임상약동학특론#8

임상약동학특론#8

PUSAN NATIONAL UNIVERSITY

Biopharmaceutics & Pharmacokinetics Laboratory Prof. In-Soo Yoon

참고문헌: Molecules 2018, 23, 650; doi:10.3390/molecules23030650

Dendropanax morbifera Leveille

•

Dendropanax morbifera

없음

1. D. morbifera 의 최적화된 추출법 탐색

2. 활성 물질을 식별하고 정량화하기 위한 HPLC 분석법 개발 3. 화학적 조성 및 생물학적 활성과 관련하여 제조하고 평가

Dendropanax morbifera Leveille

• Dendropanax morbifera Leveille: Araliacea 족에 속하는 아열대 상 록수로 전염병, 피부병 및 두통의 치료를 위해 전통 의약품에 사용

• 항산화, 당뇨병, 간 보호, 항보체, 항 동맥 경화 및 활동에 효능이 있다고 알려짐

• 최근에는 대사 산물을 효과적으로 통제하기 위해 천연물에서 후보 물질 을 찾는 데 큰 노력 중

Dendropanax morbifera Leveille

• 잎: 결장 선암종 세포, 담도 세포, 간세포 암종 세포 및 인간 골 암종 세 포 등다양한 인간 종양 세포주에서 세포 사멸을 조절함으로써 항산화 및 항암 활성, 잎 추출물에서 항염증제, 항혈전제 및 다른 활성 발견

• 그러나, 잎 추출물에 관한 크산틴 산화 효소 (Xanthine oxidase, XO) 의 활성과 유기용매를 이용하여 추출함에도 생물학적 활성, 식물 화학적 내용물 등에 대한 추출 조건의 최적화에 관한 선례가 없음

Method validation

• D. morbifera 잎 추출물에서 Chlorogenic acid, Rutin 의 정량에 사용된 분 석 방법은 앞에서 설명한대로 특이성, 선형성, 감도, 정확성, 정밀성 및 회수율 에 대해 검증

• Chlorogenic acid, Rutin LOD: 0.65, 0.50 (μg/mL)

• Limit of Detection (LOD): 검출 할 수 있지만 정량화 할 필요는 정도

• Chlorogenic acid, Rutin LOQ: 2.13, 1.63 (μg/mL)

• Limit of Quantification (LOQ): 정밀도와 정확도로 정량화 할 수 있는 시료의 최소 양

Linearity

• Calibration curve range: 3.125 ~ 50 μg/mL

• Calibration curve: Linear regressions

Analyte Retention

Time (min) R₂ Linear Range

(μg/mL) LOQ (μg/mL) LOD (μg/mL) Chlorogenic

acid 7.7 0.9988 3.125-50 2.13 0.65

Rutin 12.7 0.9996 3.125-50 1.64 0.50

Precision and Accuracy

Analyte Conc. (μg/mL) Intraday (n = 3) Interday (n = 3)

RSD (%) Accuracy (%) RSD (%) Accuracy (%) Chlorogenic

acid 12.5 4.73 92.36 1.17 94.78

25 1.11 95.70 1.64 97.07

50 2.12 96.12 1.95 98.12

Rutin 12.5 3.18 100.65 7.15 106.83

25 1.00 99.07 5.71 102.17

50 1.19 98.36 1.83 100.60

Repeatability

Analyte Added (μg/mL) Recovery (%) RSD (%) Chlorogenic acid 12.5 95.77 ± 0.62 0.78

25 96.72 ± 1.33 1.50

50 98.21 ± 0.45 0.48

Rutin 12.5 102.73 ± 0.40 0.40

25 97.65 ± 1.49 1.56

50 98.64 ± 0.43 0.43

Contents of Marker Compounds in D.

morbifera Leaf Extracts

• 식물 샘플을 6가지 상이한 용매 조성물: 물, 에탄올 20 %, 에탄올 40 %, 에탄올 60 %, 에탄올 80 %, 에탄올 100 % (v/v) 최상의 조 건 탐색

• 80 % 에탄올 추출물에서 두 화합물의 함량이 다른 에탄올 추출물 보다 많음 → 80 % 에탄올이 가장 효과적인 추출 용매로 선택

Contents of Marker Compounds in D. morbifera from Different Cultivation Regions

• 활성 물질의 추출수율 및 생산성을 비교하기 위해 4개의 지역에서 수집한 식물을 다양한 추출방법에 추출 수율 및 마커의 함량 비교

• 모든 샘플에서 공통적으로 Chlorogenic acid, Rutin 이 확인됨

• 장흥 (JH, 13.46 %) > 완도 (W, 12.03 %) > 강진 (K, 11.0 %) > 제 주 (JJ, 8.2 %) 순으로 지역에 따른 시료 추출 수율 감소

Contents of Marker Compounds in D. morbifera from Different Cultivation Regions

• Chlorogenic acid 함량은 W 샘플에서 가장 높았고, Rutin 의 함량은 K 샘플에서 가장 높았음

• W 와 K의 두 가지 활성 성분 함량의 합은 비슷했지만,

W 의 추출 수율이 K보다 높으므로 W 지역의 샘플 사용

Plant Material and Extract Preparation

•

D. morbifera

• 0 % 에탄올 추출은 열수 추출 (100 ℃, 4 시간)

• 여과 후, 생성 된 에탄올 용액 증발, 동결건조, -50 ℃ 에서 저장

• 추출물을 에탄올에 재현탁시키고, 0.4 μm 막을 사용하여 여과

Antioxidant Activity and Total Phenolic Contents of D. morbifera Extracts

• D. morbifera 추출물의 항산화 능력 확인: 2,2-diphenyl- 1-picrylhydrazyl (DPPH) 와 환원력 분석

• 식물 추출물의 항산화 효과: 일반적으로 페놀 함량과 관련,

항산화 활성을 갖는 페놀이 풍부할수록 염증, 산화 스트레

스 및 기타 대사 질환과 같은 상태에 대해 치료 효과↑

DPPH Free Radical Assay

• DPPH 라디칼 소거 분석을 사용하여 추출물의 항산화 특성 평가

• 다양한 농도의 에탄올 추출물 용액 (0.5 mL) 을 0.4 mM DPPH (0.5 mL) 와 10분 동안 혼합

• 517 nm에서의 마이크로 플레이트 판독기를 이용해 흡광도 측정

• 라디칼 소거 활성은 백분율로 계산

DPPH Free Radical Assay

0 5 10 15 20 25 30 35 40

0% 20% 40% 60% 80% 100%

DPPH scavenging activity

80 % 에탄올 추출물 최대 억제 농도 (IC

) 116.97 μg/mL 일 때

가장 높은 DPPH 라디칼 소거 활성

(36.10 ± 2.68 %)

Reducing Power

• 항산화 특성을 평가하기 위해 환원력 측정

• 샘플 (0.1mL) 을 1% potassium ferricyanide (0.5mL) 와 함께 0.2M

sodium phosphate buffer (0.5mL) 에 첨가하고, 50 ℃ 에서 20분 동안 반응

• 배양 후, 10% trichloroacetic acid solution 을 반응 혼합물에 첨가하고, 2000 g 에서 10분 동안 원심분리

• 상청액을 증류수 (0.5 mL) 및 0.1 % 염화철 (III) 용액 (0.1 mL) 과 혼합하고, 생성된 용액을 700 nm 에서 흡광도 측정

Determination of Total Phenolic Content

• 총 페놀 함량은 Folin-Ciocalteu 분석으로 측정

• 추출물 또는 표준용액 (갈산) 1 mL 을 2% sodium arbonate

solution 1mL 및 10 % Folin–Ciocalteu phenol reagent 1mL 과 혼합

• 10분 후, 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 750 nm 에서 흡광 도 측정

Determination of In Vitro Xanthine Oxidase (XO) Inhibitory Activity

• XO 시스템에서 요산 형성을 모니터링하여 XO 억제 활성 측정

• 분석 시스템: phosphate buffer (100 mM; pH 7.4) 0.6 mL, 샘플 0.1

mL, XO (0.2 U/mL) 0.1 mL, xanthine (1 mM; 0.1 M NaOH 에 용해 됨) 0.2 mL

• 억제제와 함께 또는 억제제 없이 효소를 첨가하여 반응을 개시하고, 15 분 후 1 M HCl 0.2 mL 을 사용하여 효소 반응을 중지, 290 nm 에서 흡 광도 측정

Xanthine Oxidase Inhibitory Activity of D. morbifera Extracts

• D. morbifera 잎 에탄올 추출물의 크산틴 산화 효소 (XO) 억제 활성에 대한 에탄올 농 도의 효과

• 50 g / mL의 농도에서 알로퓨리놀 (ALP; 양 성 대조군) 이 XO 활성을 유의하게 억제 함

• 에탄올 추출물의 XO 억제 활성은 에탄올 농 도 80% 에서 유의하게 더 높음

0 20 40 60 80 100 120

Xanthine oxidase inhibitory activities in ethanol extract

CON ALP 0% 20% 40% 60% 80% 100%

Concusion

• Rutin 은 XO 활성을 억제함으로써 항 고혈압 효과

• Chlorogenic acid 은 항염증제, 항알레르기 및 항고혈압 효과, XO 활성을 억제함으로써 항통풍 기능, 인터루킨 (IL) -1β, IL-6 및 요 산에 의해 유발된 TNF –α 와 같은 전 염증성 사이토 카인의 수준 을 감소시킨다는 정보에 기반하여 항고혈압제로서의 발달 가능성 이 상당히 높음

Concusion

• 4 개의 다른 재배 지역에서 추출한 D. morbifera 잎의 추 출물을 성공적으로 제조

• 화학적 프로파일과 생물학적 활성을 평가

• JH의 온수 추출물은 가장 높은 수율, W 및 K 샘플의 추출

물은 선택된 제조업체의 높은 농도를 보임

Concusion

• 80 % 에탄올 추출물은 가장 강력한 DPPH 라디칼 소거 활성, 환원 력, 페놀 함량 및 XO 억제 활성을 나타냄

• 개발된 HPLC 분석장법을 확인하고 모든

D. morbifera

• 이러한 결과는

D. morbifera