분

석을진행하기로결정하였다

.

장관조직 − 장관조직에서도간조직에서의독시플루리딘및

5-FU

^{안정성연구를수행하였다}

.

^{간조직에서와마찬가지로장}

관조직생체시료내에서독시플루리딘과

5-FU

단독으로넣었 을때

,

^{소실되는독시플루리딘과생겨나는}

5-FU

^를

0~4

^시간동

안

, 1

시간간격으로

, ice, RT, 37

^o

C

에서각각분석하였다

.

장관 조직에서도

,

^{원숭이의경우}

, ice bath

^{상에서독시플루리딘이대}

사되어다음과같이

5-FU

^{로변환된다는사실을발견하였다}

.

이러한대사의진행은간에서와같이급격히진행하지는않았

다

. Fig. 6(a)

^{에서원숭이장관조직공시료는독시플루리딘을첨}

가하는경우

,

^{간과양상은비슷하지만}

,

^{간에서처럼}

,

^{분석물질을}

첨가하자마자대사가급속히진행되지는않는다는사실을알수

있었다

. Ice bath

^{상에서는약}

3

^{시간후절반으로감소하는것을}

알수있었다

.

^{간에서는약}

1

^{시간만에절반의농도로손실되는}

것과비교하였을때

,

장관에서의대사속도가약

3

배정도느리 다는것을알수있었다

.

^{또한실온이나}

, 37

^o

C

^{에서는첨가한독}

시플루리딘이급격히소실되었고

,

일부는

5-fluorouracil

로대사

됨을

Fig. 6(b)

에서알수있었다

.

간조직과장관조직과의다른

양상은

,

^{간에서는소실된독시플루리딘의대부분이}

5-FU

^로대사

Fig. 4 −

(a) Time profiling of doxifluridine on ice, at 20

^o

C, and at 37

^o

C for 4 hr in monkey liver tissue (b) Doxifluridine loss into 5-FU on ice,

at 20

^o

C, and at 37

^o

C for 4 hr in monkey liver tissue (c) Time profiling of doxifluridine on ice, at 20

^o

C, and at 37

^o

C for 4 hr in beagle

dog liver tissue (d) Doxifluridine loss into 5-FU on ice, at 20

^o

C, and at 37

^o

C for 4 hr in beagle dog liver tissue.

되는반면

,

장관에서는단지

20~30%

만이

5-FU

로전환됨을알 수있었다

.

또한

, 5-FU

^{는위의실험과동일하게실험을수행하였다}

.

^세가

지온도

, ice, RT, 37

^o

C

의경우

, 0~4

시간동안장관조직공시

료에서단독으로

5-FU

^{를첨가하여농도변화를관찰하였다}

.

^그

결과

,

^{원숭이장관조직에서}

, ice, RT, 37

^o

C

^{의조건에있는시료}

,

시간이지나도모두안정한것을

Fig. 7

처럼확인할수있었다

.

본실험결과를바탕으로

,

^{장관조직에서독시플루리딘및}

5-

FU

분석법개발은원숭이장관조직공시료를그대로이용하였

고

,

가능한한모든시료의전처리는

ice bath

상에서수행하였고

,

최대한시료전처리시간을단축하면서

,

^{독시플루리딘을시료에}

첨가하자마자곧바로전처리과정이수행될수있도록하였다

.

그결과

,

원숭이조직을그대로사용하여도양호한

validation

결 과를얻을수있었다

.

실제본분석법을바탕으로약물동태및독성동태연구를위 한실제생체시료분석시에는해동과정에서독시플루리딘의 대사가진행될수있으므로

,

대사의진행을차단할수있는전처 리법또는생체시료수집후즉각적인분석실험진행이요구된다

.

결 론

본연구에서는

LC/MS/MS

를이용하여

,

간조직및장관조직 중의독시플루리딘과대사체인

5-FU

의분석법을확립하였으며

,

분석의검증을위하여선택성

,

^직선성

,

^정확성

,

^및정밀성

,

^시료

전처리후안정성을검토한결과

,

모두양호한결과를나타내었 다

.

이분석법은기존의분석법에비해간단한전처리과정을통 해극성의차이가나타나는독시플루리딘과대사체인

5-FU

^를동

Fig. 5 −

(a) Time profiling of 5-FU on ice, at 20

^o

C, and at 37

^o

C for 4 hr in monkey liver tissue, (b) Time profiling of 5-FU on ice, at 20

^o

C, and at 37

^o

C for 4 hr in beagle dog liver tissue.

Fig. 6 −

(a) Time profiling of doxifluridine on ice, at 20

^o

C, and at

37

^o

C for 4 hr in monkey intestine tissue (b) Doxifluridine

loss into 5-FU on ice, at 20

^o

C, and at 37

^o

C for 4 hr in

monkey intestine tissue.

시에분석할수있도록하였고

,

^{적절한시료를분석하는}

LC/MS/

MS

^{분석소요시간도}

5

^{분이내로단축시켰다}

.

^{또한확립한분석}

법의검증을통해분석의강건성을시사하였다

.

본연구에서확 립된방법은간조직및장관조직중의독시플루리딘및대사

체인

5-FU

를간단하고신속하게선택적으로확인하는데유용하

게사용될수있어

,

원숭이를이용한독시플루리딘독성동태연 구및약물의조직분포연구등에기여할수있을것으로기대 된다

.

또한본연구에서는일반적인대사와는특이하게

,

간조직및

장관조직에서

ice bath

^{상에서도자발적으로대사되는독시플루}

리딘과

5-FU

의특성을발견하였으며

,

이러한연구결과는실제

생체시료분석시주의해야할점과한계를분명히제시하였고

,

추가적인실험을통해대사를저해할수있는전처리개발법등 을통해실온에서도분석할수있는방법연구의동기를부여하 였다

.

또한

,

본독시플루리딘의대사결과는지금까지발표된적 이없는연구결과로서추가적인대사연구를통해좀더구체 적인대사체및대사양상에대한연구의도출이기대된다

.

감사의 말

본연구는식품의약품안전청국립독성연구원의

2006

^년용역

과제

(06132

^독성평

423)

^{에의해지원되었습니다}

.

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Fig. 7 −

Time profiling of 5-FU on ice, at 20

^o

C, and at 37

^o

C for 4 hr

in monkey intestine tissue.