줄기세포를 이용한 배양육 생산 시스템
(in vitro meat production system) 기술 개발
박 윤 제 공주대학교 식품공학과
줄기세포를 이용한 배양육 생산 시스템(in vitro meat production system) 기술 개발
1. 서론
최근 인구의 급증으로 인한 식량문제가 대두되고 있고, 이에 따라 다양한 해결책이 제시되고 있다. 실제 인구증가 예상을 보면 2050년이 되면 전 세계 인구는 90억 명에 이르고, 육류 소비량 역시 465백만 톤에 달할 것으로 추정되며, 육류 소비에 대한 수요를 맞추기 위해 매년 2억 톤 규모의 고기에 대한 추가 생산이 필요할 것으로 추정된다(Shruti, 2015). 그러나, 기존의 축산업은 대량생산에 따른 동물복지 문제 뿐만 아니라 에너지 소비, 물 및 토지 사용, 온실가스 배출량 증대 등의 여러 문제점이 발생하고 있어 이러한 문제점을 해결할 새로운 방법이 필요한 상태이다.
실제 이러한 문제점을 해결하기 위하여 축산업을 통한 고기 생산을 대체할 방법으로 식물성 인조육, 곤충 식품 등 여러 가지 대체 고기 및 단백질원 개발을 위한 다양한 방법이 제시되고 있다. 그러나, 식물유래(
콩), 우유단백질, 밀단백질을 이용한 인조육은 고기 맛과 질감의 차이로 인해 버거나 소세지, 두부 등 순수한 고기가 아닌 가공형태로만 제조하고 있는 실정이다. 최근 Impossible Food라는 벤처 업체에서 콩을 이용한 식물성 인조육을 성공적으로 개발하여 햄버거의 패티로 사용하고 있으나, 이 역시 패티 같은 가공형태로만 제조되고 있으며, 순수한 고기형태로는 개발되지 못하고 있다.
그 외 최근에는 곤충을 이용한 다양한 곤충식품이 주목받고 있고, 우리나라에서도 곤충을 식품으로 사용할 수 있도록 법적 제도가 제정되고 있지만 이들 대부분이 유충형태로만 허가되고 있고, 이 또한 곤충을 식품 성분으로 이용하기 위한 제조공정개발의 어려움과 외골격이 소화되지 않는 단점, 그리고 지역, 인종에 따라 혐오감을 유발하는 어려움으로 인해 기존의 고기생산을 대체하기에는 한계가 있는 실정이다.
이러한 문제를 해결하기 위해 최근에는 배양육이 하나의 대안으로 대두되고 있다. 배양육(in vitro meat)란 가축을 사육하는 과정을 거치지 않고, 실험실에서 세포증식을 통해 얻게 되는 식용고기를 일컫는데, 배양육은 영어로 cultured meat, in vitro meat, lab grown meat라고 하며 네덜란드어로는 'kweekvlees(grown meat)'라고 불리기도 한다. 그 외 다른 용어로 in vitro caro, victimless meat, tubesteak, frankenmeat 또는 test-tube meat 등으로 불리기도 한다. 배양육은 살아있는 동물의 세포에서 줄기세포를 채취, 실험실에서 배양해 고기의 근육, 지방, 기름, 뼈 등을 생산하는 방식으로 주로 세포배양기술이 이용되며, 동물의 실제 살에서 나온 고기라는 점에서 최근 콩 단백질 등으로 만든 인조고기와는 다르다.
실제 배양육은 인구 증가에 따른 고기수요 증가, 가축번식과 관리에 따른 환경 파괴, 대규모 동물사양과 도축에 따른 동물복지와 공공보건에 대한 대안으로 최근 20년 사이에 관심이 크게 증가하고 있다(FAO, 2006). 배양육을 이용하면 인구증가에 따른 고기생산에 대한 문제 뿐 아니라, 축산업이 낳는 각종 환경오염 문제도 해결해 줄 것으로 기대되고 있다. 실제 축산을 통해서 쇠고기 1 kg을 생산하기 위해서는 매우 많은 공급이 필요한데, 물은 15.5 ton, 사료는 약 7 kg이 필요하며, 햄버거 1 개를 만드는데는 물 1,700 L가 필요한 것으로 추산되고 있다. 또한, 축산업이 환경에 미치는 영향도 매우 커서 축산 온실가스 배출량은 적게는 11.8%에서 많게는 총배출양의 51%까지 배출하는 것으로 추정되고 있다. 특히 소 한 마리에서 하루 200 L의 가스가 배출되고 있으며, 1 년에 4 ton이라는 매우 막대한 량이 배출되고 있는데, 이는 전체 메탄 배출량의 40%, 이산화질소의 60%에 해당하는 것으로 보고되고 있다. 또한 가축이 사용하는 토지도 매우 커서, 지구 토지의 30%, 농업용 토지의 70%에 해당하는 3천3백만 km2이 가축과 관련되어 사용되는 토지이며, 그 외에도 사료용 콩 재배지 증가를 위해 년간 11,650 km2 의 우림이 파괴되고 있기도 하다. 실제 가축을 위해 필요한 사료생산용 농지의 면적은 전체 농지의 약 33%에 해당하며 전체 곡물생산량의 40%가 사료생산에 해당한다. 특히 1 cal의 소고기를 생산하기 위해서는 23 cal에 해당하는 사료 에너지가 필요한 매우 아이러니칼한 상태에 놓여져 있다.
그러나, 배양육 기술을 이용하면 1 cal의 소고기를 생산하기 위해서 단지 3 cal의 에너지만 필요하고 대부분의 소고기 생산을 공장에서 하기 때문에 고기 생산을 위해 필요한 에너지 소비량은 기존 사육 고기에 대비하여 55% 수준으로 낮출 수 있다. 또한, 온실가스 배출량은 96% 감소, 물 및 토지 사용량은 96% 및 99%
까지 감소될 수 있다고 보고되고 있다(Post, 2012).
또한, 동물복지 및 공공보건 측면에서도 동물을 비윤리적으로 생산하고 도축하는 문제를 해결할 뿐 아니라, 동물에서 유래하거나 동물이 매개하는 여러 질병을 예방하거나 관리할 수 있는 장점이 있다. 그 외에도 식물 유래의 고기가 아닌 동물세포를 활용함으로써 원래의 맛과 질감 및 함유하고 있는 영양소를 공급할 수 있으며, 곤충식품이 가지는 소화문제나 혐오감 등의 한계를 극복할 수 있다.
이러한 배양육에 대한 개념은 매우 오래전부터 제시되어 왔는데, 최초의 언급은 1927년에 J.B.S Haldane이 저술한 ‘Possible world’라는 책 중 ‘The future of biology’라는 chapter에서 ‘근육을 조직배양한 것으로부터 아침식사를 제공받을 수 있을 것’이라는 언급이다. 이후 1932년 영국의 윈스턴 처칠(Winston Churchill) 총리는 ‘50년 후의 세계(Fifty Years Hence)’라는 책에서 ‘50년 후에는 닭의 가슴살이나 날개만을 먹기 위해 닭을 기르지 않아도 될 것이다. 대신 우리는 적절한 조건에서 닭의 한 부위만 별도로 배양할 수 있는 능력을 가지게 될 것이다’라고 하였다.
실제로 이후 1971년에 Russel Ross는 돼지근육세포를 이용하여 처음으로 배양에 성공하였고, 이후 다양한 조직배양기술이 발전함에 따라 동물의 조직을 배양하여 생산하고자 하는 기술이 개발되었다. 1990 년대에는 조직공학과 줄기세포 기술을 통해 근육세포를 실험실에서 배양하는 기술이 개발되기 시작했고 최근 줄기세포 유래 체외 배양 분화 기술의 발달로 배양고기 생산기술이 대두되었는데, 1996년에는 Tissue Culture And Art Project를 통하여 개구리 세포를 이용한 조직배양에 성공하였고, 1997년에는 NASA에서 Morris Benjaminson이 우주식량으로 사용하기 위한 물고기 근육세포를 배양하는데 성공하였다.
1998년에는 Jon F. Vein이 조직배양기술을 이용한 배양육 생산에 관한 미국특허를 취득하였고, 1999년에는 네덜란드 암스테르담 대학교의 Willem van Eelen이 배양육에 대한 국제 특허를 획득한 후 세포배양과 조직배양을 활용한 상업적 기술 개발도 다양하게 시도되어 왔다. 이러한 시도는 다양한 기관과 국제 컨소시움을 통해 진행되어 왔는데, 2001년에는 NASA에서 우주선에서 칠면조 고기를 배양하는데 성공하였고, 2002년에는 NSR/Touro Applied Bioscience Research Consortium에서 금붕어의 근육조직을 생선 필레만큼 배양하는데 성공하기도 하였다(Jönsson, 2016). 2005년에는 네델란드에서 3개 대학이 연합하여 Dutch in vitro meat project가 추진되어 Amsterdam University에서는 배양 배지 개발을 진행하였고 University of Utrecht에서는 근육세포의 증식기술 개발, 그리고 Eindhoven University of Technology에서는 Bioreactor 기술을 개발하기 위하여 80만 유로의 연구비를 투자하였는데, 이러한 연구가 최근의 배양육 상업 기술의 원천기술을 개발하는 기초가 되었다. 2007년에는 유럽과 미국이 연합하여 in vitro meat consortium이 창설되었고, 2008년에는 국제동물보호단체인 PETA에서 닭세포로 배양육 생산업체에 2012년까지 100만달러의 상금을 제시하며 기술개발을 촉진하기도 하였다.
배양육 기술개발을 위한 시도는 줄기세포의 활용 기술이 개발됨에 따라 줄기세포 기술이 적용되기 시작하였고, 2009년 11월에는 IVC에서 네델란드 과학자들이 돼지고기의 줄기세포를 이용하여 1 cm의 고기를 생산하는 것에 성공하였다고 보고하였다. 그러나, 최근의 줄기세포를 이용한 배양육 생산 기술은 2013년 네델란드 Maastricht University의 Mark Post 교수가 창업한 Mosa Meat에서 소의 줄기세포를 배양하여 쇠고기를 만드는 것을 성공하였다고 보고한 것이 매우 큰 이슈가 되었으며, 상업적 가능성을 제시하는 기점이 되었다. 특히 Google의 공동창업자인 Sergey Brin이 30만 달러를 투자하면서 큰 관심을
받게 되었다. 그러나, 1 파운드의 고기 생산에 약 325,000 달러가 소요되어 생산 단가를 낮추는 것이 필요하였다. 이후 2015년에는 이스라엘에 있는 Modern Agricultural Foundation에서 Tel Aviv University 를 중심으로 in vitro chicken project를 시작하였다.
이후 South Carolina Medical School의 Vladimir Mironov와 심장의학자인 Uma Valeti가 공동창업한 Memphis Meats에서 2016년 1월에 배양육으로 만든 쇠고기 미트볼 시식회를 함으로써 다시 큰 관심을 받게 되었는데, 이는 1 파운드의 고기 생산에 18,000 달러에 가능한 기술을 개발함으로써 생산원가를 줄일 수 있다는 것을 제시하였기 때문이다. 이후 1 년 뒤인 2017년 3월에는 오리고기와 닭고기를 개발하여 공개하였고, 이 때의 생산단가는 다시 1/2로 줄어든 9,000 달러에 1 파운드의 고기 생산이 가능하다고 제시하여, 배양육 생산 단가가 시간이 갈수록 기하급수적으로 감소하는 것을 보여주었고, 이를 바탕으로 2021년에는 상업적 시판을 목표로 기술개발을 추진하고 있다. 이 외에도 배양육 기술과 관련하여 Modern Meadow, Super Meat 등 매우 많은 벤처들이 생겨나 첨단 기술을 연구 개발하고 있고, 배양육을 실제 생산할 수 있는 기술을 개발 중에 있다.
이러한 기술은 특허기술로도 보호되어 있는데, Vein(2001)은 상업용 조직공학 고기를 제조하는 방법을 미국 특허 출원하여 획득하였으며, van Eelen(2004)도 세포배양기술을 이용한 고기의 산업적 생산에 대한 미국 특허를 획득하였다. Missouri University도 Forgacs et al.(2012)가 출원한 공학적 식용고기에 대한 특허를 보유하고 있으며, Modern Meadow사에서는 Marga et al.(2014)이 발명한 동물유래물질 없는 식용 가공고기에 대한 특허를 보유하고 있다.
이와 같이 이미 선진국에서는 배양육의 기본기술이 확보되어 상당수의 전문가들은 배양육이 10년 내 대중화될 것이라 예상하고 있고, 국내에서도 배양육에 대한 기반 기술 및 상업화를 위한 기술개발이 필요한 실정이다.
실제 배양육의 생산을 위한 기술개발에 있어서 배양육은 해부학적으로 근육에 해당하고 있고, 주로 단백질로 구성되어 있다. 따라서 줄기세포로부터 근육을 배양하고 분화하는 기술과 밀접히 연결되어 있다.
일반적으로 생체내에서 근육세포는 3가지 종류로 나누어져 있는데 근육과 같은 skeletal muscle, 위 등에 존재하는 평활근 smooth muscle, 그리고 심장근육인 cardiac muscle로 나눌 수 있다. 배양육에 해당하는 것은 skeletal muscle과 같은 근육조직으로 볼 수 있는데, 이는 보통 muscle fascicle로 구성되어 있고, 이것은 다시 myofibril로 이루어진 muscle fiber로 구성되어 있다. 그리고 최종적으로는 myofibril은 myofilament로 구성되어 있는데, 이는 근육의 기본 단백질인 actin과 myosin으로 이루어져 있고, 이것이 식품학적으로 단백질 덩어리인 고기에 해당하게 된다(그림 1).
이러한 근육의 생성은 기본적으로 mesenchymal 세포가 myoblast로 분화되면서 시작되는데, 근육 내에서는 muscle fiber에 붙어있는 근 위성세포(satellite cell)가 그 역할을 담당하고 있다. 생체 내에서는 myoblast가 분화를 시작하면서 세포가 융합되어 myotube를 형성하고, 이것이 다시 muscle fiber를 형성하는 단계를 거치게 된다(Choi et al., 2012). 이 때 각 단계마다 분화에 필요한 분화유도 단백질이 있을 뿐 아니라 분화된 근육세포에 따라 세포의 표면에 분화정도를 나타내는 단백질 marker를 포함하고 있다 (그림 2).
그림 1. 근육의 기본구조
배양육을 개발하기 위한 기초 기술로는 먼저 배양육으로 분화할 수 있는 satellite cell을 확보하는 것과 이를 근육조직으로 분화시키는 기술이다. 다양한 muscle skeletal satellite cell을 분리하는 기술이 개발되어 왔으며, 이로부터 muscle fiber를 효율적으로 분화시키는 기술도 개발되어 왔다(Betti et al., 2010). 최근에는 muscle fiber 자체를 분리하여 배양하는 기술도 제시되었다(Pasut et al., 2013). 또한, mouse muscle skeletal satellite cell을 분리한 다음 이것을 다시 살아 있는 mouse에 이식함으로써 생체 내 분화 정도를 파악하는 기술도 제시되었다(Angelino et al., 2018). 뿐만 아니라 Genovese et al.(2014)은 돼지로부터 역분화 줄기세포를 만든 다음 이로부터 myotube로 분화가 가능하다는 것도 보고하였고, Park et al.(2007)은 인체유래 지방세포로부터 근육세포로의 분화도 가능하다는 것을 보고하였다.
그림 2. 근육조직 분화단계
그러나, 현재까지 근육위성세포에서 근육조직으로의 분화에 대한 기초기술은 연구되어 왔음에도 이를 배양육이라는 형태로 만들기 위해서는 대량생산이 가능한 기술적 기반이 필요하다. 특히 분화단계에 있어서 myotube의 효율적 형성과 형성된 myotube의 연결을 통한 muscle fiber의 형성이 핵심기술로 되어 있다 (Lagelaan et al., 2010).
이에 따라 본 연구에서는 동물로부터 배양육을 배양할 수 있는 근육 줄기세포를 확보하고, 이 줄기세포를 증식 분화하여 근섬유로 분화한 후 이를 통해 근육 형태의 배양육을 생산할 수 있는 기반 기술을 확보하고자
하였다. 이를 위해 단계별 필요한 배지를 확보하고 적용할 뿐 아니라, 이를 이용하여 줄기세포의 증식 및 분화기술을 확보하고, 이를 통해 최종적으로는 배양육으로 활용 가능한 기반 기술을 개발하고자 하였다.
2. 실험방법
2.1. 실험 재료 2.1.1. 재료 및 시약
실험에 사용한 0.2 μm microfilters는 Millipore 제품을 사용하였고, 다양한 disposable sterile plastics 은 범용 제품을 사용하였다. 15 mL conical tubes, 100 mm Petri dishes, 5 mL serological pipettes, 10 mL serological pipettes, 2 mL micro centrifuge tubes, 1,000 μL pipette tips, 10 mL plastic syringes 등이 사용되었다.
그 외 surgical blades는 국산 제품을 사용하였고, 줄기세포 분리를 위하여 40, 70, 100 μm cell strainer는 Corning 제품을 사용하였다.
현미경 관찰을 위하여 microscope slides와 22 x 22 mm slide cover glasses를 사용하였고, blotting paper는 Bio-Rad사 제품을 사용하였다. 그 외 isofluorane, ethanol, bovine serum albumin (BSA), Triton X-100, paraformaldehyde (PFA), sucrose, sodium chloride (NaCl), potassium chloride (KCl), sodium phosphate dibasic (Na2HPO4), potassium phosphate monobasic (KH2PO4), 2-methylbutane 은 Sigma-Aldrich 제품을 사용하였다.
세포배양에 사용한 배지인 DMEM과 fetal bovine serum(FBS), horse serum, Penicillin-Streptomycin 은 Gibco 제품을 사용하였고, 처리 효소인 protease, collagenase는 Sigma-Aldrich 제품을 사용하였다.
형광 염색을 위해 사용된 anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate 등의 항체는 Santa Cruz 제품을 이용하였고, 4’,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) 등은 Invitrogen 제품을 사용하였다.
2.1.2. 도축재료 및 시험동물
실험에 사용한 돈육 및 우육 도축 재료는 시중 도축장에서 도축 당일 확보해서 얼음에 보관하여 실험실로 이동 후 사용하였고, 예비실험을 위한 mouse(BALB/c, 3주령, 수컷)는 나라바이오텍에서 구입하여 사용하였다. 본 실험을 위한 돼지는 새들만농장(예산군위치)에서 출산 직후인 돼지(1일령, 성별무관)를 공수하여 실험을 진행하였다. 구입한 mouse는 사양 chamber에서 23℃에서 12시간 명암 주기로 사육하며 실험에 사용하였고, 돼지 역시 사양 chamber를 33℃에서 유지하며 포유 자돈의 보호방법에 따라 사육하며 2일 내에 실험에 사용하였다.
2.2. 근 위성 세포의 분리 2.2.1. 시약 및 실험기구
먼저 근육으로부터 근 위성세포 분리시에 사용하기 위하여 100X penicillin-streptomycin을 PBS로 1 배 희석하여 1X penicillin-streptomycin PBS (+)를 제조하였고, 최종 농도는 100 U/mL 및 100 ㎍/mL 가 되도록 하였다.
근 위성세포를 배양하기 위한 배지로 DMEM-HG 및 FBS를 4 : 1의 비율로 사용하여 20% FBS 증식 배지(DMEM(20% FBS))를 제조한 다음, 이를 사용 전까지 4℃에서 보관하며 사용하였다. 100X penicillin- streptomycin을 DMEM(20% FBS)으로 1 배 희석하여 DMEM(20% FBS, 1% penicillin-streptomycin) 를 제조하였고, penicillin-streptomycin의 최종 농도는 각각 100 U/mL 및 100 ㎍/mL이 되도록 한 다음 이를 4℃에서 보관하며 사용하였다.
분화 유도 배지로서 2% HS 분화 배지(DMEM(2% Horse serum))을 사용하였고, DMEM-HG 및 HS을 이용하여 50 : 1의 비율에 따라 제조한 다음, 4℃에서 보관 하였다.
조직 분리에 사용한 효소는 1% HEPES (37℃)가 포함된 1 mL의 예열시킨 PBS에 1.5 mg protease (3.5 U/mg)를 넣어 1.5 mg/mL protease(in PBS(1% HEPES))를 제조하였고, 용액을 0.22 μm 필터를 통해 여과 한 다음 –20℃에서 보관하며 사용하였다. Collagenase는 collagenase Ⅺ 1.5 ㎎을 5% FBS를 함유한 DMEM-HG 1 mL에 첨가하여 1.5 mL/mL collagenase Ⅺ(in DMEM(5% FBS))를 제조하고, 0.22μm 필터를 사용해 여과한 뒤 –20℃에서 보관하며 사용하였다.
75% ethanol 100 mL은 100% ethanol 75 mL 및 멸균된 초순수 25 mL를 사용하여 제조하고 부드럽게 혼합한 다음 사용하였고, 기타 메스, 면도날, 포셉, 가위 등은 멸균하여 사용하였고, cell strainer(40, 70, 100 ㎛), 플라스틱 페트리 접시, 폴리프로필렌 원심 튜브 (15, 50 ml), T-플라스크 (T75, T25) 등 소모품은 멸균된 1회용을 사용하였다. 그 외 water bath, 원심 분리기, 인큐베이터, 광학 현미경, confocal microscope 등을 사용하였다.
2.2.2. 근육조직확보 및 근 위성세포 분리
살아있는 동물로부터 근육조직을 확보하기 위하여 동물의 뒷다리모발을 모발제거기로 제거하고, 75%
ethanol로 살균 후, 메스를 이용하여 근육을 해부하였다. 뒷다리에서 분리한 근육조직을 75% ethanol를 이용하여 소독한 뒤 세포배양을 위하여 실험실로 옮긴 뒤 100Φ cell culture dish에서 PBS(1% penicillin- streptomycin)를 이용하여 3~4회 washing하였다. 멸균 소독한 메스를 이용하여 근육조직에 포함된 결합조직 및 지방을 제거한 다음 PBS(1% penicillin-streptomycin, 1% HEPES)에 넣어서 가위로 잘게 잘라주었다. 도축장에서 도축 당일 육재료를 확보한 경우에는 육재료로부터 바로 근육조직을 해체하고, 같은 방법으로 근 위성세포를 분리하였다.
파쇄 된 근육 조각을 15 mL의 폴리프로필렌 원심 분리 튜브로 옮기고 1,000 g에서 5 분간 원심분리하여 상층액과 파쇄 된 근육 pellet을 분리하였다. 이후 상층액을 2000 g에서 다시 5 분간 원심 분리하여 두 번째 pellet을 분취하였다. Pellet의 2~4 배 부피에 해당하는 1.5 mg/mL protease(in PBS(1% HEPES))을 넣어 water bath에서 37℃, 1 시간 동안 침지하였다. 침지된 근육 조각을 5 또는 25 ml 피펫으로 10~15 회 흡입하여 세포를 부드럽게 현탁시키고 다시 200 g에서 5 분간 원심 분리하여 세포 pellet을 함유하는 상층액과 조직 단편 pellet을 분리하였다.
이어서, 상층액을 15 mL의 폴리프로필렌 원심 분리 튜브에 옮기고 2,000 g에서 5 분간 원심 분리하여 세포 pellet을 회수하고, 10 mL의 DMEM(20% FBS, 1% penicillin-streptomycin)으로 회수한 세포 pellet 을 다시 현탁한 다음, 2,000 g에서 10 분간 원심 분리하였다.
그 후, 세포 pellet을 5 mL DMEM(20% FBS, 1% penicillin-streptomycin)으로 재현탁하고, 세포 현탁액을 100 ㎛ 및 70 ㎛ cell strainer로 연속적으로 여과 하였다. 여과된 세포 현탁액을 2,000 g에서 10 분 동안 원심 분리하여 세포 pellet (Pellet I)을 수집하고, 세포 pellet을 다시 1 mL DMEM(20% FBS, 1%
penicillin-streptomycin)으로 재현탁한 다음 얼음상에 유지시켰다.
앞서 얻어진 조직 단편 pellet을 2~4 배 1.5 mL/mL collagenase Ⅺ(in DMEM(5% FBS))으로 1 시간 동안 추가로 분해시켰다. 이후 조직 단편을 25 mL 피펫으로 10~15 회 흡인하여 세포를 부드럽게 해체하고 100 ㎛ cell strainer로 여과 한 후, 여과된 세포 현탁액을 2,000 g에서 5 분간 다시 원심 분리하였다. Pellet을 회수하고, 분리된 상층액을 2,000 g에서 10 분 동안 원심 분리하여 잔류된 세포 pellet을 이전과정에서 회수된 pellet과 혼합하였다. 이후, 혼합된 세포 pellet을 8 mL의 DMEM(20% FBS, 1% penicillin-streptomycin)로 재현탁시켜 10 mL까지 volume up한 다음 이를 폴리프로필렌 원심 분리 튜브로 옮기고 세포 현탁액을 70 ㎛ 세포 여과기로 여과한 다음 2,000 g에서 5 분간 원심 분리하여 세포 pellet(Pellet II)을 수집하였다.
수집한 세포 pellet(Pellet I 및 Pellet II)을 다시 현탁한 다음 15 mL 폴리 프로필렌 원심 분리 튜브에서 혼합하고 2,000 g에서 5 분간 원심 분리하여 pellet을 얻은 다음 PBS(1% penicillin-streptomycin)로 재현탁하였다. 이후 세포 pellet을 수집하기 위해 2,000 g에서 10 분간 원심분리 하였고 세포 pellet을 5 mL DMEM(20% FBS, 1% penicillin-streptomycin)로 현탁한 다음, 세포 현탁액을 40 ㎛ cell strainer로 여과하였다. 여과액을 DMEM(20% FBS, 1% penicillin-streptomycin)을 이용해 10 mL까지 volume up 한 뒤, 700 g에서 10 분간 원심 분리하여 세포 pellet을 회수하였다.
최종적으로 분리한 pellet은 37℃로 예열된 DMEM(20% FBS, 1% penicillin-streptomycin) 10 mL을 이용하여 현탁하였고, 세포 현탁액을 T75 세포 배양 플라스크에 plating 한 후 37℃에서 1 시간 동안 5%
CO2 조건에서 배양하였다. 1 시간 후 부유액을 15 mL의 폴리프로필렌 원심 분리 튜브에 회수한 다음 500 g 에서 10 분 동안 원심분리하여 세포 pellet을 수거하였다. 이를 PBS(1% penicillin-streptomycin) 10 mL 로 재현탁시키고, 500 g에서 10 분 동안 원심 분리하여 skeletal muscle satellite cells을 수집 하였다. 그 후, skeletal muscle satellite cells pellet을 37℃에서 예열된 10 mL의 PBS(1% penicillin-streptomycin) 로 재현탁하여 세포 배양 플라스크에 도말해 37℃, 5% CO2 조건에서 배양 하였다.
2.2.3. muscle satellite cells의 확인
Muscle satellite cells을 확인하기 위해, 배양 세포를 105 cells/well의 밀도로 6-well plate에 도말하고, 70~80%까지 37℃, 5% CO2조건으로 인큐베이터에서 배양하였다. 배양 세포를 이용하여 immuno- fluorescence staining을 수행하여 muscle satellite cells을 확인하였다.
배양된 세포를 PBS로 3 회 세척하고 4% paraformaldehyde으로 실온에서 30 분간 fixation 후, PBS 로 5 분간 3 회 washing 후 0.5% Triton X-100으로 30 분간 투과시켰다. 그 후 다시 PBS(1% BSA)를
1 시간 처리하고 항체 (Santa Cruz Tech, Santa Cruz, CA, USA)를 넣어 실온에서 4 시간 동안 항온 배양 하였다. 이후, DAPI염색을 실온에서 5 분 동안 진행하고, PBS로 5 회 5 분간 washing 후, 공초점현미경을 이용하여 관찰하였다.
2.3. 근 위성세포의 증식
2.3.1. 저장 유무에 따른 증식 속도 비교
분리한 근 위성세포의 증식 정도를 살펴보기 위하여 줄기세포 증식배지를 이용하여 배양하였다. 세포를 같은 량으로 접종한 후 일주일 동안 배양하면서 세포의 증식 정도를 MTT를 변형한 WST 방법을 이용하여 OD 값을 측정하여 비교하였다. WST 방법을 이용한 세포수 측정은 먼저 96 well cell culture plate에 각각 초기 OD가 0.2가 되도록 한 분주한 후 세포를 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. WST assay를 위해 EZ-cytox를 각 well에 10 uL를 넣고 CO2 incubator에서 3 시간 반응시킨 후, 1 분간 부드럽게 shaking 한 다음 microplate reader기를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 상대적인 세포수를 확인하였다.
또한, 동물의 근육에서 바로 분리한 세포와 분리 후 이를 액체질소에 보관하였다가 다시 해동한 세포의 활성을 비교하기 위하여 동일한 농도의 세포를 해동 후 접종한 다음 세포의 증식 정도를 동일한 방법으로 비교하였다.
2.3.2. bFGF 및 ECM의 영향
분리 세포의 증식에 있어서 증식 속도를 증가시키기 위한 방법으로 bFGF와 배양배지 바닥에 깔아서 부착능을 높여주는 extracellular matrix(ECM)에 대한 영향을 살펴보았다.
먼저 일반 근 위성세포의 증식에 사용하였던 (10% FBS, 1% penicillin- streptomycin) 배지를 동일하게 사용하고 여기에 세포성장을 촉진한다고 알려진 bFGF를 1 ng/mL 농도로 처리한 후 3 일간 배양 후 세포의 농도를 WST 방법을 이용하여 동일하게 측정하였다.
또한, 세포 증식에 미치는 ECM의 영향을 살펴보기 위하여 gelatin, collagen, martrigel을 각각 10%
농도로 세포 배양 접시의 바닥에 코팅한 후 동일한 방법으로 근육조직에서 분리한 근 위성세포를 3일간 배양한 후 세포의 농도를 WST 방법을 이용하여 증식속도를 측정하였다.
2.4. 근 위성세포의 분화
2.4.1. 근 위성세포의 분화유도 및 myotube 형성
근 위성세포를 확보한 후 이를 myotube를 형성할 수 있도록 분화 유도하였다. 분화 유도를 위하여 일반적으로 사용되는 배지인 DMEM(10% FBS, 1% penicillin-streptomycin)에 2% horse serum을 첨가하여 근육생성배양액(myogenic media)을 제조하였다. 근 위성세포를 분리하여 증식하던 배지를 근육생성배양액으로 배지를 교체해 준 이후 1 주일 후 myotube의 형성 여부를 형광현미경과 공초점 현미경을 이용하여 관찰하였다.
분화가 유도된 근 위성세포의 myotube의 형성 확인은 myotube에 대한 marker인 myogenin에 대한 항체에 형광염색시약인 Alexa Fluor 488을 부착하여 세포를 염색한 다음 myotube의 형태를 형광관찰 함으로써 확인하였다.
2.4.2. Horse serum의 농도에 의한 myotube 분화 효과
근 위성세포의 myotube 분화를 촉진하기 위하여 일반적으로 사용되는 horse serum을 이용하여 myotube 로의 분화효과를 살펴보고자 하였다. Myotube로의 분화유도 효과가 있다고 알려진 horse serum의 농도를 다르게 처리하여 분화 유도 정도의 차이를 확인하였다. 근 위성세포의 배양 및 증식배지인 DMEM(10%
FBS, 1% penicillin-streptomycin)에 horse serum을 각각 1%, 2%, 5% 농도로 첨가하여 분화유도배지를 제조하였다. 배양 및 증식배지에 배양하고 있던 근 위성세포에 배양 및 증식배지를 제거하고 각각 1%, 2%, 5%의 horse serum이 첨가된 DMEM(10% FBS, 1% penicillin-streptomycin) 분화유도배지로 교체해 준 다음 1 주일 후 myotube의 분화된 비율을 측정하였다.
Myotube의 분화 정도는 cell fusion ratio(%)를 계산하여 측정하였으며, cell fusion ratio(%)의 측정을 위하여 분화된 세포를 각각 DAPI와 myogenin을 타겟으로 하는 Alexa Fluor 488을 염색하였다. 근 위성세포가 myotube로 분화되면 세포는 tube 형성을 위해 fusion이 일어나는데 이 때 fusion의 정도를 cell fusion ratio(%)로 계산하였고, cell fusion ratio(%)는 다음과 같은 계산식으로 계산하였다.
Cell fusion ratio(%) = (No. of nuclei in myotube / No. of total nuclei) X 100
3. 결과 및 고찰
3.1. 근육조직 수집
3.1.1. 도축육으로부터 분리
근육 stem cell인 muscle skeletal satellite cell을 분리하기 위해서는 세포의 제공원이 필요하다.
비교적 쉽게 근육조직을 확보할 수 있는 방법으로 도축장에서 도살된 동물의 근육조직을 얻어서 여기로부터 satellite cell을 분리하고자 하였다.
1시간 이내의 거리에 있는 도축장으로부터 도살한 직후의 소로부터 수시간 내 분리된 도축육을 얻은 다음 이를 75% ethanol로 소독한 후 냉장상태에서 이동하였다. 이동 직후 protocol에 따라 근 위성세포를 분리한 후 배양하였다. 그러나, 도축육으로부터 satellite cell은 분리배양되지 않았으며, 이는 도축 후부터 최대한 빨리 도축육을 얻어 실험실로 이동한다고 하더라도 도살부터 도축까지 일정 시간이 걸리며, 이때 사후 효소작용 등으로 인해 세포가 사멸하기 때문인 것으로 판단되었다.
3.1.2. Mouse 로부터 분리
도축육으로부터 satellite cell의 분리가 어려움에 따라 살아있는 동물에서 직접 근육을 얻은 다음 이로부터 satellite cell의 분리가 가능한지 확인하고자 mouse를 이용하여 분리를 시도하였다(Angelino et al., 2017)
비교적 어린 3주령의 BALB/c 수컷 mouse를 사용하였고, 이는 출생 후에 stem cell의 수와 활성이 비교적 많이 나타나기 때문에 가능한 어린 mouse를 사용하였다(그림 3). 근육세포가 많은 뒷다리를 이용하여 satellite cell의 분리 방법에 따라 분리를 진행하였고, 그 결과 성공적으로 세포를 분리할 수 있었다.
사육 중인 mouse를 ether를 이용하여 마취한 다음, 피부 표면에 있는 모발을 모발제거기와 면도날 등을 이용하여 제거하였다. 초기 오염을 방지하기 위하여 75% ethanol 등을 이용하여 표피를 전부 소독하였으며, 이후 마취상태에서 뒷다리에서 근육조직을 분리하였다. 뒷다리 근육조직이 분리된 mouse는 분리 직후 정맥방혈을 통해 희생시키고, 분리된 근육조직은 antibiotics와 antimycotics가 포함된 용액에 담근 후 바로 실험실로 이송하여 세포 분리를 시작하였다. 도축된 도축육으로부터 세포를 분리했을 때에는 성공하지 못했으나 살아있는 동물로부터 근육조직을 얻어 분리하였을 때는 성공적으로 분리됨으로 인해 도축 후 초기 시간이 세포 회수에 매우 중요한 요인임을 알 수 있었다. 이러한 결과는 근육으로부터 muscle skeletal
satellite cell 분리시 동물의 죽음 후부터 근육조직에서 세포의 회수 시점까지의 시간이 매우 큰 영향을 준다는 것을 의미한다.
그림 3. Mouse를 이용한 근육 조직 분리
3.1.3. 돼지로부터 분리
배양육을 만들기 위해서는 식육 가능한 동물로부터 satellite cell의 분리가 필요하므로 mouse로부터의 결과를 바탕으로 돼지에서 세포를 분리하였다. 살아있는 상태에서의 근육조직을 제공할 수 있는 식용 동물이 필요한데, 소의 경우에는 살아 있는 상태에서 근육조직을 확보하는 것이 매우 어려우므로 돼지를 대상으로 세포 분리를 시도하였다. 또한, 어린 돼지일수록 근육 조직량은 적으나 근육 조직내의 줄기세포의 수와 활성은 더 높으므로 가능한 어린 돼지를 사용하여 세포를 분리하고자 하였다. 특히 돼지는 분만시 다수의 자돈을 출산하나 사육농장에서는 체중이나 생체징후가 떨어지는 개체는 수익성이 없어 폐사시키므로 이러한 폐사 대상 포유자돈을 이용하여 실험을 진행하였다.
돼지는 인근의 농장에서 확보하였고, 모돈에서 출산이 예정된 날에 미리 대기하고 있다가 출산 후 폐사대상으로 확정된 자돈을 cage에 넣고 이송한 다음 사육 chamber에서 포유자돈의 사양조건에 맞춰 안정화시킨 후 2일 내에 실험에 사용하였다. Mouse와 같은 방식으로 마취한 후 마취상태에서, 피부 표면에
있는 모발을 모발제거기와 면도날 등을 이용하여 제거하였다(그림 4). 초기 오염을 방지하기 위하여 75%
ethanol 등을 이용하여 표피를 전부 소독하였으며, 이후 마취상태에서 뒷다리에서 근육조직을 분리하였다 (그림 5). 뒷다리 근육조직이 분리된 돼지는 mouse와 마찬가지로 분리 직후 정맥방혈을 통해 희생시키고, 분리된 근육조직은 antibiotics와 antimycotics가 포함된 용액에 담근 후 바로 실험실로 이송하여 세포 분리를 시작하였다.
그림 4. 포유자돈으로부터 근육조직 분리를 위한 마취 및 모발제거
Mouse와 마찬가지로 돼지를 이용했을 때에도 성공적으로 satellite cell을 분리할 수 있었으며, 다만 출생 초기의 1~2일령의 포유자돈이라 근육량이 다소 적어 세포의 분리량이 적게 회수되었다. 이를 통해 돼지의 satellite cell을 확보하였고, 이후 이들 세포를 활용하여 분화 실험 등을 진행하였다.
그림 5. 포유자돈으로부터 뒷다리 근육조직 분리
3.2. 근 위성세포 분리 protocol 확립 3.2.1. 근 위성세포 분리
근 위성세포의 분리방법은 기본적으로 효소처리와 부착능의 차이를 이용한 분리방법을 이용하여 진행하였다(그림 6). Musaro et al.(2010)은 mouse로부터 근 위성세포를 분리할 때 Percoll, FACS 등의 방법과 pre-plating을 이용한 부착능의 차이를 활용한 방법 등을 제시하였고, 효소처리와 pre-plating 방법을 통하여 근 위성세포의 분리가 가능함을 보여주었다. 이러한 방법을 고려하여 근 위성세포의 분리방법을 확립하였고, 전술한 실험방법에 따라 분리한 근육조직을 이용하여 satellite cell을 분리하였다.
먼저 근육조직을 75% ethanol로 살균한 상태에서 지방 및 결합조직을 제거하였다. 이후 멸균된 가위를 이용하여 근육조직을 잘게 잘라주어 작은 세포 덩어리가 되도록 한 후 효소처리를 통하여 단세포가 되도록 처리하였다. 조직으로 되어 있는 세포 덩어리를 단세포로 만들기 위하여 몇가지 효소를 처리하였으며, 주로 세포간 결합을 유지하고 있는 ECM에 영향을 줄 수 있는 protease, collagense VI를 이용하여 세포간 결합을 분리시켰다. 덩어리진 세포를 제거하기 위하여 100, 70, 40 ㎛의 strainer를 이용하여 단세포 형태가 되지 않은 덩어리를 제거하였고, 이 후 수차례의 원심분리와 재현탁을 반복하여 단세포로 분해된 세포들만 회수하였다.
그림 6. 돼지 근 위성세포 분리 scheme
회수한 세포들은 섬유아세포와 skeletal muscle satellite cells이 혼재되어 있는 상태이므로 여기에서 skeletal muscle satellite cells만 분리하기 위하여 T75 플라스크에 배양한 1시간 후에 분리작업을 실시하였다. 섬유아세포와 skeletal muscle satellite cells은 배양 특성이 달라 T75 배양 플라스크에 배양할 때, 섬유아세포는 세포 배양 플라스크의 바닥에 빠르게 부착되는 반면, skeletal muscle satellite cells은 부착 속도가 느려 여전히 부유액에 남아있게 된다. 이러한 원리를 이용하여 skeletal muscle satellite cells 을 분리하였고 근위성세포의 분리 protocol을 확립하고 이후 실험에 사용하였다. 회수한 skeletal muscle satellite cells을 배양하기 위한 배지로는 DMEM을 사용하는 것 외에도 F-10 배지에 20% FBS를 첨가하여 사용하는 경우도 있어 초기 근 위성세포의 분리에 사용되는 배지는 줄기세포의 배양에 적합한 배지는 모두 대체적으로 사용 가능할 것으로 보인다(Hindi et al., 2017).
(A) Stem cell at day 0 (B) 섬유아세포 at day 0
(C) Stem cell at day 2 (D) 섬유아세포 at day 2
(E) Stem cell at day 7 (F) 섬유아세포 at day 7
그림 7. 분리한 세포의 배양 양상
3.2.2. 분리한 세포의 배양 양상
세포의 양상을 확인하기 위하여 동일한 조직에서 stem cell과 섬유아세포로 추정되는 세포를 분리한 다음 배양 상태를 비교하였다. 세포 분리 후 배양 초기에는 순수한 단일세포 외에도 죽은 세포 등 다양한 이물질이 발견되었는데, 이는 근육 조직에서 다양한 효소 처리와 더불어 여러번의 원심분리 및 재현탁 과정으로 인해 상당수의 세포들의 영향을 받아 사멸하였기 때문인 것으로 판단되었다. Stem cell과 섬유아세포의 배양 양상은 다소 다르게 나타났으나, 육안으로 확연히 구별하기에는 어려웠다. 세포 분리 후 배양 초기부터 1 주일간 세포 배양 양상을 관찰한 결과, 배양 2일 후 및 배양 1주일 후 확인한 세포의 양상은 그림 7와 같으며, 분리한 세포가 잘 증식하고 있음을 확인할 수 있었다. 다만 전체적으로 섬유아세포의 증식 속도가 stem cell 에 비해 다소 빠름을 알 수 있었는데, 이는 배양 세포의 배지 및 세포의 적응능 등이 다르게 나타나기 때문인 것으로 판단되었다.
3.2.3. 분리한 근위성세포의 순도
일반적으로 skeletal muscle satellite cells을 분리하는 방법에는 세포 표면에 있는 CD marker를 이용하여 이에 대한 항체를 이용하는 방법이 있다. 이것은 주로 flow cytometry를 이용한 FACS 분리방법에 주로 사용되고, 이 외에 magnet을 이용한 MACS 기술에 이용되기도 한다. 실제 Montarras et al.(2005) 는 mouse에서 Pax7+, CD34+, CD45–, Sca1– marker를 이용하여 FACS를 이용한 skeletal muscle satellite cells을 고순도로 분리하는 방법을 보고하였고, Motohashi et al.(2014)은 MACS를 이용하여 mouse skeletal muscle satellite cells을 고순도로 분리하는 방법을 보고하였다. 이러한 방법은 특정 세포의 분리율은 90% 이상으로 매우 높게 유지되나 고가의 기계 장치를 이용하는 등의 여러 단점이 있다.
반면 여러번의 원심분리 및 세포 재현탁과 부착능을 이용한 분리 방법은 여러 단계를 거치는 동안 세포를 소실할 가능성이 높고, 또한 분리된 세포가 다른 종류의 세포, 특히 섬유아세포와 같이 섞일 가능성이 있어 비교적 순도가 낮은 단점을 가지고 있다. 그러나, 최근 여러 보고들은 FACS나 MACS를 사용하지 않고 근위성세포를 분리하였는데, Li et al.(2015)는 돼지에서 근 위성세포를 분리하는 방법을 보고하였으며, Hindi et al.(2017)은 mouse에서 유사한 방법으로 근 위성세포를 분리하였다고 보고하였다. 본 연구에서도 이러한 방법으로 근 위성세포의 분리방법을 확립하였고, 따라서 확립한 방법으로 분리한 skeletal muscle satellite cells이 다른 종류의 세포와 얼마나 순도를 유지하고 있는지 확인할 필요가 있다.
분리한 세포의 순도를 확인하기 위하여 immuno-fluorescence staining을 이용하여 분리 세포 중 skeletal muscle satellite cells의 수가 얼마나 되는지 확인하였다. Skeletal muscle satellite cells은
근육세포를 만드는 줄기세포인 myoblast로 작용하며, 이에 대한 주요한 marker는 Pax 3, Pax 7, Myo D 등이 있다(Ding et al., 2017). 이 중 Pax 7를 marker로 하여 Alexa Fluor 488로 형광염색하여 skeletal muscle satellite cells을 확인하였고, DAPI 염색을 통하여 모든 세포를 염색하였다(그림 8). 염색 결과 DAPI는 푸른색으로 모든 세포에 염색되었고, Alexa Fluor 488은 초록색으로 Pax 7 marker가 있는 세포 표면에 염색되어 이를 공초점 현미경과 형광 현미경을 이용하여 관찰하였다. 다만 사진 촬영시 초록 형광색은 푸른색보다 다소 연하게 촬영되었다.
그림 8. Skeletal muscle satellite cells의 형광 염색 결과 Green; Pax 7, Blue; DAPI
핵이 있는 모든 세포는 DAPI 염색이 이루어지므로 전체 세포의 수 대비 Pax 7이 염색된 세포의 수를 비교하여 분리된 세포의 순도를 측정하였다. 대체로 대부분의 세포가 DAPI와 Pax 7에 대해 공통으로 염색되었으며, 2회 반복 실험한 결과 각각 78.2%, 84.3%의 순도를 나타내어 평균 80% 이상의 분리 순도를 나타내었다(그림 9). 이러한 결과는 확립된 protocol로 근 위성세포를 분리하였을 때 분리된 세포의 80%
이상이 근 위성세포임을 의미하며, FACS나 MACS를 사용한 결과보다는 낮지만 세포분리 후 배양실험을 진행하는 데는 크게 영향을 주지 않을 것으로 판단되었다.
그림 9. 분리한 근위성세포의 순도
3.3. 근 위성세포의 증식
3.3.1. 저장 유무에 따른 증식 속도 비교
분리한 근 위성세포의 증식속도를 측정하기 위하여 WST 방법을 이용하여 세포의 증식 정도를 측정하였다 (그림 10). WST 방법을 이용하여 근 위성세포의 증식 정도를 확인한 결과 근육 조직에서 분리한 세포를 바로 증식했을 때에는 세포는 정상적인 증식 속도를 나타내며, 초기 접종 농도 OD 0.2에서 1 주일 후 OD가 1.5 내외까지 증식하였다(그림 11). 이러한 결과는 유사한 실험 방법을 통해 돼지에서 분리한 근 위성세포를 증식하였을 때, OD 0.1로 접종 한 다음 1 주일 후 OD 0.7까지 증식한 보고와 유사한 결과이다(Li et al., 2015). 본 실험에서는 OD 0.2로 접종하였으나 기존 보고에서 0.1로 접종하여 직접적인 증식효율을 비교하기는 어려우나 접종농도와 최종농도를 고려하면 거의 유사한 증식속도를 나타내는 것을 알 수 있다.
그림 10. WST를 이용한 세포 증식 측정
그러나, 액체질소에서 한번 저장되었다가 해동된 세포의 경우에는 증식 속도가 상대적으로 낮아지는 경향을 나타내었다. 동일한 농도인 OD 0.2에서 접종하였음에도 불구하고, 액체질소에 저장되었던 세포는 2 일째에 세포 성장이 거의 이루어지지 않는 것처럼 나타났고, 이러한 영향으로 인해 4 일째, 7 일째에도 바로 분리하여 배양한 세포에 비해 증식속도가 약 65% 정도로 낮은 성장속도를 나타내었다. 세포 배양 7 일째의 OD는 0.96으로 나타났는데, 이는 바로 분리하여 배양한 세포가 OD 1.47을 나타낸 데 비해 매우 낮은 값이다.
이러한 이유는 줄기세포를 바로 분리하여 배양하였을 때에는 세포의 활성이 비교적 높은 상태로 증식이 잘 이루어지나 분리한 줄기세포를 액체질소에 냉동 후 다시 해동했을 때에는 냉동 및 해동 과정에서 세포에 손상이 가해져 일부 세포가 죽거나 손상된 세포의 회복 과정이 필요하여 이로 인해 증식속도가 느리게 나타난 것으로 보인다.
그림 11. 분리한 근 위성세포의 증식 비교
3.3.2. bFGF 및 ECM의 영향
근 위성세포 분리 후 세포증식을 촉진하기 위하여 배지에 bFGF를 처리한 후 WST로 세포의 량을 비교하였다. 기존에 사용하던 DMEM 배지를 그대로 사용할 경우 3일 후 약 0.47의 OD 값을 나타내었으나, 여기에 bFGF를 첨가하였을 경우 OD 값이 0.57로 증가한 값을 나타내었다(그림 12). 이러한 결과는 bFGF 첨가 전보다 첨가 후에 세포의 성장이 약 21%가 증가한 결과이며, 이는 다른 줄기세포나 일반 세포의 배양결과와 유사한 결과로서 bFGF가 근 위성세포의 증식에도 동일하게 영향을 끼치며, 세포증식을 촉진하는 것을 알 수 있었다.
한편 근 위성세포의 증식에 있어서 ECM의 영향을 살펴보기 위하여 세포의 배양배지 바닥에 gelatin, martrigel, collagen을 깐 후 동일한 방법으로 분리한 근 위성세포를 배양한 후 WST 방법을 이용하여 증식 정도를 비교하였다.
그림 12. 근 위성세포 증식에 미치는 bFGF의 영향
3일 후 WST로 세포의 농도를 측정하였을 때 아무것도 처리하지 않은 기존방법으로 배양했을 때는 0.48 의 OD 값을 나타내었으나, gelatin, martrigel, collagen을 깐 배지에서는 각각 0.52, 0.62, 0.56의 값을 나타내어 모두 아무것도 처리하지 않은 방법보다 더 높은 값을 나타내었다(그림 13). 이러한 결과는 gelatin 등 세포의 부착에 영향을 주는 물질들이 근 위성세포의 배양에 있어서도 동일하게 영향을 주어 세포의 증식을 촉진하기 때문인 것으로 판단된다. 특히 3 종류의 ECM을 비교한 결과 martrigel이 가장 좋은 결과를 나타내었는데 이는 아무것도 처리하지 않은 방법에 비해 약 29%의 세포증식이 촉진된 것으로 매우 큰 효과를 나타내었다. Danoviz et al.(2012)는 mouse에서 skeletal muscle satellite cell을 분리한 후 배양접시에 matrix를 martrigel과 gelatin을 코팅하여 비교하였는데, 이 때 gelatin보다 martrigel이 훨씬 좋은 결과를 나타내었고, 이로 보아 martrigel이 세포의 증식 뿐 아니라 분화에도 영향을 미치는 것으로 보고한 바 있다.
본 연구에서도 martrigel로 코팅했을 때 gelatin보다 우수한 결과를 나타내었으며, 그 외에도 collagen을 코팅한 경우에도 17%의 세포 증식이 촉진된 것으로 나타나 비교적 효과적인 결과를 나타내었다.
그림 13. 근 위성세포 증식에 미치는 matrix의 영향
3.4. 근 위성세포의 분화
3.4.1. 근 위성세포의 분화유도 및 myotube 형성
근육조직에서 분리한 근 위성세포를 일반 배양배지에서 배양 및 증식시키다가 배지교체를 통하여 분화를 유도하였다. DMEM(10% FBS, 1% penicillin- streptomycin)에 2% horse serum을 첨가하여 만든 근육생성배양액(myogenic media)으로 배지를 교체한 다음 1 주일 후 세포의 분화 형태를 DAPI 및 Alexa 488 형광염색시약을 이용하여 확인하였다.
먼저 근 위성세포를 분리하여 배양 한 다음 근육생성배양액을 첨가하기 전 형광염색을 한 후 세포를 관찰한 결과 DAPI로 염색한 세포들은 핵을 중심으로 파란색으로 관찰되었고, 같은 세포들을 대상으로 Pax 7 항체가 연결된 Alexa Fluor 488로 염색한 결과 대부분의 세포가 초록색으로 관찰되었다(그림 14). 이러한 결과는 myotube 분화를 유도하고자 한 대부분의 세포가 근 위성세포임을 나타내는 것임을 알 수 있다.
이러한 세포를 이용하여 분화유도배지를 이용하여 분화유도를 한 다음 1 주일 후 형광염색시약을 이용하여 염색하여 형광현미경으로 관찰한 결과 많은 세포가 fusion 현상을 일으켜 myotube를 형성한
것을 확인할 수 있었다. Myotube에 대한 형광염색 marker는 일반적으로 알려진 myogenin, MyHC, mrf4 중에서 myogenin을 선택하여 myogenin에 대한 항체를 초록색 형광염료인 Alexa Fluor 488과 결합시켜 관찰함으로써 myotube의 형성이 유도되었는지 확인하였고, 결과적으로 제조한 근육생성배양액이 근 위성세포로부터 myotube를 성공적으로 분화시켰다는 것을 알 수 있었다.
(a) 분화전 근 위성세포, DAPI 염색
(b) 분화전 근 위성세포, Pax 7 Alexa 488 염색
(c) 분화후 myotube, Myogenin Alexa 488 염색
그림 14. 근 위성세포의 myotube 분화
3.4.2. Horse serum의 농도에 의한 myotube 분화 효과
근 위성세포로부터 myotube의 분화를 유도할 때 사용되는 horse serum의 농도에 따라 분화 정도가 달라질 것으로 예상됨에 따라 horse serum의 농도에 따른 myotube 분화 효과를 측정하였다. 각각 1%, 2%, 5%의 horse serum이 첨가된 분화배지에서 1 주일 동안 배양하면서 분화를 유도한 다음 myotube의 형성 정도를 비교하였다.
근 위성세포는 myotube로 분화됨에 따라 여러 세포가 fusion되어 하나의 tube를 형성하게 되는데, 이 때 한 개의 tube 내에 여러 개의 핵이 존재하는 fusion 현상을 나타낸다. 따라서, 분화가 많이 일어날수록 한 개의 tube 내에 여러 개의 핵이 존재하게 되고, 한 개의 세포에 한 개의 핵만 존재하는 형태는 줄어들게 된다.
이 때 전체세포의 핵 대비 fusion 된 세포 내의 핵 수를 백분율로 나타내면 myotube의 분화정도를 나타낼 수 있고, 이를 cell fusion ratio(%)로 표현하였다. Cell fusion ratio(%)의 측정을 위하여 핵의 총 개수는 DAPI 염색을 통하여 측정하였고, myotube는 anti-myogenin Alexa Fluor 488을 이용하여 확인한 다음 myotube 내에 있는 핵의 개수를 측정하여 계산하였다.
그림 15. Horse serum 농도에 따른 myotube 분화 정도
분화유도물질이 포함된 것으로 알려진 horse serum을 사용했을 때 1%를 첨가한 배지에서는 myotube 분화가 매우 저조하게 일어나 대략 35% 정도의 세포만 fusion을 일으켜 myotube를 형성하였다. Horse
serum을 2%와 5%를 사용했을 때에는 분화유도효과가 크게 차이나지 않았는데, 2% horse serum 처리에서는 약 74%의 분화효율을 나타내었고, 5% horse serum을 처리했을 때에는 약 69%의 분화효율을 나타내었다(
그림 15). 따라서, 2%와 5%의 분화유도 효과는 큰 차이가 없었으며, 오히려 2%의 horse serum을 처리했을 때에 분화효과가 더 큰 것을 알 수 있었다.
한편 Park et al.(2014)은 돼지 근육에서 분리한 근 위성세포를 분화유도한 후 세포의 분화정도(fusion index)를 분석한 결과 분화율이 대략 60%가 되는 것을 확인하였는데, 이러한 결과보다는 좀 더 높은 분화율을 나타낸 것으로 판단되었다. Ostrovidov et al.(2014)는 동물의 myogenesis에 있어서 영향을 주는 다양한 단백질 인자들을 제시한 바 있는데, horse serum에 이러한 분화유도인자가 많이 포함되어 있기 때문에 myotube 분화가 촉진되는 것으로 보이며, 그 외에도 전자기적 인자나 기계적 인자도 유도인자가 될 수 있다고 하였다.
3.5. 배양육 형성 및 관찰
돼지의 근 위성세포를 분리하여 배양 증식한 후 분화유도배지를 이용하여 myotube 및 myofibril의 형성을 확인한 후 이들 세포가 뭉쳐져서 fiber를 형성하고 고기형태를 이루는 것을 육안으로 확인하고자 하였다.
가장 작은 덩어리 형태라도 육안 관찰 여부를 확인하고자 하였으나, marker를 이용한 현미경 관찰에서는 대부분의 세포가 myofibril을 형성하는 것을 확인하였음에도 불구하고 덩어리 형태의 육안관찰은 어려웠다.
근육이 아닌 고기로서의 특성을 확인하고 이미지로 확보하는 것이 중요하지만 실제 대부분의 배양육 형성에 대한 이미지는 근육 특성에 대한 세포 수준에서의 특성으로 제시된다(Stephens et al., 2016). 이렇게 현미경에서는 관찰되었지만 육안으로는 관찰되기 어려운 이유는 배양 세포수가 너무 적기 때문에 나타난 현상으로 보인다. 또한, myofiber 형성 후에도 이들이 응집하여 완전한 덩어리 형태로 나타나기 위해서는 추가적인 배양 시간이 필요한 것으로 판단된다.
그러나, myofiber의 형성은 확인하였으므로 완전한 덩어리 형태의 고기가 아니라 하더라도 고기의 단백질 성분은 배양 및 분화를 통하여 얻는 것이 가능할 것으로 사료된다. 또한 이를 통하여 완전한 고기 형태가 아닌 고기 성분의 생산을 통한 산업화 기술 개발도 가능할 것으로 판단된다.
4. 요약
동물의 줄기세포를 이용하여 배양육을 얻을 수 있는 기본 기술을 확보하기 위하여 동물의 근육 조직으로부터 근육의 줄기세포인 근 위성세포를 분리하고자 하였다. 도축육으로부터 근 위성세포의 분리는 도축 후 세포분리까지 소요되는 시간이 길어짐에 따라 성공적으로 분리할 수 없었고, 살아있는 동물의 근육으로부터 근 위성세포를 분리하였다. 먼저 mouse의 뒷다리 근육조직에서 근 위성세포를 분리한 다음 식용 가능한 돼지에서 동일한 방법으로 근 위성세포를 분리하여 근 위성세포 분리 방법을 확립하였다.
돼지는 출생 당일의 포유자돈을 이용하였고, 물리적 분해 및 효소처리 등으로 근육조직으로부터 세포를 단세포로 분해하여 cell strainer로 여과한 후 배양접시 바닥에 부착 성질의 차이를 이용하여 섬유아세포와 분리하였다. 확립된 방법으로 분리한 근 위성세포의 순도를 marker를 이용하여 형광염색하여 관찰한 결과 순도는 약 80% 내외였으며, 저장 후 해동한 세포의 증식 속도는 저장 전의 세포에 비해 약 65%까지 낮아짐을 확인하였다. 배양배지에 bFGF를 첨가함으로써 증식속도가 약 21% 증가하였고, 배양접시 바닥에 matrix를 깔았을 때 세포증식이 증가하였으며, 특히 martrigel을 깔았을 때는 29%까지 세포증식이 증가함을 알 수 있었다. 분리된 근 위성세포를 horse serum이 포함된 분화배지를 이용하여 myotube가 형성됨을 marker 에 대한 형광염색을 통하여 확인하였고, horse serum의 농도를 2% 첨가하였을 때 분화 효율이 가장 높게 나타남을 알 수 있었다. 결론적으로 동물의 근육조직을 이용하여 근 위성세포를 분리하고 증식 분화함으로써 고기의 근육조직에 해당하는 myofiber로 분화할 수 있는 기초기술을 확립하였고, 이러한 기술은 추후 배양육의 개발 뿐 아니라 고기의 성분 생산을 통한 산업화에도 유용하게 사용될 수 있을 것으로 사료된다.
5. 참고문헌
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