JF M S E , 27(5), pp. 1491~1498, 2015. www.ksfme.or.kr 수산해양교육연구 제 권 제 호 통권 호, 27 5 , 77 , 2015. http://dx.doi.org/10.13000/JFMSE.2015.27.5.1491
. 서 론
Ⅰ
국내의 어류양식 생산량은 1990년도 2,656톤에 서 2013년도에는 73,108톤으로 증가하고 있으며 이 중 넙치가 36,944톤으로 전체 생산량의 50.5%
를 차지하고 있다(통계청 어업생산통계, 2013).
이와 같이 양식생산량이 증가함에 따라 질병의 발생도 빈번하게 일어나 2012년 5월 11∼ 월 사이 전국의 표본 양식 넙치 양식장의 질병에 따른 누 적피해율이 28% 가량으로 나타났다(Kim et al., 2012). 또한 질병에 의한 피해는 단독 감염이 주 를 이룬 양식 초기와는 달리 수온과 상관없이 연
중 다양한 병원체가 혼합감염의 형태로 질병을 일으켜 큰 피해를 나타내고 있다(Cho et al., 2008). 이렇게 넙치에 빈번하게 발생하는 세균성 질병을 예방하기 위해 백신의 사용량은 계속 증 가하여 백신을 처리한 넙치는 2008년 16,790,000 마리에서 2013년에는 34,332,000마리로 5년간 2배 이상 증가되고 있다 이러한 백신의 효과를 극대 화하기 위해서는 백신 접종 시 주의사항과 안전 수칙에 따라 접종해야 하며 특히 평소에 어류가 건강하고 안정된 상태에서 백신처리를 하는 것이 중요하다 이와 관련하여 현재 양식 어류의 면역 기능을 향상시켜 질병예방 및 성장촉진을 도모할
생약제 첨가사료가 넙치의 백신효과에 미치는 영향
황지연 권문경 서정수 김경덕 이예숙 정승희 국립수산과학원
( )
Effect of Herbs on Vaccine Efficacy to Olive flounder, Paralichthys olivaceus
Jee-Youn HWANGㆍMun-Kyoung KWON Jung-Soo SEO Kyoung-Duck KIM Ye-Suk LEE Sung-Hee JUNG ㆍ ㆍ ㆍ ㆍ (National Fisheries Research and Development Institute)
Abstract
In this study we investigated the effect of vaccine efficacy and immune activities by feeding additives several natural herbal remedies extracts of Sweet Wormwood (Artemisia annua), Galla Rhois, Oriental raisin tree (Havenia Dulicis) and 6-mixed herb to Oilve flounder, Paralichthys olivaceus.
Each group of fish fed with the herbal remedies added feed and basic formula during the seven weeks and vaccinated with Edwardsiella tarda Formalin killed vaccine after 4 weeks feeding. Relative Percentage Survival values (RPS) in the group was assessed by the challenge with E.tarda. All groups with the herbal remedies added feed enhanced growth rate, but there were not significantly different in lysozyme activity and agglutination titer. In a challenge experiment with E.tarda, RPS in the all groups feeding additives natural herbal remedies was higher than that of the control group. These results suggest that the natural herbal remedies extracts of Sweet Wormwood (Artemisia annua), Galla Rhois, Oriental raisin tree (Havenia Dulicis) and 6-mixed herb would be effective to enhance efficacy of vaccination to Olive flounder.
Key words : Natural herbal remedies, Vaccine efficacy, Immune activities
Corresponding author: 051-720-2492, [email protected]
2015 (R2015068)
.
수 있는 사료 첨가제는 현재 많이 개발이 되어 있으며 이중 생약제를 이용하여 사료첨가제로 이 용하려는 연구도 계속되고 있다(Kim et al., 2013) 약쑥, 삼지구엽초, 연교, 구절초, 박하 등의 열수 추출물(Jung et al., 2002), 오배자(Choi et al, 2005), 마늘 착즙액(Woo et al., 2010), 오배자 (Choi et al., 2005), 손바닥선인장줄기(Jung et al.,
황금 뿌리
2008), (Jee et al., 2012) 등의 추출물은 어병세균에 대하여 항균효과를 가지며 비특이적 면역능 증가를 통해 질병예방 효능이 있다고 보 고되고 있다
개똥쑥(Sweet Wornwood, Artemisia annua 은 곰) 팡이의 생장률을 억제시키는 항균효과에 관여한 다는 보고가 있다(Kim et al., 2001). 오배자(Galla
는 을 함유하고 있어 항바이러스 및 Rhois) tannin
항진균의 효과를 가지고 있다고 알려져 있으며 이전 연구에서 어병세균에 대한 항균활성도 확인 되었다(Choi et al., 2005). 헛개(Oriental raism tree, Hovenia dulcis 는 우리나라 전지역에서 자생하며 ) 최근에는 간보호 숙취해소 등의 효과가 알려져 , 건강음료로 개발되고 있으며 가축에서는 기능성, 사료로 항생제 대체 물질 연구가 활발하게 되고 있다. 2010년 농촌진흥청의 보고서에 따르면 헛 개나무 분말 2% 사료첨가시 증체량증가 폐사율 , 저감 면역성 활성화로 항생제 대체 물질공급 효, 과가 있다고 보고하였다. 또한 본 연구팀은 생 약제 추출물인 종혼합 고삼 귤피 금은화 동과6 ( , , , 자 자소엽 황금 첨가 사료가 넙치의 비특이적 , , ) 면역증강효능이 있음을 확인하여 특허 등록번호 (
를 등록하였다 10-1107034) .
본 연구는 이러한 생약제첨가 사료로 인한 비 특이적 면역에 관한 효과와 더불어 넙치의 백신 의 효능에 어떠한 영향을 미치는지 밝히기 위해 이전 연구에서 면역증강제로 알려져 있는 개똥 쑥 오배자 헛개, , , 6종 혼합물 고삼 귤피 금은화( , , , 동과자 자소엽 및 황금 의 종의 천연생약제 첨, ) 4 가 사료를 투여한 후 대조구와 비교하여 비특이 적 면역반응 백신효능에 미치는 영향 및 조직병,
리학적 관찰을 실시하였다.
재료 및 방법 .
Ⅱ
실험어 1.
실험어는 넙치 평균 ( 58.5g, 17.2cm)를 순환여과 식 50L 원형수조에 40마리씩 수용하였다 사육 . 실험은 주간 실시하였고 수온은 실험기간 동안 7
를 유지하였다
22~25℃ .
사료제작 및 성장도 조사 2.
본 실험에서 사용된 사료의 조성과 일반사료의 기준함량과 조성은 <table 1>과 같다 성분분석은 . 실험사료 수분을 135℃에서 시간 건조하여 측정2 하였으며 조단백질, (N×6.25)은 Auto Kjeldahl System
을 사용하여 (Gerhardt VAP50OT/TT125, Germany)
분석하였다 조지방은 조지방추출기. (Velp SER148, 를 사용하여 로 추출한 후 측정하였으 Italy) ether
며 조회분은 , 600℃의 회화로에서 시간 동안 태4 운 후 정량하였다.
천연 생약재로 알려진 각각의 건조 뿌리 100g 을 증류수 1,000㎖와 함께 시간 동안 중탕으로 3 끊여서 최종적으로 800㎖로 만들고 이를 시료원, 액으로 사용한다.
본 실험에 사용된 천연생약제 추출물은 개똥 쑥 오배자 헛개, , , 6종 혼합 황금 고삼 귤피 금( , , , 은화 동과자 자소엽 각각의 열수추출물로 사료 , , ) 무게에 대하여 최종 무게의 2%의 농도가 되도록 흡습시킨 뒤에 그늘에서 충분히 건조시켜 복합생 약제 열수추출물이 첨가된 사료를 만들었다 대. 조구는 복합생약제 열수추출물을 흡습시키지 않 은 EP사료만 공급하였으며 첨가사료를 일 회, 1 2 ,
주간 투여하였다
7 .
성장도 조사는 생약제 첨가사료 및 무첨가사료 를 먹인 후 실험어를 MS222로 마취시킨 후 체중 을 측정하여 평균 증중량 증중률 및 사료효율을 , 분석하였다.
(+) Control Ingredients (%)
Brown fish meal 65.0
Soybean meal 10.0
Wheat flour 19.8
Squid liver oil 3.0
Vitamin premix1 1.0
Mineral premix2 1.0
Choline chloride 0.2
-Celluloseα
Nutrient contents (% dry matter basis)
Crude protein 54.6
Crude lipid 9.7
Ash 11.4
1 Vitamin premix (g/kg premix): L-ascorbic acid, 121.2; DL- -tocopheryl acetate, 18.8; thiamin hydrochloride, 2.7; α riboflavin, 9.1; pyridoxine hydrochloride, 1.8; niacin, 36.4; Ca-D-pantothenate, 12.7; myo-inositol, 181.8; D-biotin, 0.27; folic acid, 0.68; p-aminobenzoic acid, 18.2; menadione, 1.8; retinyl acetate, 0.73; cholecalciferol, 0.003.
2 Mineral premix contained the following ingredients (g/kg premix): MgSO4·7H2O, 80.0; NaH2PO4·2H2O, 370.0; KCl, 130.0; Ferric citrate, 40.0; ZnSO4·7H2O, 20.0; Ca-lactate, 356.5; CuCl, 0.2; AlCl3·6H2O, 0.15; KI, 0.15; Na2Se2O3, 0.01; MnSO4·H2O, 2.0; CoCl2·6H2O, 1.0.
<Table 1> Ingredients and nutrient contents of experimental diets
비특이적 면역능 측정 3.
사료 투여 후 주 및 주째 천연생약제 첨가구 4 7 및 대조구의 넙치를 무작위로 선택하여 Parry et al.(1965)의 turbidimetric method를 이용하여 라이 소자임 활성을 측정하였다. 즉, Micrococcus lysodeikticus 0.2㎎ ㎖ / 현탁액(pH 6.2) 950㎕와 혈청 50㎕를 혼합하여 25 , 30℃ 초 및 분 4 30초간 반응시킨 후 530nm에서 흡광도를 측정하였다. 라이소자임 활성은 units/㎖ 로 나타내었으며, 1
는 흡광도 값이 감소한 양을 나타 unit 0.001/min
낸다.
병리조직학적 조사 4.
각 장기에 대한 육안 검사를 실시하고 병리조 직학적 검사에 필요한 장기를 적출하였다.
에 전 고정하고 시간 후 각 장 Bouin's solution 24
기를 세절한 다음 동일 고정액에 후 고정하였다.
고정이 완료된 후, 상법에 따라 포매하였다.
형 으로
Rotary microtome(Richert-Jung 820, Leica) 4 두께의 박편을 제작하여
5 Harris'
∼ ㎛
염색하여 광학현미경 hematoxyline-eosin(HE) (BX
하에서 관찰하였다 50F4, Olympus) .
응집항체가 5.
응집항체가는 백신 접종 주 후 실험구와 대조3 구의 넙치를 무작위로 선택하여 시험어의 미부정 맥에서 채혈하여 혈청을 분리하였으며 응집 항, 체가는 마이크로타이터(microtiter)법으로 조사하였 다 즉. , 96 well microplate well (Corning, USA)에 서 넙치로부터 분리한 혈청을 멸균생리식염수로 단계 희석한 후 시험 백신을 항원으로 사용하여 동량씩 반응시킨 후 24시간 후 응집괴 형성 유무 를 관찰하였다.
백신처리 및 에드와드병 인위감염 후 생 6.
존율조사
년 제주에서 분리한
2012 Edwardsiella tarda
을 백신균 및 공격균주로 사용하였다 분리
ET-1 .
한 E.tarda를 TSA액체배지에서 대량배양 후 분리 하여 0.3% 포르마린을 이용해 FKC를 제작했다. 섭이 주 후 실험구별로 4 40마리씩 1mg/마리로 복 강에 백신 처리한다. 다시 3주 후 E.tarda strain(1.2×106 CFU/fish)을 실험어의 복강에 주사 하고 일별 누적폐사율을 조사하였다 백신을 처. 리하지 않은 대조구에 대한 상대생존율 조사하였 다 상대생존율은 아래와 같이 계산하였다. .
상대생존율(%)={1-(시험구의 누적폐사율 대조구/ 의 누적폐사율)} × 100
통계처리 7.
대조구와 각 실험구 사이의 통계학적 유의성은 로 비교하였다
ANOVA (P<0.05).
. 결 과
Ⅲ
넙치의 성장 1.
각각의 생약제 열수추출물 2%를 첨가한 동량 의 사료를 먹인 넙치의 성장도 조사결과 실험종, 료인 주째 대조구의 증중률은 7 62.6%인 반면 개 똥쑥은 96.99%, 오배자는 128.46%, 헛개는
종 혼합은 로 모든 구에서 대조구 66.46%, 6 78.8%
보다 더 높은 값은 나타내었다 모든 실험구 중 .
특히 오배자 첨가구에서는 128.97%의 증가율을 보여 대조구보다 배 이상의 증중률을 확인할 수 2 있었다(<Table 2> 참조). 일반적으로 추출물의 경 우 어체의 체중의 증가나 성장도 개선에는 크게 효과가 없다고 알려져 있지만 (Yi et al., 1994)에 따르면 조피볼락에 미역을 사료에 첨가하여 투여 했을 때 사료 효율과 단백질의 효율이 상승되면 서 성장이 향상된다는 보고가 있어 본 실험에서 , 사용된 생약제 첨가 사료는 이와 유사한 역할로 성장을 향상시키는 것으로 생각된다. 첨가제의 농도에 맞게 사용할 경우 성장에도 도움을 줄 수 있을 것으로 보인다 본 실험에서는 모든 생약제. 의 열수추출물 2%를 이용하였는데 각각의 적절 한 농도는 좀 더 연구가 필요할 것으로 보인다.
넙치의 면역활성 2.
생약제 첨가 사료를 급이한 주 후 첨가사료 7 , 투여구 및 무첨가사료 투여구의 라이소자임 활성 을 비교한 결과 투여 주 후에는 오배자와 헛개, 4 의 활성도가 낮게 나타났지만 투여 주 후에는 7 생약제 첨가구의 백신 처리구의 값은 모두 증가 함을 확인할 수 있었으나 대조구와 유의적 차이 는 없었다(<Table 3> 참조). 본 실험의 생약제
열수추출물 첨가 사료가 넙치의 비특이적면 2%
역에는 영향을 미치지 않았다 이전 연구에서 다. 른 어종에서 개똥쑥 오배자 헛개, , , 6종 혼합 황금( ,
Artemisia
annua Galla Rhois Havenia
Dulicis 6-mixed herb Control
number of tested fish 10 10 10 10 10
Initial body
weight(g)/length(cm) 56.5/17.73 54.2/17.5 63.8/18.58 59.9/17.95 62.3/18.22 Final body
weight(g)/length(cm) 111.3/22.55 124.1/23.25 106.2/23.25 106.8/21.85 101.3/22.99 Increased body weight
(%)/length(%) 96.99/27.19 128.97/32.86 66.46/25.13 78.80/21.73 62.6/26.18
<Table 2> Change of body weight in the Olive flounder, Paralichthys olivaceus, after 7weeks feeding of the herbal remedies added feed and basic formula
Group Time
Artemisia
annua Galla Rhois Havenia
Dulicis 6-mixed herb Control(PBS) 4 weeks after fed 60.22
±38.85
29.70
±12.20
27.19
±8.23
66.74
±6.78
61.26
±5.44 7 weeks after fed 75.41
±13.00
92.30
±7.34
82.74
±13.09
70.44
±5.55
60.15
±10.04
<Table 3> Lysozyme activity in the serum of the olive flounder (Units/mL).
고삼 귤피 금은화 동과자 자소엽 경우 비특이, , , , ) , 적면역 증강에 기여한다는 보고가 있으나 본 연 구에서는 어종과 면역기전의 차이로 본 연구의 결과와는 직접적인 상관관계를 찾을 수는 없었 다 그렇지만 백신처리 이후 라이소자임의 활성. 이 증가한다는 결과는 확인할 수 있었다.
백신 효능증진 결과 3.
생약제 첨가 사료 투여구 및 무첨가 사료 투여 구에 백신을 처리한 후 응집항체가를 조사하였다 모두 백신 처리 후 주 후 응집항체가
([Fig. 1]). 3
를 조사한 결과 모든 시험구에서 같이 백신을 , 투여한 무첨가 사료 투여구보다 생약제 첨가 사 료 투여구의 응집항체가가 보다 높게 나타났으나 대조구와 유의적 차이는 없었다.
백신 처리 주 후 3 ET-01의 생균을 이용하여 인위감염 후 누적폐사율을 조사하였다([Fig. 2]).
그 결과 폐사율은 , PBS대조구 95%을 보인 반면, 일반사료 백신구는 25%, 오배자 첨가구는 22.5%,
종혼합 첨가구 개똥쑥 첨가구는
6 17.5%, 12.5%,
헛개첨가구는 10%의 폐사율을 보여다 상대생존. 률은 일반사료 백신구는 73.6%, 오배자 첨가구는
종 혼합 첨가구 개똥쑥 첨가구 76.3%, 6 81.5%,
는 86.8%, 헛개 첨가구는 89.4%의 상대생존률을 보여 모든 생약제 첨가 사료 투여구가 무첨가 사 료 투여구에 비해 높은 백신 효능을 확인할 수 있었다 이전 연구에서도 어류에서 백신 처리전 . 면역증강제를 처리할 경우 백신의 효능이 높아진 다는 보도가 있다 구기자 첨가사료가 틸리피아. 의 에드와드(Edwardsiella tarda 백신 효능을 증) 진시키거나 미역을 참돔에 투여하였을 때 Pasteurella piscicida백신의 효능을그리고 클로렐 라 추출물을 감성돔에 투여했을 때 비브리오백신 의 효능을 증진시킨다는 보고가 있다(Kwon et al., 1998, Sato et al., 1987).
[Fig. 1] Agglutination titer in the serum of the olive flounder after immunization.
[Fig 2] Cumulative mortality of the olive flounder, challenged with 1.2×106 CFU/fish of E.tarda strain (n=40).
조직학적 검사 4.
생약제 첨가 사료 투여 후 주째 모든 시험구7 의 간 신장 및 비장에서 조직학적 변화를 관찰, 한 결과 모든 조직에서 병변은 관찰되지 않았다, 개똥쑥 첨가 사료구에서는 약간의 지 ([Fig. 3]).
방간이 관찰되었으나 비장과 신장은 정상이였다. 종 혼합 투여구 역시 각 조직의 특별한 병변이 6
관찰되지 않아 사료첨가구에 의한 부작용은 없는
것으로 판단되었다 그러나 헛개 첨가 사료구에. 서는 간응축이 관찰되었으며 오배자의 경우 간에 서 응축 빛 핵 비대가 관찰되어 적절한 섭이 농, 도 및 기간에 대한 연구가 필요한 것으로 보인 다 이러한 결과로 보아 천연물의 생약제제. 는 복 합제제로써 함량이나 제조법 등이 불규칙하여 농 도 및 추출방법 등의 표준화가 필요하다고 보아 진다
Group Tissue
Artemisia annua 개똥쑥
( )
Galla Rhois 오배자
( )
Havenia Dulicis 헛개
( ) 6-mixed herb Control(PBS)
Kidney
Spleen
Liver
[Fig. 3] Histological changes of the tissues of the olive flounder, paralichthys olivaceus after 7 weeks feeding by 2% herbal extracts(H&E stains).
. 고 찰
Ⅳ
본 실험에서는 넙치 사료에 개똥쑥 오배자 헛, , 개 및 종혼합물의 열수추출 원액을 배합사료에 6 첨가하여 최종 2% 농도로 양식어류에게 주간 7 투여할 경우 어류의 성장도 및 백신효능 증진에 , 관한 효과를 알아보았다. 사료첨가제를 섭이한 실험구는 대조구에 비해 상장도 및 백신의 효과 가 증가하는 것을 확인하였다 오배자 첨가구가 . 성장률이 가장 뛰어났으며 모든 사료 첨가구에서 혈청의 라이소자임 활성과 응집항체가도 전반적 으로 향상되었으나 유의적인 차이는 없었다. 또 한 세균백신에 대한 효능도 일반사료 투여구에 비해 헛개 첨가구가 상대생존률이 가장 높은 것 을 확인할 수 있었다. 조직병리학적 검사결과, 오배자 첨가구는 간에서 핵비대 및 간세포 응축 이 관찰되어 관련 기작과 농도 추출방법에 대한 , 연구는 좀 더 필요하다고 생각된다.
이러한 천연생약재를 이용한 사료첨가제의 연 구는 백신을 효능을 극대화하여 건강한 양식수산 물의 안정적인 생산을 위한 효과적인 대처방안이 될 수 있으리라 생각된다.
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Received : 09 September, 2015 Revised : 07 October, 2015 Accepted : 13 October, 2015
