사랑과 열정으로 더불어 함께 하는 세상 만들기 - 율촌재단(栗村財團)

전체 글

(1)신규 탄수화물인 cycloamylose의 건강기능성 포접복합체 형성능 규명. 김용노 서울대학교 바이오시스템·소재학부. 1. 서 론 Cycloamylose(Large-ring cyclodextrin)는 disproportionating enzyme에 의해 생산된 DP17 이상의 중 합도를 갖는 cyclic-α-1,4 glucan이다. 현재 potato D-enzyme, glucanotransferase, amylomaltase와 같 은 효소에 의해 아밀로오스로부터 생산되고 있다. 하지만 본 연구에서는 내열성 균주를 이용한 intra-molecular transglycosylation(cyclization)을 촉매하여 cycloamylose를 생산하고자 한다. 이러한 cycloamylose는 cyclodextrin보다 수용액 중에서 분자들 간의 회합으로 인한 침전이 적어 안정적인 colloid를 형성하여 매우 높은 solubility를 지니며, 물에 대한 용해도가 높기 때문에 보다 안정적인 inclusion complex 형성능을 지닌 새로운 nano-carrier이다. 하지만 현재 분자구조 수준에서의 특성 이 제한적으로 연구되어 있고 구조 분석 및 기능성 물질 복합체 형성에 관한 연구는 활발히 이루 어지지 못하고 있는 실정이다. cycloamylose와 기능성 물질과의 복합체를 형성하면 용해도 증가, 이취 감소, 안정성 증가, 취급의 편리성 증가 등 특성이 월등히 개선된 기능성 소재를 생산할 수 있을 것으로 기대하고 있다. Cycloamylose는 다양한 중합도를 가진 cyclic-α-1,4 glucan으로 혼합되어 있어 현재 각 DP별로 분리하여 구조를 분석하고 inclusion complex 형성능을 규명하는 연구에도 관심이 모아지고 있다. 하지만 cycloamylose를 각 DP별로 분리하는 기술과 분석법이 어려워 연구에 많은 어려움이 있다. 따라서 본 연구에서는 생산한 cycloamylose의 이화학적 특성 및 복합체 형성능을 확인하고, 각 DP별로 cyclicα-(1→4)-glucan을 분리하여 surfactant와의 포접 복합체 형성 기작 및 열역학적 특성 을 알아보고자 한다.. 97. 김용노.indd 97. 2010-04-16 오후 5:14:38.

(2) 2. 연구방법 2.1 Cycloamylose의 효소적 제조와 분리·정제 4-α-glucanotransferase의 분리 및 정제 Cycloamylose 제조를 위한 효소 생산을 위해 내열성 균주인 Thermus aquaticus로부터 분리한 내 열성 4-α-glucanotransferase(이하 TAαGTase) 유전자를 사용였으며, 유전자는 서울대학교 식 품공학과 효소공학실(박관화 교수님)에서 분양받아 사용하였다. 분리한 유전자는 E. coli로 transformation하여 효소를 생산·정제하였다. 5mL LB 액체배지에 숙주 세포인 E. coli MC1061을 접 종하여 37℃에서 12시간 배양하고, 배양액 1.0mL를 새로운 LB 액체 배지 50mL에 접종하여 600nm 에서 흡광도가 0.5가 될 때까지 배양하였다. 선별된 균주의 DNA를 42℃에서 2분간 열충격을 주어 transformation한 후 37℃에서 12시간 배 양하고, 원심분리하여 균체를 수득하였다. 회수한 균체는 Lysis 용액에 현탁한 후 초음파 분쇄하 였으며 원심분리하여 상등액을 수득하였다. 상등액은 Ni-NTA affinity column에 주입하여 정제 하였다. 정제 후 SDS-PAGE를 수행하여 정제도를 확인하였고 역가를 측정하였다.. Enyme 역가 측정 역가 측정을 위해 50mM Tris-HCl(pH 7.5) 600µL와 동일 완충용액에 용해된 0.2% 아밀로오스 기 질 용액 250µL를 넣고, 50% 말토오스 용액 50µL를 첨가한 후, 분리 정제한 효소 100µL를 넣어 75℃에서 10분간 반응시킨 후, lugol’ s solution을 넣어 반응정지 및 발색을 하여 620nm에서 흡광 도를 측정하였다. 흡광도는 아밀로오스 표준곡선과 비교하여 1분당 1mg/mL의 아밀로오스가 줄어들 때의 효소량을 1Unit으로 정하였다. 단백질 정량은 Bradford method를 사용하였다.. Cycloamylose 생산 90% DMSO에 2%의 아밀로오스를 넣고 완전히 용해시킨 후 50mM Tris-Hcl buffer(pH 7.5)를 가 하여 최종농도가 0.5%가 되게 한 후 30분간 충분히 교반하였다. TAαGTase(0.1U/mg)를 가하여 70℃에서 12시간 동안 반응시킨 후, 100℃에서 10분간 처리하여 효소반응을 정지시켰다. 생산된 cycloamylose를 분리하기 위하여 반응액에 β-amylase(20U/g)를 가한 후, 37℃에서 8시간 반응시켜 non-cyclic glucan이나 maltose 단위의 잔가지를 제거한 다음, 100℃에서 10분간 처리하여 효소반응 을 정지시켰다. 그 후 10배가량의 에탄올을 처리하여 원심분리하여 순수한 cycloamylose를 분리 한 후 적당량의 증류수를 가한 후 동결건조시켜 cycloamylose powder를 생산하였다.. 98. 김용노.indd 98. 2010-04-16 오후 5:14:38.

(3) 2.2 Cycloamylose의 이화학적 특성 규명 HPAEC를 이용한 중합도 측정 HPAEC(high performance anion exchange chromatography)를 이용하여 생산된 cycloamylose의 중 합도를 분석하였다. Column은 CarboPacTM PA-1 column(4.0×250mm, DIONEX, USA)을 사용하 였으며 150mM NaOH와 600mM sodium acetate를 gradient로 이동상을 걸어주어 분당 1.0mL의 유 속으로 흘려 분리하였다(표 1). Detector는 pulsed amperometric detector(ED40, DIONEX)를 사용 하여 분석하였다. 샘플은 0.5%의 농도로 150mM NaOH에 녹인 다음 0.45µm 필터를 이용하여 필 터한 후 사용하였다. 표 1 HPAEC solvent gradient condition for the molecular weight distribution of cycloamylose from anion exchange chromatography Time (min). Solvent Composition (%) Buffer Aa. Buffer Bb. 0c. 90. 10. 10. 70. 30. 16. 60. 40. 27. 50. 50. 44. 40. 60. 63. 35. 65. 70. 34. 66. 70.01. 0. 100. 75. 0. 100. 75.01. 100. 0. 80. 100. 0. 80.01. 90. 10. a. 150mM NaOH in water.. b. 600mM sodium acetate in 150mM NaOH.. c. Gradient or buffer B from 0 to 100%.. MALDI-TOF를 이용한 분자량 측정 생산된 cycloamylose의 분자량 스펙트럼을 분석하기 위하여 MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight) mass spectrometer(VoyagerTM-DE STR, Applied Biosystem, Framingham, USA)를 사용하였다. 샘플에 매트릭스(2,5-dihydroxybenzoic acid, 10mg/mL)를 혼합. 신규 탄수화물인 cycloamylose의 건강기능성 포접복합체 형성능 규명. 김용노.indd 99. 99. 2010-04-16 오후 5:14:38.

(4) 하고 probe tip에 desorbtion /ionization시켜 분석하였다(Grid voltage; 65, Grid wire voltage: 0, Delayed extraction: 150 nsec, and Laser: 2000).. Iodine absorption spectra Iodine absorption을 이용하여 cycloamylose의 complex 형성능을 측정하였다. Sample은 90% DMSO 에 완전히 녹여 최종 농도가 0.5%가 되게 한 후 증류수로 50배 희석하여 사용하였다. 1mL의 희석 액에 30µL Iodine solution을 가하여 완전히 섞은 후 5분 후 400에서 800nm까지 흡광도를 scanning 하였다. λmax는 최대 흡광도를 보이는 범위를 나타내었다.. 2.3 HPLC를 이용한 Cycloamylose의 중합도별 분리 Cycloamylose를 중합도별로 분리하기 위하여 Sunf ire TMC18 column(waters Co., Milf ord, Massachusetts, Ireland)을 사용하여 Prep-HPLC(High performance liquid chromatography)를 이용하 여 분획하였다. 우선 semi-preparative HPLC를 사용하여 분석조건을 최적화한 후 scale-up하여 분 획하였다. 분석조건은 표 2에 나타내었다. 표 2 Condition of HPLC for the fractionation of cycloamylose Instrument Detecter. Semi-preparative HPLC. Scale-up HPLC. Prostar 210 Pump. Waters 600 Pump. Prostar 355 differential refractive. Waters 410 diffrerential. index detector. refractive index detector. Column. Sunfire C18 (5µm, 4.6×250mm). SunfireTMC18 (10µm, 30×150mm). Eluent buffer. 4% (vol/vol) methanol. 4% (vol/vol) methanol. 100µL. 10mL. 0.5mL/min. 20mL/min. Injection Volume Flow rate. TM. 2.4 Cycloamylose-Surfactant 복합체 형성 기작 및 열역학적 특성 규명 Solution preparation cycloamylose와 서로 다른 DP를 가진 cyclic α-(1→4)-glucan(α-CD, β-CD, CA26, CA38)은 20mM Trizma(pH 7, containing 10mM NaCl)에 녹인 후 상온에서 1시간 동안 교반하여 사용하였 고, C12 nonpolar tail group을 가진 3가지 surfactant인 SDS(sodium dodecyl sulfate), DTAB(dodecyl. 100. 김용노.indd 100. 2010-04-16 오후 5:14:38.

(5) trimethylammonium bromide), Brij35(polyoxyethylene 23 lauryl ether) 역시 동일한 버퍼 용액에 녹여 충분히 교반하였다. 조건변화에 따른 cycloamylose-surfactant interaction 변화 분석을 위하여 온도는 각각 10, 25, 50℃의 변화를 주었고, pH는 3, 5, 7 그리고 염농도는 0, 10, 100mM NaCl로 버퍼 용액의 변화를 주 어 측정하였다.. Isothermal Titration Calorimetry (ITC) Cycloamylose와 ligand인 surfactant의 titration 결과 엔탈피 변화를 측정하기 위하여 isothermal titration calorimeter(VP-ITC, Microcal, Inc., Northampton, MA)를 사용하였다. 1.48mL 샘플에 35mM SDS, 100mM DTAB, 8mM Brij35 solution을 각각 10µL씩 titration하여 엔탈피 변화를 측 정하였다. 각 injection은 20초 동안 유지하였으며 연속적인 injection에서 간격은 5분으로 하였 다. Syringe의 stirring speed는 310rpm으로 하여 reaction cell 안의 solution을 교반하였으며 모든 solution은 측정 전 degassing하여 사용하였다. Titration cell 안의 용액 온도는 25℃, pH는 7로 조정 하였으며, reference로는 샘플 대신 buffer를 사용하였다.. Cooling plates Jacket main. Reference offset Reference main. Jacket feedback. CFB Sample main. Adiabatic Jacket Dry air. Diagram of Isothermal Titration Calorimeter. 신규 탄수화물인 cycloamylose의 건강기능성 포접복합체 형성능 규명. 김용노.indd 101. 101. 2010-04-16 오후 5:14:39.

(6) 3. 결과 및 고찰 3.1 Cycloamylose의 효소적 제조와 분리·정제 4-α-glucanotransferase의 분리 및 정제 Cycloamylose 제조를 위한 효소 생산을 위해 TAαGTase를 Ni-NTA column으로 정제하였으며 정 제된 효소의 Specific activity는 74.2U/mg protein이었다. 표 3 Purification of 6xHis-tagged TAαGT from E.coli carrying TAαGT Total volumn. Total activity Total protein Specific activity. (mL). (U). (mg). (U/mg). Cell extract. 250. 18,279.7. 858.2. 21.3. 100. 1. Heat treatment. 200. 13,382.6. 423.5. 31.6. 73.21. 1.48. Ni-NTA column. 150. 3,606.1. 48.6. 74.2. 19.72. 3.48. Steps. Yield (%). Purification fold. Cycloamylose의 생산 아밀로오스에서 TAαGTase로 intra-molecular transglycosylation(cyclization)을 촉매하여 cyclic α -1,4-glucans(cycloamylose)를 생산하였으며 그림 1과 같이 생산공정을 최적화하였다. 효소 농도 및 반응시간을 정하기 위하여 TAαGTase를 효소농도와 효소반응 시간을 달리하여 HPAEC로 반 응물의 중합도를 비교하였다. 그 결과 100U/g 아밀로오스의 효소농도와 12시간 반응 처리를 하 였을 경우 cycloamylose standard materials와 비슷한 peak경향을 보였다. 30U을 처리하면 여러 개의 작은 peak들이 생성되는 것을 볼 수 있었으며 효소의 농도가 낮아짐에 따라 높은 DP의 glucan을 많이 생성함을 알 수 있었다(그림 2). 따라서 반응효소 농도를 100U으로 결정하였으며, 반응시간 별 sampling을 통해 HPAEC를 비교하였을 때에도 12시간 정도 반응하였을 때 표준 cycloamylose 와 같은 범위의 DP를 갖는 glucan을 생성함을 알 수 있었다(그림 3). 생성된 cycloamylose를 β -amylase로 정제한 전후의 HPAEC 결과를 비교하였을 때 β-amylase를 처리하였을 경우 noncyclic glucan이나 maltose 단위의 잔가지가 제거되었음을 확인할 수 있었다. 아밀로오스에서 효소 를 이용하여 생산한 cycloamylose의 수율은 44.3~49.2%였으며, Ezaki Glico 사에서 판매되고 있는 cycloamylose보다 1/3정도 값싸게 생산할 수 있어 비용절감 효과를 볼 수 있었다.. 102. 김용노.indd 102. 2010-04-16 오후 5:14:39.

(7) Amylase. Cyclization step Cycloamylose. inactivation step β-amylase β-amylase Treatment step. Removal of maltose. Maltose. Ethanol, centrifugation. EtOH Precipitation step. Purified cycloamylose. 그림1 A schematic diagram of the procedure for producing cycloamylose using TAαGTase.. 560 (a). 460 mV. 360 260 160 60 (40). 5. 15. 25. 35. 45. 560 (b). 460 mV. 360 260 160 60 (40). 5. 15. 25. 35. 45. Retention Time (min). 그림 2 HPAEC analysis of cycloamyloses produced by TAαGTase. (a) treated 100U of TAαGTase for 12hrs, (b) treated 30U of TAαGTase for 12hrs.. 신규 탄수화물인 cycloamylose의 건강기능성 포접복합체 형성능 규명. 김용노.indd 103. 103. 2010-04-16 오후 5:14:40.

(8) 900. (a). mV. 700 500 300 100 (100) 5. 15. 25. 35. 45. 940. (b). mV. 740 540 340 140 (60) 5. 15. 25. 35. 45. 900. (c). 700. mV. 500 300 100 (100) 5. 15. 25. 35. 45. Retention Time (min). 그림 3 HPAEC analysis of cycloamyloses produced by TAαGTase. Amylose treated 100U of TAαGTase for (a) 2hrs, (b) 6hrs, and (c) 12hrs.. 3.2 Cycloamylose의 이화학적 특성 규명 HPAEC를 이용한 중합도 분포 측정 아밀로오스로부터 효소적으로 생산된 cycloamylose의 중합도를 HPAEC(high performance anion exchange chromatography)를 이용하여 분석한 결과는 그림 4에 나타내었다. 중합도를 표준. 104. 김용노.indd 104. 2010-04-16 오후 5:14:40.

(9) cycloamylose(Ezaki Glico Co., LTD. Osaka, Japan)와 비교한 결과 거의 비슷한 범위대의 중합도를 가진 cycloamylose가 생산되었음을 알 수 있었다. 560. (a). 460 mV. 360 260 160 60 (40). 15. 25. 35. 45. 55 (b). 460. mV. 360 260 160 60 (40). 15. 25. 35. 45. 560. 55 (c). 460 mV. 360 260 160 60 (40). 15. 25. 35. 45. 560. 55 (d). 460 mV. 360 260 160 60 (40). 15. 25. 35 Retention Time (min). 45. 55. 그림 4 HPAEC analysis for amylose and cycloamyloses. (a) amylose, (b) TAαGTase-treated amylose, (c) TAα GTase-treated amylose after treated with β-amylase, (d) Cycloamyloses standard.. 신규 탄수화물인 cycloamylose의 건강기능성 포접복합체 형성능 규명. 김용노.indd 105. 105. 2010-04-16 오후 5:14:40.

(10) MALDI-TOF를 이용한 분자량 측정 더욱 정확한 cyclic glucan 함량과 분자량 분포를 알아보기 위하여 MALDI-TOF를 이용하여 분 석한 결과 생산된 cycloamylos는 약 DP 23에서 38범위의 중합도를 가지는 TAαGTase-producing glucan을 가지는 것으로 나타났다(그림 5). 생산된 cycloamylose의 cyclic 여부를 확인한 결과 표 4에서 나타낸 cyclic glucan의 이론적인 값과 일치하는 분자량을 가지고 있었으며 cycloamylose standard material의 분자량 분포와 거의 유사함을 알 수 있었다. 따라서 TAαGTase는 amylose로 부터 cycloamylose 형성을 촉매함을 확인하였다.. 100 90 80. DP26 4239 DP24 DP27 3914 DP25 4401 4076 DP28 4563. % Intensity. 70. DP29 4724. 60 50. 863.0. (a). DP23 3751. 40 30. DP31 5049 DP32 5211DP33 5373DP34 5535DP35 5697DP36 5859. DP38 6185. 20 10 0. 3900. 4800 DP26 4237. 100 90 80. % Intensity. 70 60. DP25 4076. 50 40 30 20. DP24 3914. 5700. 6600. Mass (m/z) 487.0. DP27 4401 DP28 4562 DP29 4724 DP30 4887 DP31 DP33 5049DP32 5373 5211 DP34 DP36 5534 DP35 5860 DP37 5697 6021. (b). 10 0. 3900. 4800. 5700. 6600. 그림 5 MALDI-TOF MS analysis of cycloamylose. The number above each peak indicates the molecular mass(in daltons) of the molecule plus 23 Da (sodium ion). (a) Analysis of cycloamylose from amylose, (b) Cycloamylose standard.. 106. 김용노.indd 106. 2010-04-16 오후 5:14:40.

(11) 표 4 Theoretical molecular masses of noncyclic and cyclic glucans, and molecular masses of glucans modified by TA αGTase determined by TOF-MS anaylsis Mass (Da) Compound (DP). Theoretical. Experimental [M+Na]+ Cycloamylose. Noncyclic glucand. Cyclic glucanc. 23. 3768. 3750. 3750. 24. 3930. 3912. 3914. 25. 4092. 4074. 4076. 4076. 26. 4254. 4236. 4237. 4239. 27. 4416. 4398. 4401. 4401. 28. 4578. 4561. 4562. 4563. 29. 4741. 4722. 4724. 4724. 30. 4903. 4885. 4887. 4885. 31. 5065. 5047. 5049. 5048. 32. 5227. 5209. 5211. 5210. 33. 5389. 5371. 5373. 5373. 34. 5551. 5533. 5534. 5535. 35. 5713. 5695. 5697. 5697. 36. 5875. 5857. 5860. 5859. 37. 6037. 6019. 6021. 6021. 38. 6199. 6181. Standardb. Productiona. 6182. a. The maximum deviation in this measurement is within 0.2%.. b. Cycloamylose standard was obtained from Ezaki Glico Co., LTD. (Osaka, Japan).. c. Calculated as 162n + 23Da, in which 162 Dais the mass of a glucosyl residue, n DP, and 23 Da the mass of sodium ion.. d. Calculated as 162n + 18 + 23Da, 18 Da the additional mass of a reducing end residue.. Iodine absorption spectra Cycloamylose의 complex 형성능을 iodine absorption을 이용하여 측정한 결과는 그림 6에 나타내 었다. 아밀로오스의 경우는 다양한 유기물 또는 무기물과 함께 helical inclusion complexs를 형성 할 수 있다. 잘 알려져 있듯이 아밀로오스와 iodine은 특이적인 deep blue color를 가진 inclusion complex를 이루며 620nm에서 최대 absorption spectrum을 보인다. 다른 DP를 가진 amylose fraction 이 iodine과 complex를 이루면 각각 다른 특정한 색(DP>47, blue; DP39~46, blue violet; DP30~38,. 신규 탄수화물인 cycloamylose의 건강기능성 포접복합체 형성능 규명. 김용노.indd 107. 107. 2010-04-16 오후 5:14:41.

(12) control. Amylose. Rice Starch. Cycloamylose Cycloamylose Standard Product. 3 Amylose 2.5 2 1.5. Cycloamylose Product Cycloamylose Standard. 1 0.5. Rice Starch 0 400. 500. 600. 700. 800. Wavelength (nm). 그림 6 Iodine absorption spectra of amylose, rice starch, and cycloamylose.. red violet; DP25~29, red; DP21~24, brown; DP<20, no color)을 나타낸다고 알려져 있다. 생산된 cycloamylose의 경우 iodine과 inclusion complex를 이루면서 red나 red violet color를 보였으며 약 500nm에서 최대 absorption spectrum을 보였다. 이 결과는 cycloamylose standard와 같은 경향을 보 였으며 complex 형성능을 확인하였다. Iodine absorption spectrum을 통하여 샘플의 아밀로오스 함 량뿐 아니라 다른 DP를 가진 amylose fraction의 hydrophobic agent와 complex 형성 능력 정도를 확인할 수 있다.. 3.3 Cycloamylose-surfactant 복합체 형성 기작 및 열역학적 특성 규명 cycloamylose-surfactant 복합체 형성에 surfactant type이 미치는 영향 Cyloamylose가 여러 guest 물질(기능성 물질)과 복합체를 형성할 수 있는지의 가능성을 확인하 고 복합체를 확인할 수 있는 방법을 확립하기 위하여, 기존의 화학구조와 특성이 규명되어 있. 108. 김용노.indd 108. 2010-04-16 오후 5:14:42.

(13) 어 surfactant를 이용하여, cycloamylose 복합체 형성능에 관한 연구를 실시하였다. Cycloamylose와 surfactant 간의 반응특성은 ITC를 이용하여 조사하였으며(그림 7), surfactant로는 SDS, DTAB, Brij35를 사용하였다. 35mM SDS를 buffer solution에 injection하고 ITC로 반응특성을 조사하였을 때, titration curve 가 3 영역으로 뚜렷하게 구분되는 것을 확인할 수 있었다(그림 7a). 첫 번째 영역은 SDS를 10번 까지 injection했을 때의 영역을 나타내며, SDS micelle이 demicellization됨으로써 나타나는 결과라 고 생각된다. 두 번째 영역은 monomer에서 micelle까지 transition concentration에 일치하는 영역으 로 최대 titration curve가 뚜렷한 지점까지를 의미한다. 세 번째 영역은 SDS의 micelle이 희석됨으 로써 형성되는 부분이라고 생각된다. 0.05mM cycloamylose와 SDS를 반응시킨 경우에는 초기에 exothermic 반응을 보이다가 endothermic으로 바뀌어 최대값을 보인 후 이내 감소하는 결과를 보 였다. 이는 SDS의 nonpolar tail이 높은 극성 환경(water)에서 보다 적은 극성환경(inside the helix)으 로 옮겨져 exothermic 반응을 보이며, 반대로 보다 적은 극성환경(inside the micelles)으로부터 더 욱 극성인 환경(water)으로 surfactant 분자의 nonpolar tail이 이동하게 되면 demicellization에 관여 하여 endothermic enthalpy로 변하기 때문에 나타나는 결과이다. 따라서 낮은 SDS 농도에서 SDScycloamylose interaction은 exothermic enthalpy 값을 보이다가, surfactant 농도가 증가함에 따라 cycloamylose의 binding site가 감소하게 되고 따라서 endothermic enthalpy로 전환하게 된다. 결국 cycloamylose의 binding site는 포화되고 endothermic reaction을 이끌게 된다. Reaction cell에서 CMC 이상으로 free SDS monomer 농도가 증가하게 되면 더 이상 micelle dissociation이 일어나지 않는다. DTAB는 SDS와는 다소 다른 적정곡선을 보였다. 그러나 heat flow change에 대한 기작은 유사 하게 나타났다. Nonionic surfactant(Brij35 at below 0.4mM)에서는 cycloamylose가 존재하지 않을 때보다 존재할 경우 더욱 exothermic enthalpy 변화를 보였는데 이는 inclusion complex의 형성에 기 인한 것으로 보인다. Heat flow 곡선의 면적으로 구한 reaction cell 안의 surfactant 몰농도에 따른 enthalpy change(∆ H/Δ[Surfactants])는 그림 8에 나타내었다. SDS와 DTAB의 CMC는 각각 2.7±0.2mM, 14.8±0.0mM 로 나타났다. Cycloamylose의 존재 유무에 따라 surfactant의 CMC가 다르게 나타났는데, 이 차이 는 포화상태에서 cycloamylose에 binding되는 surfactant의 양과 일치한다. Brij35의 경우 surfactant demicellization에 대한 명백한 peak가 나타나지 않았다. SDS는 0.24mM에서 0.05mM cycloamylose 와 bindinng되므로 포화되었을 경우 SDS 1분자가 cycloamylose의 약 9개의 glucose와 binding된다 고 추론할 수 있다.. Thermodynamic data analysis Cycloamylose와 SDS, DTAB의 complexation과 관련된 열역학적 parameter, 즉 binding affinity(Ka),. 신규 탄수화물인 cycloamylose의 건강기능성 포접복합체 형성능 규명. 김용노.indd 109. 109. 2010-04-16 오후 5:14:42.

(14) 14. SDS. (a). Heat Flow (µcal/sec). 12. 10. 14 12 10 8 6 4 2 0 -2 -4. 0. 20. 40. 60. 80. 100 120 140. (b). 0. 20. 40. 60. 80. 100 120 140. Time (min). 30 28 26 24 22 20 18 16 14 12 10 8 30 28 26 24 22 20 18 16 14 12 10 8. DTAB. Brij35. 10 8 6 4 2 0 -2. 0. 20. 40. 60. 80. 100 120 140. 0. 20. 40. 0. 20. 40. 60. 80. 100 120 140. 60. 80. 100 120 140. 12 8 4 0 -4 -8 -12 0. 20. 40. 60. 80. 100 120 140. Time (min). Time (min). 그림 7 (a) Titration curves resulting from injection of 10µL aliquots of 35 mM SDS, 100 mM DTAB and 8 mM Brij35 into a reaction cell containing buffer at 25℃ and pH 7, (b) Titration curves resulting from injection of 10µL aliquots of 35 mM SDS into a reaction cell containing 0.05 mM cycloamylose at 25℃ and pH 7.. enthalpy와 entropy의 변화(∆H, ∆S), binding sites 개수(n) 등을 구하기 위하여 cycloamylose에 SDS와 DTAB를 각각 injection한 다음 얻은 titration curve를 one site binding model로 fitting(그림 9)하였 으며, 그 결과는 표 5에 나타내었다. SDS의 stoichiometry(n) 값은 2.5로 하나의 cycloamylose 분자에 평균 2~3분자의 SDS가 binding할 수 있음을 의미한다. 이 결과 하나의 SDS가 cycloamylose의 약 9 glucose에 binding한다는 추론과 일치한다. Host-guest inclusion complex 형성이 약한 exothermic process일 경우 enthalpy 값은 negative를 갖는다. 완전히 수화된 cycloamylose의 hole에 binding된 물분자는 hydrophobic hole로부터 bulk aqueous phase에 방출되게 되어 exothermic process를 거친다. Entrophy change(∆S)와 free energy change(∆Go)는 ∆Go=-RTInKa = ∆Ho - T∆So를 사용하여 계산할 수 있다. CA와 SDS의 complexation에서 ∆S는 negative로 나타났으나 DTAB와는 positive로 나타 났다. negative값은 아마 SDS가 CA의 cavity 안으로 들어갈 때 CA의 conformational flexibility가 감 소하기 때문일 것이다. CA와 DTAB의 complexation은 SDS보다 더 CA cavity에 들어가기 때문에 많은 양의 물 분자가 bulk solvent로 release되어 positive entropy 값이 나타난 것으로 보인다. ∆G는 negative 값을 보였는데 이는 aqueous solution에서 CA-surfactant complexes의 형성은 spontaneous process를 나타낸다.. 110. 김용노.indd 110. 2010-04-16 오후 5:14:42.

(15) 0.0. -0.5 0.05mM CA Buffer. -1.0. -1.5. 0.6. DTAB. 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0. -0.1. 0. 20. 40. 60. 80. 100 120 140 160. 0. 100. Molar Rate. 200. 300. 400. ΔH/Δ[Brij35](Kcal/mole of Brij35). SDS. ΔH/Δ[DTAB](Kcal/mole of DTAB). ΔH/Δ[SDS](Kcal/mole of SDS). 0.5. Brij35. 0 -1 -2 -3 -4 -5 -6. 500. 0. 5. 10. Molar Rate. 0.24 0.94 1.88 2.82 3.76 4.70 5.64 6.58. 0.67 2.68 5.37 8.05 10.74 13.4016.10 18.79. SDS concentration (mM). 15. 20. 25. 30. 35. 40. Molar Rate. DTAB concentration (mM). 0.054 0.215 0.430 0.644 0.859. 1.074 1.289. 1.503. Brij35 concentration (mM). 그림 8 Dependence of enthalpy change per mole of surfactant on the surfactant concentration in the reaction cell for 35 mM SDS, 100 mM DTAB and 8 mM Brij35 injected into buffer and 0.05 mM cycloamylose solution at 25℃.. µcal/sec. 0. 0. -1. -3. Kcal/mole of injectant. -1. SDS. DTAB. -2 -2. a. 0.00 -0.05 -0.10 -0.15 -0.20 -0.25 -0.30. 0. -2. -4. b 0. 2. 4. 6. 8. 10. 12. -0.35 -0.40 -0.45. Molar Ratio. 0. 10 20 30 40 50 60 70. Molar Ratio. 그림 9 (a) Experimental data for titrations of 10µL aliquots of 2.65 mM SDS and 14.5 mM DTAB into a reaction cell containing 0.05 mM cycloamylose. (b) Data point obtained by integration of the injection peaks and the titration curve (solid line) obtained by fitting the data points. 표 5 Thermodynamic parameters for cycloamylose-surfactants complexes at T = 298 K ∆G. ∆H. ∆S. (M ). (kcal/mole). (kcal/mole). (kcal/mole). 2.5±0.3. 11416.7±1277.9. -5537.4±62.9. -7099.0±1040.5. -5.2±3.7. 5.3±0.8. 935.4±70.3. -4050.5±42.8. -2312.4±391.5. 5.8±1.5. Surfactants. n. SDS DTAB. Ka -1. 신규 탄수화물인 cycloamylose의 건강기능성 포접복합체 형성능 규명. 김용노.indd 111. 111. 2010-04-16 오후 5:14:43.

(16) 조건변화에 따른 cycloamylose-surfactant interaction 변화 분석 서로 다른 온도 조건이 surfactant와 cycloamylose의 binding에 어떤 영향을 미치는지 조사하기 위 하여 온도조건을 10, 25, 50℃로 각각 변화를 주었다. 다른 온도에서 SDS 농도와 SDS의 mole(∆ H/Δ[SDS])에 따른 엔탈피 변화는 그림 10에 나타내었다. 10℃에서 buffer에 35mM SDS를 적정 할 때 13번째 injection에서 large exothermic heat signal을 보였으며, 50℃에서는 13번째 적정까지 높 은 endothermic peak를 보이다가 점차 endothermic peak를 보였다. 25℃ 역시 50℃에서와 비슷한 peak 양상을 보였다. Cycloamylose가 존재할 때에는 질적으로 다른 titration curve 양상을 보였 다. 10℃와 50℃에서는 cycloamylose가 존재하지 않을 때와 비슷한 profile curve를 나타냈으나 더 낮은 heat flow 값을 보였는데 이는 cycloamylose가 SDS의 binding에 관여되었기 때문이다. 25℃ 의 surfactant 농도에서는 cycloamylose가 존재하지 않을 경우에는 낮은 endothermic peak를 보 였는데 cycloamylose가 존재할 때에는 exothermic peak를 나타내었다. 이 결과 온도가 높아질수 록 cycloamylose와 SDS의 binding affinity가 변화하게 되고, 50℃에서는 10℃와 25℃에서보다 적은 cycloamylose binding이 일어남을 알 수 있었다. pH 조건이 cycloamylose-surfactant interaction 변화에 미치는 영향에 대하여 실험하였다. Trizma-bufferd solution의 pH를 각각 3, 5, 7로 변화를 주어 실험하였더니 모든 pH에서 ethalpy change의 유의적 차이를 보이지 않았다(그림 11). 이는 cycloamylose과 SDS의 binding 또는 SDS. 0.0. 0.5. 25 °C. 0.0. -0.5. -0.5. -1.0. 0.05mM CA Buffer. -1.0. -1.5. -1.5. 0 0.24. 20. 40. 60. 0.94. 1.88. 2.82. 80 100 120 140 160. 0. 20. 40. 60. 80 100 120 140 160. 0.94. 1.88. 2.82. 3.76. Molar Rate 3.76. 4.70. 5.64. SDS concentration (mM). 6.58. 0.24. Molar Rate. 4.70. 5.64. SDS concentration (mM). 6.58. ΔH/Δ[SDS](Kcal/mole of SDS). 10 °C. ΔH/Δ[SDS](Kcal/mole of SDS). ΔH/Δ[SDS](Kcal/mole of SDS). demicellization에 pH는 영향을 주지 않음을 나타낸다. 50 °C. 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 0. 0.24. 20. 40. 0.94. 1.88. 60. 80 100 120 140 160. Molar Rate 2.82. 3.76. 4.70. 5.64. 6.58. SDS concentration (mM). 그림 10 Dependence of enthalpy change per mole of surfactant on the surfactant concentration in the reaction cell for 35 mM SDS injected into buffer and 0.05 mM cycloamylose solution at various temperatures.. 112. 김용노.indd 112. 2010-04-16 오후 5:14:43.

(17) 다음으로 염농도의 변화를 주어 엔탈피 변화를 관찰하였더니 cycloamylose의 존재 유무에 따 라 SDS의 초기 농도에서 다른 양상을 보였다. cycloamylose가 존재하지 않을 때 염농도가 증가 할수록 CMC가 감소하였다. 0mM NaCl에서 SDS의 CMC는 3.5mM이었으며 10mM NaCl에서는 2.7mM, 100mM NaCl에서는 1.2mM로 나타났다. 이는 SDS head-group 사이의 electrostatic repulsion 에 기인한다. CMC* 역시 염농도가 증가할수록 감소하였다. 따라서 염농도가 증가할수록 CMC 와 CMC* 값이 감소하기는 하지만 염농도는 cycloamylose와 SDS의 binding 모두에 영향을 주지 않음을 알 수 있었다.. -0.5. pH 5. 0.05mM CA Buffer. -0.5. -1.0. -1.5. -1.0. -1.5. -2.0 0. 20. 40. 60. 80. -1.5. 0. 100 120 140 160. 20. 40. Molar Rate. 60. 80 100 120 140 160. 0. Molar Rate. 0.235 0.940 1.879 2.819 3.758 4.698 5.638 6.577. 0.235 0.940 1.879 2.819 3.758 4.698 5.638 6.577. pH 7. 0.0. 0.0. -0.5. -1.0. 0.5. ΔH/Δ[SDS](Kcal/mole of SDS). ΔH/Δ[SDS](Kcal/mole of SDS). 0.0. 0.5. ΔH/Δ[SDS](Kcal/mole of SDS). pH 3. 0.5. 40. 60. 80 100 120 140 160. Molar Rate. 0.235 0.940 1.879 2.819 3.758 4.698 5.638 6.577. SDS concentration (mM). SDS concentration (mM). 20. SDS concentration (mM). 0.0. 0.5. 10mM NaCI. 0.0. -0.2. -0.5. -0.4 -0.6. 0.05mM CA Buffer. -0.8 -1.0. -1.0. -1.5. -1.2 0 0.24. 20. 40. 60. 0.94. 1.88. 2.82. 80 100 120 140 160. Molar Rate 3.76. 4.70. 5.64. SDS concentration (mM). 6.58. 0. 20. 40. 60. 80 100 120 140 160. 0.6. ΔH/Δ[SDS](Kcal/mole of SDS). 0mM NaCI. 0.2. ΔH/Δ[SDS](Kcal/mole of SDS). ΔH/Δ[SDS](Kcal/mole of SDS). 그림 11 Dependence of enthalpy change per mole of surfactant on the surfactant concentration in the reaction cell for 35 mM SDS injected into buffer and 0.05 mM cycloamylose solution with different pH at 25℃.. 100mM NaCI. 0.4 0.2 0.0 -0.2 -0.4 -0.6 -0.8 -1.0 0. 20. 40. 60. 0.94. 1.88. 2.82. Molar Rate. 0.235 0.940 1.879 2.819 3.758 4.698 5.638 6.577. SDS concentration (mM). 0.24. 80 100 120 140 160. Molar Rate 3.76. 4.70. 5.64. 6.58. SDS concentration (mM). 그림 12 Dependence of enthalpy change per mole of surfactant on the surfactant concentration in the reaction cell for 35 mM SDS injected into buffer and 0.05 mM cycloamylose solution with different salt concentration at 25℃.. 신규 탄수화물인 cycloamylose의 건강기능성 포접복합체 형성능 규명. 김용노.indd 113. 113. 2010-04-16 오후 5:14:44.

(18) 3.4 Cycloamylose의 중합도별 분리 Cycloamylose의 분리조건 최적화 아밀로오스에서 TAαGTase 효소를 이용하여 분리한 cycloamylose를 중합도별로 분리하기 위하 여 perp-HPLC system을 사용하였다. 우선 semi-preparation HPLC를 통하여 column 종류, eluent buff er concentration, sample concentration 조건을 최적화하였다. Column은 ODS column인 Nova pack C18과 Sunfire C18을 이용하여 cycloamylose를 분리하였을 때 Sunfire C18 column의 경우 분리 능이 훨씬 좋았고(그림 13), eluent buff er 조건을 비교하였을 때 10%와 8%의 methanol을 사용하 여 용출하였을 경우 거의 분리가 되지 않았으며 4%의 methanol을 사용하였을 경우 선명한 분리 피크를 얻을 수 있었다(그림 14). 최대 분리 가능한 sample 농도를 알아보기 위한 실험 결과 60mg/ mL의 cycloamylose는 농도가 너무 높아 분리가 불가능하였으며 최대 30mg/mL를 용출하였을 경 우 선명한 피크를 보였다(그림 15). 따라서 분리 조건은 Sunfire C18 column, 4% methanol, 30mg/ mL의 cycloamylose 농도를 선택하여 scale-up하였다.. mVolts (a). 60. 20. (b). 10. 0 10. 15. 20. 25. 30. Minutes. 그림 13 Chromatograms of cycloamylose. Chromatographic conditions: column (a) Nova pack C18 (4µm, 3.9 × 150mm); (b) Sunfire C18 (5µm, 4.6 × 250mm); flow-rate, 0.5ml/min; detector, refractive index; eluent, 4% methanol.. 114. 김용노.indd 114. 2010-04-16 오후 5:14:44.

(19) mVolts. (a). 180 160 (b). 140 120 100 80. (c). (d). 60 40 20 0. 10. 20. 30. 40. 50. Minutes. 그림 14 Chromatograms of cycloamylose. Chromatographic conditions: column, Sunfire C18 (5µm, 4.6 × 250mm); flow-rate, 0.5mL/min; detector, refractive index; eluent, (a) 10%; (b) 8%; (c) 6%; (d) 4% methanol.. mVolts (a) 125 (b). 100 75 50 25. (c). 0 25. 50. 75. 100. 125. Minutes. 그림 15 Chromatograms of cycloamylose. Chromatographic conditions: column, Sunfire C18 (5µm, 4.6 × 250mm); flow-rate, 0.5mL/min; detector, refractive index; eluent, 4% methanol; Sample concentration (a) 60mg/mL; (b) 30mg/mL; (c) 15mg/mL.. 신규 탄수화물인 cycloamylose의 건강기능성 포접복합체 형성능 규명. 김용노.indd 115. 115. 2010-04-16 오후 5:14:46.

(20) Cycloamylose의 중합도별 분리 Prep-HPLC를 이용하여 최적분리조건으로 cycloamylose를 중합도별로 분리한 결과는 그림 16에 나타내었다. 보통 ODS(octadecylsilane) column은 oligosaccharide의 분리에 사용하지 않는다. 왜냐 하면 pure water를 가지고 상온에서 HPLC로 각각의 oligosaccharide의 α와 β-anomer 사이에서 바 람직하지 못한 resolution을 이끌어 분리능이 좋지 않기 때문이다. 하지만 cycloamylose는 다양한 DP를 가진 cyclic α-(1→4)-glucan이 섞여 있으므로 이러한 영향을 받지 않을 것이라 생각되어 분 리 column으로 선택하였으며, 실험 결과 ODS column인 Sunfire C18을 사용하여 cycloamylose를 분리한 chromatogram의 elution profile은 최근 oligosaccharide의 중합도 분석에 널리 이용되고 있는 HPAEC system(CarboPac column 사용)의 elution profile과 유사하게 나타났다(그림 16). Sunfire C18 column을 사용할 경우 loading capacity가 보다 더 크고, 적은 양의 methanol을 사용하여 elution시 키기 때문에 상대적으로 더 많은 saccharide를 용해시키기 유리하며 분리된 각 peak를 탈염시키는 과정을 거치지 않으므로 더 쉽게 분획을 얻을 수 있을 것이라 생각된다. 분석 결과 DP 23에서 50까지 28개의 각각의 cyclic glucan을 분리하였으며 각 peak의 수율은 표 6에 나타내었다. 높은 DP를 가진 cyclic glucan의 수율을 높이기 위해서는 DP 40 이상의 peak를 모아 다른 eluent 농도 조건을 잡아 분획한다면 가능할 것이라 생각된다. Linear α(1→4) glucan 과는 다르게 cyclic α-(1→4) glucan은 높은 용해도를 가지고 있기 때문에 50보다 높은 DP를 가진 cyclic glucan의 분리 또한 가능할 것이다.. HPAEC와 MALDI-TOF를 이용한 중합도 및 분자량 분포 측정 Prep-HPLC를 사용하여 cycloamylose를 각 DP별로 분리하여 얻은 각 peak의 분리정도와 분자량 을 분석하기 위하여 HPAEC와 MALDI-TOF를 사용하였다. 각 DP별로 분리하여 얻은 sample은 3일 동안 동결건조하여 powder를 얻었으며 이를 이용하여 HPAEC를 분석한 결과 각 peak의 DP 분포를 알 수 있었으며 prep-HPLC system으로 각 DP별 분 리가 되었음을 알 수 있었다(그림 17). 분리된 각 peak의 분자량과 각 peak의 DP를 더욱 정확하게 확인하기 위하여 MALDI-TOF를 이용하였으며 분석결과 각 peak가 DP별로 잘 분리되었음을 알 수 있었다(그림 18).. 116. 김용노.indd 116. 2010-04-16 오후 5:14:46.

(21) mVolts 40. 24 26 25 27 28. 30 29 30. 20. 23. 31. 32. 33. 34. 35 36. 10. 37. 38. 39. 40. ............... 50. 0 25. 50. 75. 100. 125. Minutes. 그림 16 Separation of cycloamylose on a Sunfire C18 column (10µm, 30 × 150mm). Numbers above peaks indicate the DPs confirmed by MALDI-TOF. Chromatographic conditions : flow-rate, 20mL/min; detector, refractive index; eluent, 4% (v/v) methanol.. 표 6 The yield of each cyclic α-(1→4) glucan from cycloamylose Peak No.. DP. Yield (%). Peak No.. DP. Yield (%). 1. 23. 0.7. 15. 37. 2.3. 2. 24. 1.7. 16. 38. 2.1. 3. 25. 3.2. 17. 39. 1.9. 4. 26. 3.8. 18. 40. 2.0. 5. 27. 3.3. 19. 41. 1.9. 6. 28. 4.5. 20. 42. 1.5. 7. 29. 3.3. 21. 43. 2.4. 8. 30. 1.6. 22. 44. 1.3. 9. 31. 1.8. 23. 45. 1.7. 10. 32. 2.9. 24. 46. 1.4. 11. 33. 1.7. 25. 47. 1.3. 12. 34. 1.9. 26. 48. 0.8. 13. 35. 2.1. 27. 49. 0.9. 14. 36. 2.3. 28. 50. 0.5. 신규 탄수화물인 cycloamylose의 건강기능성 포접복합체 형성능 규명. 김용노.indd 117. 117. 2010-04-16 오후 5:14:46.

(22) 500. 200. 100. 100 45. 50. mV. 200. 100. 100 30. 35. 40. 45. 35 40 Reaction time (min). 50. 30. 35 40 Reaction time (min). 100. 100. 25. 30. 35 40 Reaction time (min). 45. 50. 32. 300. 100. 100 35 40 Reaction time (min). 45. 50. 30. 35 40 Reaction time (min). 45. 300 `. 200. `. 25. 30. 35 40 Reaction time (min). 45. 500. peak15. 35 40 Reaction time (min). 45. 300. 200. 200. 30. 35 40 Reaction time (min). 50. peak14. 36. 45. 50. 25. 30. 35. 40. 45. 50. 500. 38. 400. peak16. 200. 100. peak17. 39. 400. 200. 50. 45. 100 25. 100 45. 35 40 Reaction time (min). 400. 200. 40. 30. 500. peak13. 35. 300. 35. peak11. 33. 25. 50. 300. 30. 50. 300. 300. 25. 45. 100 30. 500. 37. 400. 35 40 Reaction time (min). 400. 300. 50. 30. 200. 100. 100. peak8. 300. 25. 32. 400 mV. 400. 50. 500. 500. peak12. 34. 45. 100. 50. peak10. 25. 500. 35 40 Reaction time (min). 30. 400 mV. 200. 30. 30. 500. peak7. 300. 200. 25. peak5. 200. 400 mV. mV. 25. 500. peak9. 31. 400. 50. 300. 50. 29. 25. 500. mV. 45. mV. mV. mV. 200. 45. 27. 400. 300. 200. 35 40 Reaction time (min). 500. peak4. 400. 300. 30. 100 25. peak6. 25. 200. 500. 28. 400. 50. 26. Reaction time (min). 500. 45. 300. 200. 25. 30. 400. 300. 300. 100 25. peak3. peak2. 200. 500. 25. 400. 24. 400. mV. 500. 35 40 Reaction time (min). 23 24. 300. 200. 30. peak1 mV. 300. mV. mV. 400. 25. mV. 500. 500. Cycloamylose. 400. 100 25. 30. 35. 40. 45. 50. 25. 30. 35. 40. 45. 50. 그림 HPAEC elution profile profile of each cyclic α-(1→4)-glucan isolated from prep-HPLC. above peaks Fig. 17 17. HPAEC elution of each cyclic Ȼ-(1˧4)-glucan isolated Numbers from prep-HPLC. indicate the DPs. Numbers above peaks indicate the DPs.. 118. 김용노.indd 118. 2010-04-16 오후 5:14:48.

(23) Peak 1. 80. % Intensity. DP24 39124. 40. 70. 60. 60. 60. 50 40. 50 40. 30 20. 10. 10. 10. 2.9E+4. Mass (m/z). 45613. 90. Peak 5. 0. 4299.8. 80 70. 60. 60. % Intensity. 70. 50 40. DP29 4724. 40. 60. 40. 20. 10. 10. 2.0E+4. 100 90 80. 02399.4. 6200.2. 90. 5048. 80. 0. 20. 6200.2. 0. 02399.4. 80. 90. 5373. 80. 60. 60. 60. 60. 40. DP32. 40. % Intensity. 70. % Intensity. 70. % Intensity. 70. 50. 50 40. 30. 20. 20. 20. 20. 10. 10. 10. 02399.4. 4299.8. 6200.2. Mass (m/z). 80. 02399.4. 2.0E+4. 100 90. 0. 6200.2. 90. 5697. 80. 0. DP36. 4299.8. 6200.2. Mass (m/z). 0. 02399.4. 1.4E+4. 100 90. Peak 14. 5859. DP37. Peak 15. 6021. 80. 60. 60. 40. % Intensity. 60. % Intensity. 60. % Intensity. 70. 50 40 30. 30. 20. 20. 20. 20. 10. 10. 10. 6200.2. 80. 04389.8. 2.5E+4. 100 90. 0. DP39 6346. 80 70. 60. 60. % Intensity. 70. 50 40. 20. 20. 10. 10. Mass (m/z). 8130.6. 0. 04389.8. 6260.2. Mass (m/z). 8130.6. 0. 04299.8. 1.0E+4 100. DP40 6508. DP45. 90. Peak 18. 80. 60 50 40. DP50. Peak 28. 8129. 60 50 40. 10. 10 Mass (m/z). 0. 1.5E+4. 20. 20. 0. 8100.6. 30. 30. 0. 6200.2. Mass (m/z). 70. 70. 8130.6. Peak 16. 100 90. Peak 23. 7317. 80. 6260.2. 6182. 10. 0 4389.8. 1.6E+4. 40 30. 6260.2. 0. 50. 30. 0 4389.8. 8130.6. 100 90. Peak 17. 6260.2. Mass (m/z). % Intensity. 4299.8. DP38. 40. 30. Mass (m/z). 0. 50. 30. 02399.4. 6200.2. 2.0E+4. 80. 70. 40. 4299.8. Mass (m/z). 90. 70. 50. 5535. 100. 70. 50. DP34. Peak 12. 10. 02399.4. 1.1E+4. 100. DP35. Peak 13. 4299.8. Mass (m/z). 0. 2.0E+4. 40. 30. 5210. 6200.2. 50. 30. 30. 4299.8. Mass (m/z). 100. DP33. Peak 11. 70. 50. 5048. 30. 1.5E+4. 90. 5210. DP31. 10 4299.8. Mass (m/z). 100. DP32. Peak 10. Peak 8. 4885. 40. 4885. 02399.4. 1.1E+4. 100. DP31. Peak 9. 4299.8. Mass (m/z). DP30. 50. DP30. 0. 3.7E+4. 80. 50. 20. 6200.2. 90. Peak 7. 4724. 4299.8. Mass (m/z). 100. 60. 10 0. 02399.4. 70. 20. 6200.2. 0. 70. 30. 4299.8. DP29. 80. 50. 6200.2. 1.0E+4. 90. 30. Mass (m/z). 4299.8. Mass (m/z). 100. Peak 6. 30. 02399.4. 10. 02399.4. 4.1E+4. DP28. 100. DP27 4341. 2399.4. % Intensity. 0. % Intensity. 0. 4299.8. Peak 4. 40. 20. Mass (m/z). 4239. 50. 20. 2399.4. 2.3E+4. DP26. 80. 70. 20. 80. % Intensity. Peak 3. 80. 70. 30. 90. % Intensity. 90. 30. 100. % Intensity. 100. 30. 0. % Intensity. 4076. 90. % Intensity. % Intensity. 60. 3.7E+4. DP25. 100. Peak 2. 80. 70. 50. 3.2E+4. 3914. 90. % Intensity. 3750. DP24. 100. DP23. 90. % Intensity. 4.8E+4. 100. 6688.4. 7583.8. Mass (m/z). 8479.2. 06260.2. 8130.6. Mass (m/z). 10001.0. 0. 그림 18 MALDI-TOF-MS analysis of each cyclic α-(1→4)-glucan isolated from prep-HPLC. The number above each peak indicates the molecular mass (in daltons) of the molecules plus 23 Da (sodium ion) and the DPs.. 신규 탄수화물인 cycloamylose의 건강기능성 포접복합체 형성능 규명. 김용노.indd 119. 119. 2010-04-16 오후 5:14:51.

(24) 3.5 중합도별 복합체 형성 기작 및 열역학적 특성 규명 다른 DP를 가진 cyclic α-(1→4)-glucan과 surfactant의 복합체 형성 기작 다른 DP를 가진 cyclic α-(1→4)-glucan으로 α-CD, β-CD, CA26, CA38(각각 DP6, 7, 26, 38)을 사 용하였는데, α-CD와 β-CD는 sigma에서 구입하여 사용하였으며 CA26과 CA38은 아밀로오스에 서 효소 처리하여 생산한 cycloamylose를 SunfireC18 column으로 분리하여 동결건조한 powder를 사용하였다. 다른 DP를 가진 cyclic α-(1→4)-glucan과 anionic surfactant인 SDS와의 complex formation을 ITC를 이용하여 알아보았다(그림 19). 35mM SDS를 buffer solution에 injection할 경우 CMC 이 하에서는 micelle dissociation에 의해 large endothermic heat signal을 보이다가 CMC 이상에서는 micelle dilution effect에 의해 상대적으로 small endothermic heat signal를 보였다[그림 19(a)]. cyclic α-(1→4)-glucan이 존재할 경우, 초기에는 large exothermic contribution이 일어나다가 enthalpy 변 화가 증가하여 endothermic이 최대가 되다가 이내 감소하였다[그림 19(b)]. 이는 앞서 연구한 cycloamylose와 비슷한 enthalpy profile을 보였다[그림 7(b)]. 그림 19(c)는 DP가 서로 다른 α-CD, β-CD, CA26, CA38과 SDS의 interaction에 의한 enthalpy 변 화를 비교하여 나타내었다. SDS 농도가 낮은 초기에는 sample과 SDS 분자가 binding을 하여 매 우 높은 exothermic reaction이 관찰되었는데 CA26이 가장 큰 exothermic heat signal을 보였다. SDS 의 중간 농도에서는 높은 endothermic heat signal로 변화하였으며 이 영역에서는 DP가 증가할수 록 상대적으로 낮은 endothermic reaction을 보였다. 이는 SDS 농도가 증가할수록 binding 가능 한 binding site 수가 감소하게 되어 SDS와 cyclic α-(1→4)-glucan interaction의 exothermic과 관련된 enthalpy change가 감소되기 때문이다. 결국 cyclic α-(1→4)-glucan의 모든 binding site가 포화되고 CMC 이상의 SDS를 더 reaction cell에 injection하게 되면 더 이상 interaction이 이루어지지 않게 된 다. 그 결과 복합체 형성에 관여하는 enthalpy change는 변화하지 않고 cyclic α-(1→4)-glucan이 없 을 때와 비슷하게 나타났다.. 120. 김용노.indd 120. 2010-04-16 오후 5:14:51.

(25) 0.5 4. (a). (c) 0.0. kcal/mole of injectant. Heat Flow (µcal/sec). 2. 0 15 10. (b). 5 0. -0.5. alpaCD betaCD CA 26 CA 38. -1.0. -1.5. -5 -10 -15 0. 20. 40. 60. 80 100 120 140. -2.0 -10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130140 150 160 170. Time (min). Molar Ratio. 그림 19 (a) Heat flow vs time profiles resulting from injection of 10-µL aliquots of 35 mM SDS into a 1,480µL reaction cell containing buff er solution at 25℃. (b) Heat flow vs time profiles resulting from injection of 10µL aliquots of 35mM SDS into a 148µL reaction cell containing 0.05mM CA26 solution at 25℃. (c) Dependence of enthalpy on SDS concentration in cycloamylose solution with diff erent DPs at 25℃.. 다른 DP를 가진 cyclic α-(1→4)-glucan과 surfactant의 thermodynamic data Cycloamylose는 cyclodextrin과는 다른 cavity geometry를 가지고 있으며 CA26의 crystal structure 는 hydrophobic cavity의 geometry 면에서 특별한 관심을 보이고 있다. 하지만 cycloamylose 의 inclusion complex에 대한 연구 논문은 많지가 않다. 따라서 본 연구에서는 cycloamylose에 서 가장 conformational flexibility가 다른 CA26과 CA38을 cyclodextrin과 비교하여 complexation thermodynamic 특성의 차이를 알아보았다. 그림 20(a)는 1.88mM SDS 용액을 각각 0.1mM α-CD와 β-CD 용액에 10µL씩 적정하여 heat signal의 변화를 나타내었으며, 그림 20(b)는 α-CD와 β-CD의 titration curve를 single set model로 fitting한 결과이다. 그 결과 CD-SDS interaction에서 association constants는 α-와 β-CD 각각 7.46± 0.38×104과 2.22±0.39×104, binding의 enthalpy는 -14.04±0.42×103과 -2.40±0.16×103 kcal/mole을 나 타내었다. 반면 CA26은 0.05mM의 농도를 사용하여 1.88mM SDS를 10µL씩 titration하였으며 two set model을 사용하여 fitting하였고 그 결과는 그림 21(a)에 나타내었다. CA38의 titration curve 모 양과 identical interacting site가 CA26과 비슷한 경향을 보였다.. 신규 탄수화물인 cycloamylose의 건강기능성 포접복합체 형성능 규명. 김용노.indd 121. 121. 2010-04-16 오후 5:14:52.

(26) Time (min) -10. 0. Time (min). 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160. -10. µcal/sec. -2. -0.5. -4. (DP6) (a). -6 0 -2 -4 -6 -8 -10 -12. 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160. 0.0. (b). β-CD (DP7). -1.0. Kcal/mole of injectant. Kcal/mole of injectant. µcal/sec. 0. 0. 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5. 0. -2. 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5. Molar Ratio. Molar Ratio. 그림 20 (a) Experimental data for titrations of 10µL aliquots of 1.88 mM SDS into a reaction cell containing 0.1 mM α-CD (DP6) and β-CD (DP7) at 25℃. 29 injections of the SDS solution were made at 5min intervals. (b) Data point obtained by integration of the injection peaks and the titration curve (solid line) obtained by fitting the data points.. Time (min) -10 0. Time (min). 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160. -10. CA26. µcal/sec. -2. -4. Kcal/mole of injectant. 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160. 0. -1. CA38. (a). 0 -2 -4 -6. (b) -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0. Molar Ratio. Kcal/mole of injectant. µcal/sec. 0. 0. -0. -2. -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0. Molar Ratio. 그림 21 (a) Experimental data for titrations of 10µL aliquots of 1.88 mM SDS into a reaction cell containing 0.05 mM CA26 and CA38 at 25℃. 29 injections of the SDS solution were made at 5min intervals. (b) Data point obtained by integration of the injection peaks and the titration curve (solid line) obtained by fitting the data points.. 122. 김용노.indd 122. 2010-04-16 오후 5:14:53.

(27) 4. 요 약 본 연구에서는 신규 탄수화물인 cycloamylose를 효소적으로 생산하여 중합도별 분리방법 및 분 석법을 확립하고, 소수성 물질과의 inclusion 복합체 형성 기작 및 열역학적 특성을 규명하여 다양 한 기능성 식품 소재와의 포접복합체 제조 가능성을 규명하고자 하였다. Cycloamylose의 이화학 적 특성 및 열역학적 특성 결과는 다음과 같다. 1. TAαGTase로 intra-molecular transglycosylation(cyclization)을 촉매하여 cyclic α-1,4-glucans (cycloamylose)를 생산하였으며 수율은 44.3~49.2%이었고 이는 Ezaki Glico 사에서 판매되고 있는 cycloamylose보다 1/3정도 값싸게 생산할 수 있어 비용절감 효과를 볼 수 있었다. 2. HPAEC와 MALDI-TOF 분석 결과 DP 24~38범위의 중합도를 가진 cyclic α-1,4-glucans (cycloamylose)를 생산하였으며 이는 표준 cycloamylose와 비슷한 범위의 중합도를 보였다. 3. Complex 형성능을 iodine absorption을 이용하여 측정하였더니 cycloamylose는 iodine과 inclusion complex를 이루면서 red나 red violet color를 보였으며 약 500nm에서 최대 absorption spectrum을 보였다. 4. Cycloamylose의 복합체 형성 기작 및 열역학적 특성을 규명하기 위하여 ITC를 이용하여 측 정하였다. Head group의 electric charge가 다른 3종류의 surfactant(anionic; SDS; cationic, DTAB; nonionic, Brij35)와 cycloamylose의 complex formation을 분석하였는데 3종류의 surfactant 모두 cycloamylose와 interaction을 보였으며 head group에 따라서 binding 특성이 다르게 나타났다. 5. CMC 이하의 농도에서 0.05mM cycloamylose에 binding된 surfactant의 양은 ~0.24mM SDS, ~1.34mM DTAB이었으며 cycloamylose-surfactant interaction은 exothermic reaction을 보였다. 6. Cycloamylose-surfactant interaction은 온도조건에 따라 다른 enthalpy 변화를 보였다. 온도가 높아질수록 cycloamylose와 SDS의 binding affinity가 변화하였으며 50℃에서는 10℃와 25℃에서보 다 적은 cycloamylose binding이 일어났다. pH 조건과 염농도의 변화에는 영향을 받지 않았는데 이 factor는 cycloamylose-SDS binding 또는 SDS demicellization에 영향을 주지 않음을 알 수 있었다. 7. Cycloamylose를 중합도별로 분리하기 위하여 perp-HPLC를 사용하였으며 Sunfire C18 column. 신규 탄수화물인 cycloamylose의 건강기능성 포접복합체 형성능 규명. 김용노.indd 123. 123. 2010-04-16 오후 5:14:53.

(28) 으로 4% methanol 조건에서 DP 23에서 50까지 28개의 각각의 cyclic α-(1→4)-glucan을 분리하였 다. 분리한 각 peak의 중합도와 분자량 분포 확인은 HPAEC와 MALDI-TOF를 사용하였으며 분석 결과 DP별로 잘 분리되었음을 알 수 있었다. 8. 서로 다른 DP를 가진 cyclic α-(1→4)-glucan으로 α-CD, β-CD, CA26, CA38(각각 DP6, 7, 26, 38)을 사용하여 SDS와의 interaction을 알아보았는데 CMC 이상에서는 cycloamylose와 비슷 한 enthalpy profile을 보였다. 1.88mM SDS와 α-CD와 β-CD는 1:1 complex formation을 보였으 며 CA26과 CA38은 identical interaction site로 two set model로 fitting이 가능하였으며 아마도 1:2 complex formation인 것으로 생각된다.. 참고문헌 Del Valle, E.M.M. (2004). Cyclodextrins and their uses: a review. Process Biochemistr y, 39: 1033-1046. Eli, W., & Chen, W. (1999). The association of anionic surfactants with β-cyclodextrin. An isothermal titration calorimeter study. Journal of Chemical Thermod ynamics, 31: 1283-1296. Fox, G.J., Bloor, D.M., Holzwarth, J.F., & Wyn-Jones, E. (1998). Use of isothermal titration microcalorimetry to monitor the adsorption/desorption processes of sodium dodecyl sulfate with neutral polymers. Langmuir, 14: 1026-1030. Fujii, K., Takata, H., Yanase, M., Terada, Y., Ohdan, K., Takaha, T., Okada, S., & Kuriki, T. (2003). Bioengineering and application of novel glucose polymers. Biocatal ysis and Biotrans f ormation, 21: 167-172. Gessler, K., Usón, I., Takaha, T., Krauss, N., Smith, S.M., Okada, S., Sheldrick, G.M., & Saenger, W. (1999) .V-Amylose at atomic resolution: X-ray structure of a cycloamylose with 26 glucose residues (cyclomaltohexaicosaose). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 96: 4246-4251. Koizumi, K., Fukuda, M., and Hizukuri, S. (1991). Estimation of the distributions of chain length of amylopectins by high-performance liquid chromatography with pulsed amperometric detection. Journal of chromatography, 585: 233-238. Koizumi, K., Sanbe, H., Kubota, Y., Terada, Y., and Takaha, T. (1999). Isolation and characterization of cyclic α -(1→4)-glucans having degrees of polymerization 9-31 and their quantitative analysis by high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection. Journal of Chromatography A. 852: 407-416. Király, Z., & Dekány, I. (2001). A thermometric titration study on the micelle formation of sodium dodecyl sulfate in water. Journal of Colloid and Inter f ace Science, 242: 214-219. Kitamura, S., Nakatani, K., Takaha, T., & Okada, S. (1999). Complex formation of large-ring cyclodextrins with iodine in aqueous solution as revealed by isothermal titration calorimetry. Macromolecular Rapid Communications, 20: 612-615. Machida, S., Ogawa, S., Xiaohua, S., Takaha, T., Fujii, K., & Hayashi, K. (2000). Cycloamylose as an efficient. 124. 김용노.indd 124. 2010-04-16 오후 5:14:53.

(29) artificial chaperone for protein refolding. FEBS Letters, 486: 131-135. Majhi, P.R., & Blume, A. (2001). Thermodynamic characterization of temperature-induced micellization and demicellization of detergents studied by differential scanning calorimetry. Langmuir, 17, 3844-3851. Martin, G.G., & Petko M.I. (2009). Molecular dynamics of large-ring cyclodextrins: principal component analysis of the conformational interconversions. Journal of physical chemistr y B. 113: 5752-5759. Nimz, O., Gessler, K., Usón, I., Sheldrick, G.M., & Saenger,W. (2004). Inclusion complexes of V-amylose with undecanoic acid and dodecanol at atomic resolution: X-ray structures with cycloamylose containing 26Dglucoses (cyclohexaicosaose) as host. Carbohydrate Research, 339: 1427-1437. Nimz, O., Geβler, K., Usón, I., & Saenger, W. (2001). An orthorhombic crystal form of cyclohexaicosaose, CA26·32.59 H2O: comparison with thetriclinic form. Carbohydrate Research, 336: 141-153. Nimz, O., Geβler, K., Usón, I., Laettig, S., Welfle, H., Sheldrick, G.M., & Saenger, W. (2003). X-ray structure of the cyclothetohexaicosaose tri, G.d., &clusion complex prov.d.s a model for amylose-, G.M.,at atomic resolution. Carbohydrate Research, 338: 977-986. Ollila, F., Pentikáinen, O.T., Forss, S., Johnson, M.S., & Slotte, J.P. (2001). Characterization of bile salt/ cyclodextrin interactions using isothermal titration calorimetry. Langmuir, 17: 7107-7111. Park, J.H., Kim, H.J., Kim, Y.H., Cha, H., Kim, Y.W., Kim, T.J., Kim, Y.R., & Park, K.H. (2007). The action mode of Thermus aquaticus YT-14-α-glucanotransferase and its chimeric enzymes introduced with starch-binding domain on amylose and amylopectin. Carbohydrate Pol ymers, 67: 164-173. Seng, W.P., & Tam, K.C. (2000). Model alkali-soluble associative (HASE) polymers and ionic surfactant interactions examined by isothermal titration calorimetry. Langmuir, 16: 2151-2156. Shimada, J., Handa, S., Kaneko, H., & Takada, T. (1996). Conformation of novel cycloamylose: Topological aspects and simulations. Macromolecules, 29: 6408-6421. Sun, D.Z., Li, L., Qiu, X.M., Liu, M., & Yin, B.L. (2006). Cyclodextrins binding to paeonol and two of its isomers in aqueous solution. Isothermal titration calorimetry and 1H NMR investigations of molecular recognition. Journal of Solution Chemistr y, 35: 1537-1549. Szente, L., & Szejtli, J. (2004). Cyclodextrins as food ingredients. Trends in Food Science & Technolog y, 15: 137-142. Takaha, T., M. Yanase, H., Takata, Okada, S. & Smith, S.M. (1996). Potato D-enzyme Catalyzes the Cyclization of Amylose to Produce Cycloamylose, a Novel Cyclic Glucan. Journal of Biological Chemistr y, 271: 2902-2908. Takaha, T., Yanase, M., Takata, H., Okada, S., & Smith, S.M. (1998). Cyclic glucans produced by the intramolecular transglycosylation activity of potato D-enzyme on amylopectin. Biochemical and Biophysical Research Communications, 247: 493-497. Tomono, K., Mugishima, A., Suzuki, T., Goto, H., Ueda, H., Nagai, T., & Watanabe, J. (2002). Interaction between cycloamylose and various drugs. Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistr y, 44: 267-270. Ueda, H. (2002). Physicochemical properties and complex formation abilities of large-ring cyclodextrins. Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistr y, 44: 53-56. Wangsakan, A., Chinachoti, P., & McClements, D.J. (2001). Maltodextrin-anionic surfactant interactions: Isothermal titration calorimetry and surface tension study. Journal of Agricultural and Food Chemistr y, 49: 5039-5045. Wangsakan, A., Chinachoti, P., & McClements, D.J. (2004). Effect of surfactant type on surfactant-maltodextrin interactions: Isothermal titration calorimetry, surface tensiometry, and ultrasonic velocimetry study. Langmuir, 20: 3913-3919. Wangsakan, A., Chinachoti, P., & McClements, D.J. (2006). Isothermal titration calorimetry study of the influence. 신규 탄수화물인 cycloamylose의 건강기능성 포접복합체 형성능 규명. 김용노.indd 125. 125. 2010-04-16 오후 5:14:53.

(30) of temperature, pH and salt on maltodextrin-anionic surfactant interactions. Food H ydrocolloids, 20: 461-467. Yan, H., Kawamitsu, H., Kushi, Y., Kuwajima, T., Ishii, K., & Toshima, N. (2007). Calorimetric study on interaction of water-soluble copolymers with ionic surfactant. Journal of Colloid and Inter f ace Science, 315: 94-98. Zheng, M., Endo, T., Zimmermann, W. (2002). Synthesis of large-ring cyclodextrins by cyclodextrin glucanotransferase from Bacterial Isolates. Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistr y, 44: 387-390.. 126. 김용노.indd 126. 2010-04-16 오후 5:14:54.

(31)