[특별기획] 글라이코믹스 연구를 위한 탄수화물칩

특·별·기·획 (Ⅳ)

NEWS & INFORMATION FOR CHEMICAL ENGINEERS, Vol. 23, No. 3, 2005…

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어레이는 streptavidin-biotin 시스템을 이용한 정량 분석이 가능하다.

현재 프로테옴 관련 연구에서 고속 스크리닝 칩에 대한 제작 수요는 계속 늘어나는 추세에 있다. 특히

키나아제, 프로테아제 등 효소는 질 병에 직간접적으로 작용하기 때문에 보다 신속하고 편리한 펩타이드 마 이크로어레이 제작에 대한 연구 또 한 중요시되고 있다. 본 그룹에서의 최종 연구 목표는 칩 표면에서 직접 적으로 펩타이드와 같은 리간드 라 이브라리를 합성하고 단백질과의 작 용에서 그 성능을 확인하는데 있다. 특히, 기존의 단백 질칩 제작 방법으로는 불가능했던 보다 고집적화된 고효율의 펩타이드 라이브러리가 칩 상에서 구축되면 향후 질병진단 및 신약개발에 그 파급효과가 클 것으 로 예상된다.

21세기 후게놈 시대에 있어서 복합당질의 생물학적 기능 연구(글라이코믹스 연구)는 생명현상 규명 및 신약개발의 중요성 때문에 생명과학자들에게 많은 관 심을 받아왔다. 일반적으로 세포표면의 복합당질은 단백질과의 상호작용을 통하여 세포의 수정, 발생, 분 화, 성장 및 노화와 같은 생물학적으로 중요한 과정에 관여하는 것으로 알려져 있다. 또한, 이들 복합당질은 단백질과의 결합을 통하여 독소, 박테리아 또는 바이 러스가 세포를 감염시키는 과정에도 관련이 있고, 염 증 유발, 암전이 등에도 관련이 있는 것으로 알려져 있 다. 따라서 단백질과 탄수화물 사이의 상호작용 연구 는 생명현상 규명 및 병인 규명이라는 기초과학 측면 뿐만 아니라, 항암제, 항바이러스제, 항염증제 개발에 도 도움을 주며, 또한 질병진단법 개발에도 중요하다.

이들 상호작용에 대한 최근까지의 연구는 X-선 결 정법, NMR 분광기, SPR, ITC 등 다양한 분석기기를

이용하거나 또는 생화학적 방법을 주로 이용하였다.

그러나 이 방법들은 단백질과 탄수화물 사이의 상호 작용을 고속으로 분석하기에는 적합하지 않다. 따라 서, 많은 수의 적은 양의 샘플을 빠른 시간에 단백질

그림 5. Peptide Array Synthesis by Using MMA System and Protein Binding

Assay.

신 인 재

연세대학교 화학과, [email protected]

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과 탄수화물 사이의 상호작용을 고속으로 조사할 수 있는 새로운 기술 개발이 필요하다.

지난 10여년 동안 마이크로어레이를 이용한 기술은 생체분자의 생물학적 기능을 고속으로 분석하는데 많 이 이용되어져 왔다[그림 1]. 예를 들면, DNA칩은 고속 유전자 변이 분석, 정상상태와 질병상태에서의 유전자 발현 차이 분석 및 많은 유전자의 활성을 동시 에 분석하는데 이용되어왔다. 또 다른 바이오칩인 단 백질칩은 고속 단백질-단백질 상호작용 분석, 정상상 태와 질병상태에서의 단백질 발현 차이 분석에 이용되 었다. 이런 마이크로어레이 기술이 유전체(genomics), 전사체(transcriptomics) 및 단백질체(proteomics) 연구에 이용되는 것처럼 탄수화물칩은 글라이코믹스 연구에 이용될 수 있다. 이 때문에 최근 몇 년간 탄수 화물칩 제작 및 응용에 대한 많은 연구가 수행되었다.

본 고에서는 지난 몇 년간 개발된 탄수화물칩의 제작 및 응용에 대해 간단히 소개하고자 한다.

탄수화물칩 제작 방법

탄수화물칩 제작에 있어서 가장 중요한 것 중 하나 는 효과적이며 선택적인 탄수화물의 고정화 방법 개 발이다. 지금까지 크게 3가지 방법–비특이적이며 비 공유결합 방식으로 탄수화물 고정, 위치 선택적이며 비공유결합 방식으로 고정, 위치 선택적이며 공유결 합 방식으로 고정–을 이용하여 탄수화물을 고체기판 에 고정시켰다. 이중에서 특이적이며 공유결합 방식

으로 고정시키는 방법이 탄수화물칩 제작에 가장 널 리 이용되고 있다.

첫째, 비변형 탄수화물(unmodified carbohydrates) 을 비변형 고체기질(underivatized solid surface)에 비특이적이며 비공유결합 방식으로 고정시켜 탄수화 물칩을 제작하였다. 이 방법은 고체기질을 변형시킬 필요도 없고, 또한 탄수화물에 적당한 링커를 붙일 필 요가 없어 제작이 용이하다. 그러나 이 방법은 물리흡 착이 잘되는 다당류 고정에는 효과적이지만, 물리 흡 착이 잘되지 않는 단당류 및 올리고당의 고정에는 적 합하지 않다는 단점이 있다.

둘째, 리피드가 붙은 변형 탄수화물(modified carbohydrates)을 비변형 고체기질에 위치 선택적이 며 비공유결합 방식으로 고정시켜 탄수화물칩을 제작 하였다[그림 3]. 당단백질 또는 당지질에 붙은 복합당 질을 화학적인 방법이나 효소를 이용하여 떼어낸 후, 이를 아미노 리피드와 환원 아민 반응(reductive amination)를 통해 결합시켰다. 합성된 neoglycolipids 는 니트로셀루로오스에 고정시켜 올리고당칩을 제작 하였다. 이 방법을 이용하면 탄수화물의 크기에 관계

그림 1. 마이크로어레이 기술.

그림 3. 위치 선택적이며 비공유결합 방식에 의한 탄수화 물칩 제작.

그림 2. 비특이적이며 비공유결합 방식에 의한 탄수화물

칩 제작.

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가장 많이 개발된 탄수화물칩 제작 방법은 적당한 링커가 결합된 변형 탄수화물을 적당한 작용기가 붙 은 고체기질에 위치 선택적이며, 공유결합 방식으로 고정시키는 것이다[그림 4]. 이 방법은 개질된 고체기 질이 필요하고 또한 적당한 작용기가 결합된 탄수화 물을 합성해야 된다는 단점이 있지만, 간단한 탄수화 물이나 올리고당을 효과적으로 고체기질에 고정시킬 수 있다는 장점이 있다. 이 방법의 한 예로서 말리이 미드기가 결합된 탄수화물을 합성하여 티올기가 붙은 유리기질에 위치 선택적이며 공유결합 방식으로 고정 시켜 탄수화물칩을 제작하였다[그림 4(A)]. 또한 cyclopentadiene이 결합된 단당류를 quinone이 결합

된 단분자층 금기질에 고정시켜 탄수화물칩을 제작한 연구결과도 보고되었다[그림 4(B)]. 이외에 p- aminophenyl이 결합된 탄수화물을 cyanuric chloride 가 붙은 유리기질에 고정시킨 예[그림 4(C)]와 azide 가 결합된 탄수화물을 삼중결합[그림 4(D)]이나 phosphane이 붙은 유리기질[그림 4(E)]에 고정시켜 탄수화물칩을 제작한 예도 보고되었다.

위에서 언급한 방법 이외에 탄수화물칩을 제작할 수 있는 또 다른 방법은 쉽게 구입할 수 있는 다양한 종류의 비변형 탄수화물(단당류, 이당류, 올리고당, 다 당류)을 적당한 작용기를 가진 고체기질에 위치 선택 적이며 공유결합 방식으로 고정시키는 것이다. 아직 까지 이 방법에 따라 탄수화물칩을 제작한 예는 보고 되지 않았지만 조만간 이 연구결과가 발표될 것으로 알려져 있다.

탄수화물칩의 응용

탄수화물칩은 후게놈 시대의 핵심 연구 분야 중 하 나인 복합당질 기능 연구(글라이코믹스 연구)에 많은 응용이 가능하다. 첫째, 탄수화물칩은 고속 단백질-탄 수화물 상호작용을 검색하는데 이용될 수 있다. 둘째, 탄수화물칩은 탄수화물 관련 효소(glycosidase, glycosyltransferase 등)의 기질 특이성을 고속으로 조사하는데 이용될 수 있다. 인간에게는 300여 개의 당전이 효소가 있으며, 이들의 이상은 질병과 직접적 인 관련이 있다. 또한 glycosidase의 비정상적인 활성 도 질병과 관련된 것이 많다. 따라서 이들의 기질 특 이성 연구 및 저해제 발굴은 신약 개발에 대단히 중요 한 정보를 제공할 수 있다. 탄수화물칩은 이 연구에 응용이 가능하다. 셋째, 탄수화물칩은 생체내 항체를 고속으로 검색하는데 이용될 수 있다. 병원균이 인체 를 감염시키면 병원균 특이 탄수화물을 인지하는 항 체가 몸속에서 생성된다. 또한 암세포는 tumor- associated carbohydrates를 발현시키고 이들 탄수화 물을 인지하는 항체가 몸속에서 만들어진다. 이들 질 병 관련 표지 항체 검출에 탄수화물칩을 이용할 수 있 다. 넷째, 탄수화물칩은 세포표면의 탄수화물 결합 단

그림 4. 위치 선택적이며 공유결합 방식에 의한 탄수화물

칩 제작.

(A)

(B)

(C)

(D)

(E)

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백질을 검출하는데 이용될 수 있다. 박테리아나 바이 러스는 표면에 특이 탄수화물 결합 단백질을 갖고 있 다. 이들 단백질을 검출하는 탄수화물칩은 진단칩으 로 응용이 가능하다. 다섯째, 탄수화물칩은 고속 탄수 화물-단백질 상호작용을 억제하는 저해제 개발에 이 용될 수 있다. 앞서 언급한 것과 같이 탄수화물-단백 질 상호작용을 통해 질병이 발생하는 경우가 많으므 로 이들 작용을 억제하는 저해제를 검색할 수 있다면 의약제로 이용될 수 있다. 마지막으로 탄수화물칩은 특정단백질에 결합하는 당단백질의 복합당질을 규명 하는데에도 이용될 수 있다. 생명체내 단백질의 약 50% 정도가 당단백질의 형태로 존재하는 것으로 알 려져 있다. 당단백질에 붙은 복합당질의 구조분석이 글라이코믹스 연구에 대단히 중요하다. 이를 분석하 기 위해 당단백질에 붙은 복합당질을 화학적 방법이 나 효소를 이용하여 해리시킨 후 컬럼을 이용하여 분 리한다. 분리된 복합당질을 유리기판에 고정시켜 탄 수화물칩을 제작한 후, 특정 단백질과 반응시켜 이들

단백질에 결합하는 탄수화물을 검출한 후 질량분광기 를 이용하여 당단백질에 결합된 복합당질의 구조를 분석한다.

위에서 언급한 것과 같이 탄수화물칩은 생명현상 규명, 질병진단, 의약제 개발 등 다양한 분야에 응용이 가능한 새로운 형태의 바이오칩이다.

결론

탄수화물칩은 기존의 단백질과 탄수화물 사이의 상 호작용을 고속으로 연구하는데 이용될 수 있는 획기 적인 기술로 현재 많은 관심을 받고 있다. 탄수화물칩 이 향후 생명과학 분야에 널리 이용되기 위해서는 쉽 게 칩을 제작할 수 있는 방법의 개발, 탄수화물을 쉽 게 합성할 수 있는 방법의 개발 및 탄수화물칩의 응용 기술 개발이 필요하다. 이 모든 것이 다 이루어지면 탄수화물칩은 향후 생명과학 분야에 많은 응용이 가 능한 획기적인 기술이 될 것이다.

그림 5. 탄수화물칩의 응용.

(B)

(A)

(F)

(E)

(D) (C)