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J. Mushrooms 2018 December, 16(4):272-278 http://dx.doi.org/10.14480/JM.2018.16.4.272 Print ISSN 1738-0294, Online ISSN 2288-8853
© The Korean Society of Mushroom Science
*Corresponding author E-mail : [email protected]
Tel : +82-61-862-8840, Fax : +82-61-862-8847 Received December 4, 2018
Revised December 14, 2018 Accepted December 20, 2018
원목재배용 표고(Lentinula edodes)의 목질섬유소 분해특성 비교
정상욱
1· 장은경
1· 정찬문
1· 고한규
2· 권혁우
2· 반승언
1,*
1장흥군버섯산업연구원
2산림버섯연구센터
Analysis of lignocellulose degradation by Oak mushroom (Lentinula edodes)
Sang-Wook Jeong
1, Eun-Gyeong Jang
1, Chan–Mun Jeong
1, Han-Gyu Ko
2, Hyuk-Woo Kwon
2, and Seung-Eon Ban
1,*
1Jangheung Research Institute for Mushroom Industry, Jeonnan, Jangheung 59338
2Forest Mushroom Research Center, Gyeonggi, Yeoju 12653
ABSTRACT: Lignin degrading enzymes from Lentinula edodes have broad substrate specificities, and therefore can degrade a variety of recalcitrant compounds. In this study, the lignolytic biodegradation was investigated in five different L. edodes fungi (Chunbaegko, Sanjo 303ho, Poongnyunko, Baekhwahyang, and Soohyangko). The fungi were evaluated for their ability to decolorize Remazol Brilliant Blue R (RBBR) in malt extract broth medium. Sanjo 303ho, Poongnyunko, Baekhwahyang, and Soohyangko rapidly decolorized RBBR within 7 days. The activities of manganese peroxidase (MnP) and laccase were determined in the absence and presence of lignin. Poongnyunko displayed the highest ligninolytic activity on day 7 of incubation (2,809 U/
mg and 2,230 U/mg for MnP and laccase, respectively).
KEYWORDS: Lentinula edodes, Lignocellulose, Remazol Brilliant Blue R (RBBR), Laccase, Manganese peroxidase (MnP)
서 론
표고(Lentinula edodes)는 느타리(Pleurotus ostratus), 큰느타리(Pleurotus eryngii), 팽이(Flammulina velvtipes) 와 함께 국내 버섯 생산량의 90% 이상을 차지하며, 연간 생산량은 약 23,470톤으로 생산액이 약 2,120억 원에 달
하는 중요한 단기소득 임산물이다(Kim et al., 2017).
표고는 백색부후균으로 균사체에서 xylanase, cellulase, lignin 등의 목질분해효소를 다량 분비한 후 고분자량의 목질섬유소를 수용성 저분자량의 당으로 분해하여 영양원 으로 이용한다(Scarse, 1995). 표고가 영양원으로 이용하 는 목질섬유소는 70% 이상이 cellulose와 hemicellulose 로 구성되어 있으며, 약 20~30% 정도는 lignin으로 구성 되어 있다(Pandey and Pitman, 2003). 특히 표고는 다른 버섯류보다 lignin 분해효소를 다량 함유하고 있어 목재 내 lignin을 완벽하게 분해하는 것으로 알려져 있다(Crips et al,. 1990; Glenn and Gold, 1983). 대표적인 lignin 분 해효소로는 lignin peroxidase(LiP; EC 1.11.1.14)와 manganese dependent peroxidase(MnP; EC 1.11.1.13), laccase(Lac; EC 1.10.3.2)가 있으며, 이들은 효소분류학 적으로 산화·환원효소에 포함된다(Schmidt, 2006).
표고 원목재배에서 표고균사는 원목 내 목질섬유소를 분해하여 생장하기 때문에 목질분해효소의 분비가 높은 균주일수록 활착력이 우수해져 우량한 골목을 만들 수 있
다. 또한 표고 원목재배는 종균접종 후 4~5년간을 재배하 기 때문에 타 작물에 비해 재배기간이 길어 배양이 잘된 우량 골목을 만드는 것이 표고의 생산과 경영에서 매우 중요하다. 따라서 목질분해효소를 많이 분비하는 균주는 우수 표고품종이 갖춰야할 중요한 형질요건이다.
현재 우리나라의 표고재배는 국산품종보다 외산품종에 대한 의존도가 높아 국제신품종보호동맹(UPOV), 나고야 의정서 등 국제적인 협약으로 인해 많은 문제점을 안고 있다. 지금까지 우리나라에 출원된 표고품종은 원목과 톱 밥재배용을 합쳐 54품종이 출원되었다. 그러나 표고생산 에 관한 주요 경쟁국인 일본에서 출원된 180여 품종보다 는 매우 빈약한 실정이다(Park et al., 2015). 우리나라의 표고 신품종 개발은 전통적으로 교배육종법을 사용해 오 고 있다. 그러나 교배육종법은 변이균주의 생성부터 단계 적 절차에 따른 실증재배시험까지 많은 시간과 노동력이 소요된다. 따라서 표고의 신품종 개발기간을 단축하기 위 해서는 육종 모균주와 교배균주의 형질에 대한 유전적인 기초연구가 선행되어져야 한다. 교배균주를 생성한 후 실 증재배시험까지 교배균주에 대한 균학적 특성을 사전에 검증할 수 있다면 많은 시간과 노동력을 절약할 수 있다.
또한 신품종 육종과정 중 짧은 시간 안에 교배균주에 대 한 활착력 검증이 가능해져 실증재배시험보다 시간을 단 축할 수 있으며, 또한 선발과정 중 폐기되는 다량의 교배 균주도 재선발이 가능할 것이다.
지금까지 백색부후균의 목질섬유소 분해효소에 대한 연 구는 Poly B-411, Poly R-478, RBBR(Remazol Brilliant Blue R) 등과 같은 염료를 이용하여 효소활성을 측정하였 다(Glenn & Gold, 1983; Machado et al., 2005). 이러한 선행연구를 바탕으로 본 연구에서는 국내에 원목재배용으 로 출원된 표고품종을 대상으로 RBBR 탈색능과 lignin 분해효소의 활성을 측정한 후 품종간에 목질섬유소 분해 능을 비교·검증하였다. 또한 교배균주의 원목 내 활착력을 사전 검증하기 위해 안정적인 목질섬유소의 분해효소 측 정시스템을 확립하여 단기간에 교배균주의 활착능력을 검 증하고자 하였다.
재료 및 방법
공시균주
본 실험에 사용한 균주는 국내 원목재배용 표고(Lentinula edodes)품종인 천백고, 산조 303호, 풍년고, 백화향, 수향 고를 사용하였다. 공시균주는 산림조합중앙회 산림버섯연 구센터에서 분양받았으며, PDA(Potato dextrose agar) 배지 에 접종한 후 25oC에서 10일간 계대배양하여 사용하였다.
RBBR을 이용한 균주 탈색능 측정
RBBR(Remazol Brilliant Blue R)을 이용한 공시균주의 탈색능 측정을 위해 RBBR과 lignin를 첨가한 MEB(Malt
extract broth) 배지에 접종시켰으며, 그 조성은 Table 1과 같다. 50 ml 삼각플라스크에 MEB 배지를 10 ml씩 분주 한 후 silistopper로 막은 뒤 121oC에서 15분간 멸균하였 다. 각각의 삼각플라스크에 100 μM RBBR과 lignin 100 ppm이 되도록 첨가한 후 직경 5 mm cork borer를 이 용하여 균총 가장자리의 agar plug를 떼어내어 접종하였 다. 그 후 0.1 mM H2O2를 첨가한 후 28oC에서 9일간 정 치배양 하였으며, 2일 간격으로 배양된 배지를 원심분리 (12,000 rpm, 15분, 4oC)한 후 0.2 μm cellulose acetate filter를 통해 얻어진 상층액을 UV 분광도계(Biotek Instruments, USA)를 이용하여 593 nm에서 흡광도를 측 정하였다.
목질섬유소 분해효소의 활성 검정
공시균주의 목질섬유소 분해효소 활성을 검정하기 위해 RBBR을 이용한 균주의 탈색능 측정과 동일한 MEB 배 지를 사용하였다. 제조된 배지에 직경 5 mm cork borer를 이용하여 균총 가장자리의 agar plug를 떼어내어 접종한 후 28oC에서 2일간 정치배양한 뒤 100 ppm lignin을 첨 가하였다. lignin을 첨가한 후 다시 28oC에서 15일간 정 치배양하였으며, 2일 간격으로 배양된 배지를 원심분리 (12,000 rpm, 15분, 4oC)한 후 얻어진 상층액을 이용하여 효소활성을 측정하였다.
MnP(manganese peroxidase)의 활성 검정에서는 2,2΄- azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS;
ε420 = 36,000 M-1cm-1)를 기질로 사용하였다. 0.2M lactate buffer(pH 4.5) 0.8 ml에 50 µl ABTS(0.8 g/l), 33 µl 6 mM MnSO4, 100µl의 상층액을 첨가한 후 17 µl 0.1 mM H2O2를 첨가하여 30분간 반응시킨 뒤 420 nm에서 흡광도 를 측정하였다. 효소활성은 아래의 식을 통해 계산하였다 (Krčmář, 1999; Lee, 2005).
Laccase의 활성 검정에서는 ABTS를 기질로 사용하였 다. 0.85 ml 0.2M lactate buffer(pH 4.5)에 50 µl ABTS, 100µl의 상층액을 3분간 반응시킨 후 420 nm에서 흡광 도를 측정하였다. 효소활성은 아래의 식을 통해 계산하였 다(Krčmář, 1999; Lee, 2005; Lee et al., 2007).
Table 1. Composition of MEB media.
Component Concentration
Malt extract base 0.60%
Maltose 0.18%
Dextrose 0.60%
Yeast extract 0.12%
MnP activity(unit/mg) = ΔAbsorbance×106×Total volume ΔTime×ε420×Sample weight
Filter paper를 이용한 목질섬유소 분해능 측정
공시균주간 목질섬유소 분해능을 비교검증하기 위해 filter paper에 균주를 배양하여 분해능을 측정하였다.
Yeast nitrogen base 배지를 제조하여 5 ml씩 분주한 시험 관에 멸균된 filter paper(Whatman No.2; Whatman, piscataway, NJ, USA) 조각을 넣은 후 직경 5 mm의 cork borer를 이용하여 균총 가장자리의 agar plug를 떼어내어 접종하였다. 그 후 28oC에서 35일간 150 rpm으로 진탕배 양하면서 filter paper의 분해정도를 육안측정하여 균주간 의 분해능을 비교하였다.
통계분석
RBBR을 이용한 균주 탈색능과 목질섬유소 분해효소의 활성측정은 3회 반복 실험하였으며, 실험결과는 SPSS 통 계프로그램(Statistical Package for the Social Science, Version.22.0 SPSS Inc., Chicago, USA)을 이용하여 각 측정군의 평균값과 표준편차를 산출한 후 Duncan`s multiple range test와 독립표본 T-검정을 이용하여 p <
0.05 수준에서 유의성을 검정하였다.
결과 및 고찰
RBBR 탈색능과 lignin 분해능 비교
표고가 영양원으로 이용하는 목질섬유소는 70% 이상이 cellulose와 hemicellulose 등으로 구성되어 있으며, 약 20~30% 정도는 lignin으로 구성되어 있다(Pandey and Pitman, 2003). 표고는 목재나 톱밥처럼 lignin 성분을 많 이 포함하는 기질에서 자라며(Park et al., 2015), lignin을 분해하는 효소를 다른 버섯에 비해 많이 분비한다고 알려 져 있다(Eriksson KE et al., 1990). 따라서 lignin과 구조 가 유사하여 lignin 분해에 대한 활성지표로 많이 이용하 는 효소 활성에 따라 색변화를 나타내는 RBBR(Remazol
Brilliant Blue R)을 통해 표고의 lignin 분해능을 확인하 였다.
표고균주의 RBBR 탈색능을 측정한 결과는 Table 2와 같이 배양 1일째에는 풍년고 0.382±0.016, 수향고 0.382
±0.016, 산조 303호 0.386±0.010, 천백고 0.395±0.014, 백화향 0.397±0.010 순으로 흡광도가 낮게 나타났다. 또 한 배양 9일째에는 수향고 0.292±0.010, 풍년고 0.297
±0.009, 산조 303호 0.300±0.013, 백화향 0.334±0.011, 천 백고 0.390±0.014 순으로 낮게 나타났다. 배양일수 경과 에 따라 산조 303호와 풍년고는 배양 5일째부터는 다른 균주에 비해 급격한 lignin 분해능을 보였으며, 수향고 역 시 배양 7일째부터 탈색되는 것을 확인 할 수 있었으나, 천백고와 백화향의 경우 큰 차이를 보이지 않았다(Fig.
1). 이는 산조 303호와 풍년고는 배양기간이 경과할수록 다른 균주보다 다량의 lignin 분해효소를 분비하는 것으로 생각된다. Kim 등(2011)은 표고 교잡균주 5종의 RBBR 탈색능을 조사한 결과 0.16~1.37의 흡광도를 보였다. 본 연구의 공시균주보다 우수한 분해능을 보인 균주도 있었 Laccase activity(unit/mg) = ΔAbsorbance×106 ×Total volume
ΔTime×ε420×Sample weight
Table 2. RBBR decolorization by Lentinula edodes in MEB medium as determined by UV spectrophotometer at absorbance 593nm.
Cultivars
Days Chunbaegko Sanjo 303ho Poongnyunko Baekhwahyang Soohyangko
1 0.395±0.014a 0.386±0.010b 0.382±0.016c 0.397±0.010a 0.382±0.016c 3 0.391±0.016a 0.385±0.006b 0.359±0.008c 0.392±0.009a 0.380±0.012b 5 0.389±0.010a 0.347±0.016b 0.326±0.010c 0.394±0.005a 0.385±0.007c 7 0.389±0.005a 0.334±0.018bc 0.335±0.012b 0.394±0.015a 0.297±0.014c 9 0.390±0.014a 0.300±0.013c 0.297±0.009c 0.334±0.011b 0.292±0.010c Values are mean±SD of three replicated.
a-cMeans with different superscripts in the same column are significantly different at p<0.05 by Duncan's multiple range test.
Fig. 1. RBBR decolorization by Lentinula edodes in MEB medium.
A: Chunbaegko, B: Sanjo 303ho, C: Poongnyunko, D:
Baekhwahyang, E: Soohyangko
지만, 대부분 낮은 분해능을 보였다. 따라서 표고균주의 lignin 분해능이 품종에 따라서는 물론 교잡균주에 따라서 도 다양하게 나타나는 것으로 보여진다. 또한 Hong 등 (2013)은 백색부후균 15종의 RBBR 탈색능을 조사한 결 과 일부 백색부후균을 제외한 모든 균주에서 배양 2~3일 사이에 급격한 흡광도 감소를 나타내었다. 본 연구에서는 대부분의 균주가 배양 5일 이후부터 흡광도가 감소하기 시작하여 Hong 등(2013)의 결과와 차이를 보였다. 이는 백색부후균의 종류에 따라 다른 효소시스템을 가지고 있 으며, 생육환경에 따라서도 기질 분해능이 다르기 때문에 (Hong et al., 2013) lignin 분해능 및 분해기간에 차이가 있음을 나타낸다.
표고 원목재배에서 균사가 원목을 분해하여 생장하므로 접종초기부터 원목 내 활착력이 우수한 균주를 선발하는 것 이 중요하다. 따라서 신품종 육종과정에서 교배균주의 생화 학적 기초특성을 사전에 파악하고 육종기간을 단축하기 위 해서는 lignin 분해능의 검증과정이 매우 필요하다. 또한 균 주에 따라 lignin 분해능 및 분해기간이 다르기 때문에 버섯 류에 대한 추가적인 효소시스템에 관한 연구가 필요하다.
MnP와 laccase의 목질섬유소 분해활성 검정
Lignin을 분해하는 효소에는 laccase, lignin peroxidase, manganese peroxidase 등이 포함되어 있다(Kim et al., 2017). 표고균사는 목질섬유소 분해효소를 다량 분비한 후 고분자량의 목질섬유소를 수용성 저분자량의 당으로 분해 하여 영양원으로 이용한다(Scarse, 1995). MnP(manganese peroxidase)는 H2O2의 존재 하에서 Mn(II)를 Mn(III)으로 산화시킨다. 그리고 산화된 Mn(III)은 lignin의 페놀부위 를 산화시킨다(Baldrian, 2011). Laccase(Lac; EC 1.10.3.2) 는 p-디페놀 산화효소라고 하여 4개의 구리이온을 포함하 는 산화·환원효소로 과산화수소를 만들지 않고 물의 산소 분자 환원을 촉매하며, 페놀 잔기를 퀴논으로 산화함으로 써 lignin을 분해한다(Kunamneni et al., 2007). 따라서 표 고균사에 따라 목질섬유소를 분해하는 주요 효소인 MnP 와 laccase의 활성을 측정하여 표고균주간의 목질섬유소 분해능을 비교하였다.
MnP의 활성측정은 Fig. 2와 같이 배양 1일째에 lignin 을 첨가한 백화향에서 2,757 U/mg으로 가장 높게 나타났 으며, 풍년고 1,131 U/mg, 산조 303호 1,110 U/mg, 수향 Fig. 2. Extracellular enzymes MnP activities of Lentinula edodes in culture medium.
A: Chunbaegko, B: Sanjo 303ho, C: Poongnyunko, D: Baekhwahyang, E: Soohyangko
고 646 U/mg, 천백고 320 U/mg 순으로 나타났다. 또한 배양 17일째에는 산조 303호에서 2,647 U/mg으로 가장 높게 나타났으며, 풍년고 2,638 U/mg, 수향고 2,095 U/
mg, 백화향 1,990 U/mg, 천백고 415 U/mg 순으로 나타났 다. 따라서 균주간의 MnP는 초기 활성은 물론 배양일수 에 의해서도 많은 차이를 보였다. 대부분의 균주는 배양 일수가 경과될수록 효소활성이 증가하였으나, 천백고는 배양초기부터 다른 균주에 비해 저조한 활성을 보였으며, 백화향은 배양 2일째 가장 높은 효소활성(2,757U/mg)을 보이다가 이후부터는 점차 감소하였다.
Laccase의 활성측정은 Fig. 3과 같이 배양 1일째에 lignin을 첨가한 백화향에서 1,904 U/mg으로 가장 높게 나타났으며, 풍년고 1,165 U/mg, 산조 303호 771 U/mg, 수향고 367 U/mg, 천백고 254 U/mg 순으로 나타났다. 또 한 배양 17일째에는 풍년고에서 1,512 U/mg으로 가장 높 게 나타났으며, 백화향 1,506 U/mg, 산조 303호 1,446 U/mg, 수향고 814 U/mg, 천백고 235 U/mg 순으로 나타났다. 이 번에도 MnP의 활성측정에서처럼 대부분의 균주에서 배
양일수가 경과될수록 효소활성이 증가하였으나, 천백고는 lignin의 첨가 유무와 관계없이 활성변화가 거의 없었다.
이와 같은 결과를 바탕으로 공시균주간의 효소활성을 비 교해 보면 풍년고가 lignin을 첨가한 실험구에서 배양 7일 째 MnP 2,809 U/mg, laccase 2,230 U/mg으로 최고 활성 을 나타내었고, 다음으로는 산조 303호가 배양 11일째 MnP 2,673 U/mg, laccase 2,049 U/mg의 활성을 보였다.
그러나 백화향은 배양일수에 따라 RBBR 탈색능 측정에 서와 같이 효소활성에 차이를 보이지 않았으나, MnP와 laccase 활성은 배양 7일째 lignin을 첨가한 실험구에서 2,321 U/mg, 2,546 U/mg으로 매우 높게 나타났다(Fig. 3, 4). Hong 등(2013)의 실험결과에서도 MnP와 laccase가 배양 6일째 1,545 U/mg, 1,259 U/mg으로 가장 높게 나타 나, 균주에 따라 많은 효소활성의 차이를 보였다. 이는 lignin 분해효소가 MnP, laccase 외에 다른 효소의 기작이 작용했기 때문으로 생각된다. Pointing(2001)은 버섯균이 분비하는 효소에는 MnP, laccase 외에 glyoxal oxidase (EC 1.2.3.5), glucose oxidase(EC 1.1.3.4)등이 있다고 보 Fig. 3. Extracellular enzymes Laccase activities of Lentinula edodes in culture medium.
A: Chunbaegko, B: Sanjo 303ho, C: Poongnyunko, D: Baekhwahyang, E: Soohyangko
고하였다. 따라서 표고균주의 lignin 분해능을 더욱 정확 하게 검증하기 위해서는 MnP, laccase 외에 아직 밝혀지 지 않은 다른 효소에 대한 연구가 필요하다.
목질섬유소 분해효소의 Filter paper 분해활성 비교 MnP와 laccase의 목질섬유소 분해활성 측정결과를 비 교검정하기 위해 Yeast nitrogen base 배지에서 cellulose 로 구성된 filter paper의 분해활성을 조사하였으며, 그 결 과는 Fig. 4와 같다. 배양 후 약 5주째 산조 303호와 풍년 고, 수향고는 filter paper의 형체가 보이지 않을 정도로 완전히 분해되었으며, 천백고와 백화향은 filter paper가 그대로 유지되고 있어 분해가 되지 않은 것을 확인할 수 있었다.
RBBR 탈색능 측정에서는 수향고, 풍년고와 산조 303 호의 효소활성이 우수하게 나타났으며, lignin 분해능 측 정은 MnP에서 수향고, 풍년고와 산조 303호가 우수한 효 소활성을 보였으며, laccase는 풍년고, 백화향과 산조 303 호의 효소활성이 우수한 것으로 나타났다. RBBR 탈색능 과 lignin 분해효소의 활성이 우수한 균주가 filter paper의 분해활성도 우수하였으며, 이는 RBBR 탈색능과 lignin 분해능이 우수한 균주가 초기 활착률이 뛰어날 것으로 생 각된다. 백화향의 경우 Lac의 높은 활성과 반대로 filter paper 분해가 잘 되지 않은 결과가 나타난 것은 Mnp와 Lac 외에 glyoxal oxidase, aryl alcohol oxidase, glucose oxidase 등의 효소가 주도적으로 작용하기 때문일 것으로 생각된다. 대부분의 균주는 RBBR 탈색능과 lignin 분해 능이 우수 할수록 filter paper의 분해정도가 높게 나타나 는 경향을 보였다.
Park 등(2015)이 보고한 헌구두솔버섯(Gyrodontium versicolor) 균주의 filter paper 분해력 조사에서는 배양 4 주 만에 filter paper를 완전히 분해하였다. 이는 버섯의 종 류와 균주에 따라 cellulose의 분해활성 및 분해기간이 다 양하게 나타나기 때문인 것으로 생각된다. 이러한 실험 결 과는 다양한 방법을 통해 측정한 cellulose 및 lignin의 분 해능 조사 방법이 표고버섯 균주의 특성에 대한 사전 정보
를 제공하는데 유용하게 사용 될 수 있을 것을 시사한다.
요 약
본 연구에서는 원목재배용 표고(Lentinula edodes) 품종 에 대한 목질섬유소 분해능을 검정하였다. 5개의 국산품 종(천백고, 산조 303호, 풍년고, 백화향, 수향고)을 대상으 로 malt extract broth(MEB) 배지에 lignin의 첨가에 따른 RBBR(Remazol Brilliant Blue R) 탈색능을 조사한 결과, 산조 303호와 풍년고가 배양 5일째부터 우수한 분해능을 보였다. 섬유소 분해효소인 MnP와 laccase의 활성은 풍년 고가 배양 7일째 MnP 활성이 2,809U/mg, laccase 활성이 2,230U/mg으로 나타났고, 산조 303호가 배양 11일째 MnP 활성이 2,673U/mg, laccase 활성이 2,049U/mg으로 최고 활성을 나타났으며, lignin을 첨가하였을 때 효소의 활성이 증가하였다. 산조 303호, 풍년고와 수향고는 배양 5주 만에 filter paper의 분해정도를 육안으로 확인이 가능 할 정도로 분해능이 우수하였다.
감사의 글
본 논문은 농림축산식품부의 재원으로 농림식품기술기 획평가원의 Golden Seed 프로젝트 사업의 지원을 받아 연구되었음(213007-05-2-WTH31).
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Fig. 4. Degradation of filter paper by Lentinula edodes. The fungal strains were cultured in yeast nitrogen base broth containing a fragment of filter paper at 28oC, for 5 weeks.
A: Chunbaegko, B: Sanjo 303ho, C: Poongnyunko, D: Baekhwahyang, E: Soohyangko
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