Isolation and Identification of Halotolerant Bacillus sp. SJ-10 and Characterization of Its Extracellular Protease

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세포외 Protease를 생산하는 내염성 Bacillus sp. SJ-10 균주의 분리 동정 및 효소 특성

김은영¹·김동균¹·김유리¹·최선영²·공인수¹*

1부경대학교 생물공학과, ²국군화생방방호사령부 화학방어 연구소 생물분석과

오징어 젓갈로부터 호염성 균주를 분리하여 형태적 , 생리·생화학적 특성 및 분자계통학적 분석을 통하여 동정

하였고 , 이 균주가 세포외로 생산하는 호염성 protease 를 정제하여 그 특성을 분석하였다 . 본 균주는 NaCl

0~14%, 20~55

C 및 pH 5~8 에서 성장하였으며 , 35

5

C, pH 7 및 5% NaCl 에서 최적으로 성장하였다 . 주요 지방산 조성은 anteiso-C

(44.70%), anteiso-C

(15.76%) 및 C

(13.91%) 이었고 , menaquinone 은 MK-7 이었으며 , DNA G+C 함량은 50.58 mol% 였다 . 16S rRNA 유전자 염기서열을 통한 계통분석 결과 Bacillus이었으며 Bacillus

sp. SJ-10 으로 명명하였다 . SJ-10 균주 배양액으로부터 40% 황산암모늄 침전과 Mono Q 컬럼크로마토그래피 과 정을 거쳐 collagen 과 gelatin 을 특이적으로 분해하는 약 40 kDa 의 세포외 protease 를 정제하였다 . 이 효소는

35

5

C, NaCl 5

1% 및 pH 8 에서 최적 활성을 나타냈으며 , pH 5~10 범위에서 안정하였다 . Key words □ Bacillus sp., collagen degrading enzyme, halophilic bacteria

젓갈은 어패류 , 어패류의 알 또는 내장 등을 소금에 절여 발효 시킨 한국 전통 음식으로서 (13) 염장으로 인한 짠맛과 재료 고유 의 맛 , 그리고 내부에 존재하는 미생물이 생산하는 protease 와 재 료 사이의 상호작용에 의해 생산된 성분들로 인하여 특유의 풍

미가 있다 (3). 젓갈은 음식의 맛을 내기 위한 조미료와 같은 용

도로 이용되지만 젓갈 내부에 존재하는 다양한 미생물 또는 미 생물의 대사산물 때문에 다른 음식에 첨가하거나 그 자체로도

섭취되며 (7), ^{이러한 젓갈 발효에 관여하는 미생물이 생산하는}

protease 는 식품산업에서 광범위하게 응용되고 있다 (6). 젓갈에

존재하는 미생물은 대부분 높은 NaCl 농도에서도 성장이 가능한

내염 또는 호염성균이므로 다양한 산업 분야에 적용하기 위한 호염성 미생물의 분리 및 이들 미생물이 생산하는 호염성 효소 의 생화학적 특성에 관한 연구가 다수 보고되고 있다 (8).

염장 산업에서의 protease 를 생성하는 호염성 미생물은 염장식 품의 풍미를 증가시키고 숙성 기간을 단축시키기 위한 starter ^로

서 중요하다 . 또한 protease 에 의한 분해산물이 풍미를 증진시킬

뿐만 아니라 여러 가지의 생리활성이 있음이 밝혀짐에 따라 다 양한 분야에서 protease 의 활용을 위한 연구가 진행되고 있다 (2).

염장식품을 위한 미생물은 고염농도 뿐만 아니라 다양한 온도 범위 및 산성 또는 염기성 조건에서도 생장이 가능하며 강력한

protease 활성을 지닌 것이 보다 이용 가능성이 높다 .

한편 , 호염성 미생물 또는 이들 미생물이 생산하는 protease 는

염장식품 뿐만 아니라 수산어류의 껍질을 응용한 산업에서도 널

리 사용되어 (18) 호염성 protease 를 이용하여 어류의 외피에서

collagen 의 분해산물 또는 gelatin 을 얻을 수 있으며 어폐류 폐기 물을 처리하는 산업에 있어서도 이러한 protease 또는 protease 를 생산하는 미생물을 이용하는 방법이 강구되고 있다 .

따라서 , ^{본 연구에서는 오징어 젓갈로부터 강력한} protease ^를

생산하는 호염성 미생물을 분리하여 형태학적 , 생리·생화학적 및 분자계통학적 방법을 이용하여 동정하였으며 이 균주가 생산하 는 protease 를 분리·정제하여 그 특성을 파악하였다 .

재료 및 방법

분리원은 부산지역에서 시판되고 있는 오징어 젓갈을 사용하 였다 . 오징어 젓갈로부터 고형성분을 거른 다음 , 10% NaCl 을 첨 가한 marine agar (Difco, USA) 에 도말하여 37

C 에서 16 시간 동 안 배양한 후 생성된 colony ^를 skim milk (1%) ^또는 gelatin (0.5%) 과 NaCl (5%) 이 포함된 marine agar 에서 동일한 조건으로 배양한 다음 콜로니 주변에 투명환을 형성하는 균을 선별하였다 .

선발된 균주는 다시 marine broth 에 옮겨 37

C 에서 16 시간 동안 액체 배양하였으며 , ^배양액 150~200 ^µ l ^{를 구멍 낸} gelatin (0.5%)

과 NaCl (5%) 이 함유된 agar 배지에서 동일조건으로 배양하였다 .

최종 선별된 균은 구멍 주변의 투명환을 관찰하여 가장 큰 활성 을 가지는 균으로 하였다 . 분리된 균은 동정 후 한국미생물보존 센터 (KCCM 90078) 및 일본미생물보존센터 (JCM 15709) 에 기탁 하였다 .

분리균의 배양 조건

변형된 marine 배지인 HM 배지 (NaCl 5%, yeast extract 1%,

*To whom correspondence should be addressed.

Tel: 82-51-629-5865, Fax: 82-51-629-5863

E-mail: [email protected]

분석 , G+C 함량 , 세포벽 지방산 성분분석 및 quinone 분석 등을 통하여 동정하였다 . ^{세포벽 지방산 성분분석은} Miller (12) ^{의 방}

법에 따라 시행하였으며 , quinone 분석은 Kroppenstedt (10) 의 방 법을 이용하였고 , G+C 함량은 Tamaoka 등 (16) 의 방법에 따라 결정하였다 . 16S rRNA 염기서열을 결정하기 위하여는 일반적 방법에 따라 정제된 DNA 를 주형으로 하여 PCR 로 증폭하여 분 석하였다 . PCR 를 위한 primer 는 27F (5 ’ -AGAGTTTGATCMT GGCTCAG-3 ’ ) 와 1492R (5 ’ -TACGGYTACCTTGTTACGACTT- 3 ’ ) 을 사용하였고 , 94

C 에서 45 초 , 55

C 에서 60 초 , 72

C 에서 60

초로 이루어진 과정을 35 회 반복하여 수행하였다 . 증폭된 DNA

단편을 Big Dye Terminator Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems, USA) 로 정제한 다음 , DNA sequencer (Applied Biosystems model 3730XL, USA) ^{를 이용하여 염기서열을 결정}

하였다 . 결정된 염기서열을 NCBI 의 GenBank database 및

Ribosomal Database Project (http://rdp.cme.msu.edu) ^{를 이용해 상}

동성을 조사하였다 . 또한 이를 바탕으로 BioEdit 및 MEGA 4.1

을 이용하여 neighbor-joining 법으로 phylogenetic tree 를 작성하였 다 . Neighbour-joining 법 외에도 maximum-parsimony 법과 maxi mum-likelihood 법에 따른 phylogenetic tree 를 작성하여 유사한 결과를 얻었다 .

효소의 분리 및 정제

선발균이 생산하는 protease 분리를 위해 균을 최적배지조건

하의 37

C ^에서 24 ^{시간 동안 배양한 후 원심분리} (4,500 rpm, 15 min, 4

C) 하여 상등액을 회수한 다음 상등액을 10% 황산암모 늄으로 포화시켜 단백질을 침전시킨 후 얻어낸 2 ^{차 상등액에} 40% 황산암모늄으로 포화시켜 단백질을 침전시킨 다음 원심분리

(15,000 rpm, 45 min, 4

C) 하여 얻은 침전물을 20 mM Tris-HCl (pH 8.0) 에 녹여 , 4

C 에서 하루 동안 투석한 후 Mono-Q 컬럼크 로마토그래피를 이용한 HPLC 로 정제한 뒤 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) 로 정제도 를 확인하였다 . 또한 silver staining 을 통해 순수분리 여부를 확 인하였다 . Gel ^{상에서 효소활성을 확인하기 위하여} 0.5% gelatin

이 함유된 acrylamide gel 을 4

C 에서 SDS-PAGE 한 후 세척완 충용액 (20 mM Tris-HCl; pH 8.0, 2.5% Triton X-100, 10 mM NaCl) 에 1 시간 , 배양완충용액 (20 mM Tris-HCl; pH 8.0, 10 mM CaCl

, 0.02% NaN

) ^에 16 ^{시간 반응시킨 후} Coomassie blue ^염

색용액으로 염색한 뒤 탈색용액을 처리하여 zymogram 분석을 실시하였다 (17).

생성되는 1 µ M 의 leucine 양을 1 unit 으로 정의하였다 .

온도에 따른 효소활성 측정

Protease 활성에 미치는 온도의 영향을 검토하기 위해 정제 효

소액 100 µ l 에 0.2% gelatin 용액 300 µ l 와 반응완충용액 200 µ l

를 넣어 효소반응온도를 10

C~60

C 범위에서 10

C 간격으로 하 여 1 시간 반응시켜 상대활성으로 표시하였다 . 또한 효소의 열 안 정성을 측정하기 위하여 각각의 온도에서 효소액과 반응완충액 을 1 시간 동안 10

C~60

C 범위에서 각각 정치시킨 후 37

C 에서

1 시간 동안 0.2% gelatin 과 반응시켜 효소의 잔존활성도를 측정

하였다 . ^{상대활성의 기준은 가장 높은 활성을 가지는 온도의 활}

성을 100% 로 하였다 .

pH에 따른 효소활성 측정

Protease ^{활성에 미치는} pH ^{의 영향을 검토하기 위해 정제 효}

소액 100 µ l 와 0.2% gelatin 용액 300 µ l 에 각각 pH 의 범위를

4~10 으로 다르게 한 반응완충용액 200 µ l 를 넣어 37

C 에서 1 시 간 반응시켜 활성을 측정하였다 . pH 안정성은 효소액과 pH 를 다르게 한 각각의 반응완충용액을 37

C 에서 1 시간 동안 정치시 킨 후 0.2% gelatin 과 37

C 에서 1 시간 동안 반응시켜 효소의 잔 존활성도를 측정하였다 . 결과 값은 효소가 가장 높은 활성을 보 이는 pH ^{의 활성을} 100% ^{로 하여 상대활성으로 나타내었다} .

NaCl의 농도에 따른 효소활성 측정

Protease 활성에 미치는 NaCl 농도의 영향을 검토하기 위해 반 응완충용액에 NaCl ^를 0%~16% ^{까지 첨가하여 효소액 및} gelatin

과 혼합하여 37

C 에서 1 시간 반응시켜 효소의 활성을 측정하였 다 . 또한 NaCl 에 대한 안정성을 측정하고자 0%~16% 의 농도에 따라 NaCl 을 첨가한 반응완충용액과 효소를 37

C 에서 1 시간 동 안 정치시킨 후 기질을 첨가하여 효소의 잔존활성을 측정하였다 .

상대활성은 가장 높은 활성을 가지는 NaCl 농도의 활성을 100%

로 하여 백분율로 나타내었다 .

기질에 따른 효소활성 측정

기질에 대한 protease ^{활성을 검토하기 위해 효소반응액에}

0.2% gelatin 용액 대신 azocasein, β -casein, Z-GPLGP, Z- GPGGPA, collagen (type I, II, III, V) ^및 gelatin ^{을 각각} 1 mg/

ml 의 농도로 첨가하여 각 기질에 대한 효소의 활성을 측정하였

다 . Gelatin 을 기준으로 하여 각 기질의 상대활성을 백분율로 나

타내었다 .

결과 및 고찰

본 연구에서는 호염성 미생물을 분리하기 위하여 젓갈로부터

0.5% gelatin 이 함유된 평판배지 상에서 투명환의 크기를 통해

gelatin ^{분해능이 우수한} SJ-10 ^{균주를 분리하였다} (Fig. 1). ^분리

균은 그람양성의 간균으로 포자를 형성하고 , 운동성을 지니고 있

는 등 전형적인 Bacillus 속 균주의 형태학적 특징을 지니고 있

었다 (Fig. 2). 또한 menaquinone 은 seven isoprene units (MK-7) Fig. 1. The protease activities of strain SJ-10 on 1.2% agar plate

containing 0.5% gelatin. The isolated SJ-10 was cultured at 37

C for 16 h. The control was marine broth. The amount of dropped sample was 150 µ l.

Fig. 2. Transmission electron microscope showing the morphology of cell, SJ-10, incubated for 16 h on HM medium at 37

C. Bar means 200 nm.

Fig. 3. Phylogenetic location of the strain SJ-10 based on 16S rRNA gene sequences. The tree was constructed by neighbor-joining method.

Numbers at nodes are bootstrap percentage based on 1,000 resampled datasets. GenBank accession numbers are given in parentheses. Bar, 0.005

changes per nucleotide.

판단하였으며 , 16S rRNA 염기서열 (GenBank/EMBL/DDBJ accession number : FJ185224) ^{분석을 통해서도} Bacillus 속 균주

임을 확인할 수 있었다 . 또한 분리균은 16S rRNA 염기서열의

상동성 조사 결과 B. velezensis , B. substilis , B. amyloliquefaciens

등과 99% 이상의 유사도를 보였으며 phylogenetic tree 작성 결 과 B. velezensis 와 가장 가까웠다 (Fig. 3). B. velezensis 의 경우

menaquinone 은 MK-7 으로 분리균과 동일하였으며 DNA G+C 함

량은 약 46 mol% 로 분리균에 비해 낮은 수치를 보였다 . 주요한

세포벽 지방산 성분의 경우 anteiso-C

(32.70%), iso-C

(29.86%), C

(13.41%) 으로 보고되었으며 이는 분리균과 같은

FA-type2 ^{이나 분리균에 비해} iso-C

의 함량이 높고 anteiso-C

의 함량은 낮은 차이를 보였다 (5).

분리균의 protease ^{생산을 위한 최적 배양 조건을 규명하기 위}

해 NaCl 농도 , 온도 , pH 등의 조건을 달리하여 배양한 결과 , NaCl ^농도는 0~14%, ^온도는 20~55

C ^그리고 pH ^는 5~8 ^범위에

서 성장하였으며 35

5

C, pH 7, 5% NaCl 에서 가장 좋은 성장 을 보였다 . 이미 동정된 B. velezensis 의 경우 NaCl 농도 (0%~

12%) 및 온도 (15

C~45

C) 는 분리균보다 낮은 성장범위를 가졌으 며 , pH (5~10) 는 더 넓은 성장범위를 보여 , 분리균과는 다소 차 이가 있음을 알 수 있었다 .

효소의 정제

균체를 제거한 배양상등액을 40% 황산암모늄으로 포화시켜 침전시킨 후 원심분리하여 얻어낸 침전물을 20 mM Tris-HCl (pH 8.0) 에 녹여 , 4

C 에서 하루 동안 투석하였으며 Mono-Q 컬 럼크로마토그래피를 이용하여 HPLC ^{로 정제한 결과} , ^비활성 2,100 U/mg protein, 수율 0.58%, 정제배수 2.8 배로 효소를 정제 하였다 (Table 1).

정제한 효소의 SDS-PAGE 분석 결과 분자량은 약 40 kDa 이

었다 . 기존에 보고된 collagenolytic protease 생산균주

Clostridium histolyticum (116 kDa), Vibrio alginolyticus (82 kDa), Geobacillus collagenovorans (105 kDa), B. cereus (105 kDa),

Streptococcus gordnii (98 kDa) 등이 큰 분자량을 가지는 반면 본 연구에서 정제한 효소의 경우는 Alicyclobacillus sendaiensis (37 kDa), Porphyromonas gingivalis (37.8 kDa) 에서 분리된

collagenolytic protease 와 비슷한 분자량을 보였다 (17). Zymogram

분석 결과 또한 약 40 kDa 에서 gelatin 이 분해되어 coomassiae blue 용액이 탈색된 모습을 보였다 (Fig. 4).

효소활성 최적 조건 및 기질 특이성

분리정제된 효소는 35

5

C, pH 5~10, NaCl 0%~10% ^{에서 높}

은 활성을 나타냈으며 , 안정성의 경우 온도 40

C, pH 8, NaCl 8% ^{에서 가장 높았으나 그 이상의 조건에서는 감소하였다} (Fig. 5).

일반적으로 collagen 분해효소의 최적 활성 온도는 30

C~37

C 로 보고되고 있는데 본 연구에서의 결과도 유사하게 나타났으며

(14), pH 4~5 의 경우 효소의 pH 안정성이 pH 8 의 활성에 대하

여 30%~60% 수준의 잔존활성을 보였으며 pH 에 대한 활성 또

한 60% 정도였다 . pH 5~10 까지 비교적 넓은 범위에서 높은 효

소 활성과 안정성을 보였으며 pH 8 에서 활성과 안정성 모두 가

장 높은 값을 나타냈는데 이러한 결과는 최적 성장 조건과 최대 효소 생산 범위가 유사하다는 보고와 일치하였다 (11).

현재까지 보고된 collagen ^{분해 효소의 경우 최적 활성 조건은}

대부분 pH 7.5, 37

C 이었다 (1). 그러나 본 연구에서 분리한

protease ^{의 경우} pH 8, 35

5

C ^{로 다른 큰 차이를 보이지 않았지}

만 , 온도 (10

C~60

C) 와 pH (4~10) 범위에서 활성 차이가 크지

Table 1. Purification steps of protease produced by Bacillus sp. SJ-10

Steps Total protein (mg) Total activity (U

) Specific activity (U

/mg) Yield (%) Purification (fold)

Culture supernatant 48 36,250 755 100 1

40% Ammonium sulfate 0.16 271 1,700 0.75 2.3

Mono Q ion exchange 0.10 210 2,100 0.58 2.8

a

One unit was defined as the amount of 1 µ M leucine released

Fig. 4. Polyacrylamide electrophoresis and zymogram of the purified

protease. Lanes: M, Molecular markers; A, 12% SDS-PAGE followed

by Coomassie staining; B, 12% SDS-PAGE (containing 0.5% gelatin)

by zymogram; C, 12% SDS-PAGE followed by silver staining.

않고 안정성이 높았으며 , 14% NaCl ^{에서도 활성이 높은 점 등에}

서 차이를 보였다 . 이러한 분리 효소의 특성은 기존에 보고된

collagen ^{분해 효소와 비교해 볼 때} NaCl ^농도 , ^{온도 및} pH ^등

이 다변적인 환경에의 이용에 유리할 것으로 보인다 . 또한 기질

에 따른 효소의 활성을 측정한 결과 gelatin ^{을 기질로 한 효소의}

활성을 100% 으로 하였을 때 azocasein, β -casein 이 각각 29% 와

21% ^{을 나타내 효소활성이} 70% ^{이상 감소하는 것으로 나타났으}

며 gelatin 에 대한 높은 특이성을 보여주었다 . 또한 collagen type II (102%) 와 type III (99%) 효소의 활성이 gelatin 과 유사하게 높은 것으로 나타났다 (Table 2).

다양한 환경에서 분리된 Bacillus 는 여러 가지 산업용 단백질

분해 효소를 생산하며 , 빠른 성장 속도 및 다양한 기능성 물질을 생산하는 유용한 미생물로 사용된다 (4, 9, 15). Bacillus 가 생산하

Fig. 5. The activity and stability of purified enzyme. Effect of temperature on enzyme activity (A) and stability (B); Effect of pH on enzyme activity (C) and stability (D); Effect of NaCl concentration on enzyme activity (E) and stability (F).

Table 2. Substrate specificity of enzyme

Substrate Specific activity (U

/mg) Relative activity (%)

Azocasein 30 29

β -Casein 22 21

Z-GPLGP 48 46

Z-GPGGPA 79 75

Collagen type I 62 59

Collagen type II 107 102

Collagen type III 104 99

Collagen type V 72 69

Control (gelatin) 105 100

a

One unit was defined as the amount of 1 µ M leucine released

타나 수산어류의 껍질 등에 풍부하게 존재하는 collagen 을 이용 하는 분야에 매우 효과적으로 사용될 수 있을 것으로 기대된다 .

한편 , SJ-10 균주의 protease 를 이용한 각종 collagen, gelatin 또 는 이러한 단백질 분해산물은 다양한 식품공업에 적용이 유리하 며 , 당뇨병 , 고혈압 완화 및 화장품의 기능성 향상 등에도 응용 될 수 있을 것으로 기대된다 .

감사의 말

이 논문은 2007 년 정부 ( 교육인적자원부 ) 의 재원으로 한국학술

진흥재단의 지원을 받아 수행된 연구임 (KRF-2007-521-C00305).

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(Received April 27, 2009/Accepted June 16, 2009)

ABSTRACT : Isolation and Identification of Halotolerant

sp. SJ-10 and Characterization of Its Extracellular Protease

Eun-Young Kim

, Dong-Gyun Kim

, Yu-Ri Kim

, Sun-young Choi

, and In-Soo Kong

* (

Department of Biotechnology, Pukyong National University, Busan 608-737, Republic of Korea,

Department of Biological Analysis, Chemical Defense Research Institute, Seoul 137-180, Republic of Korea)

A bacterium producing the halotolerant extracellular protease was isolated from squid jeotgal, and was iden- tified as

sp. SJ-10 based on morphological, physiological and biochemical characteristics, as well as phylogenetic analysis using 16S rRNA gene sequence. The strain grew at 20

C~55

C, pH 5~8, and 0%~14%

NaCl and optimal growth conditions were 35

5

C, pH 7, and 5% NaCl. The major cellular fatty acids were anteiso-C

, anteiso-C

, and C

. DNA G+C content was 50.58 mol% and menaquinone consisted of MK-7.

Phylogenic analysis based on the 16S rRNA gene sequence indicated that SJ-10T belongs to the genus

.

About 40 kDa of the salt-tolerant protease was purified by 40% ammonium sulfate saturation and Mono Q col-

umn chromatography. The optimal activity of the protease was pH 8 and stable at pH 5~10. The optimum tem-

perature and NaCl concentration were 35

5

C and 5

1%, respectively.