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서론
연구의 배경 1.
심부전의 발생을 32년 동안 매년 관찰한 프래밍햄 연구에서 심부전의 발생은 연령 이 많아짐에 따라 증가하며 특히 75세 이상에서 급격한 증가를 보인다 (Ho KK et 심부전은 유럽에서 세 이상 환자에서 입원 원인의 이상을 차지하
al. 1993). 70 70%
고 미국에서는 65% 이상 노인 입원의 가장 흔한 원인이다 심부전 환자에서 동반된. 질환으로는 고혈압과 관동맥 질환이 가장 흔하여서 좌심실에 대한 만성 압력부하와 관동맥질환이 심부전 발생의 가장 중요한 원인임을 시사하고 있다 또한 최근 선진국. 을 중심으로 노령화가 가속화 되고 있으며 이로 인해 고혈압의 유병률이 증가하고 있 으며 고혈압이 중요한 위험 인자로 작용하는 급성 심근 경색이 더불어 증가하고 있다.
급성 심근경색의 초기단계에서 체계적인 환자 이송과 적극적인 혈관 재개통술 심근, 허혈에 의하여 발생하는 심실성 부정맥에 대한 치료의 발전으로 인해 심근 경색 초기 사망률은 감소하는 추세에 있다 하지만 광범위한 심근경색을 가진 환자들의 초기 생. , 존율이 증가하면서 역으로 후기 심부전의 발생률은 증가하게 되었다 심근경색 후에. 발생하는 심부전은 좌심실의 수축기 기능을 감소시키며 심근벽의 지속적인 허혈성 괴사로 인한 박막화가 동반되어 심실의 재형성을 초래하게 되고 이로 인해 심부전은 더욱 가속화된다 근래에 들어 심부전의 치료에 베타 차단제. ( -blocker),β 안지오텐신 전환효소 저해제(angiotensin converting enzyme inhibitor) 등의 심부전의 장기적인 사망률을 감소시키는 약제들이 사용되고 있음에 불구하고 진행성 심부전의 5년 생존 율은 50% 정도로 악성 종양 질환의 예후와 유사할 정도로 좋지 않다(Thomas SA et 심근 경색후에 발생하는 심부전의 치료에는 많은 방법들이 있지만 심장이 al. 2003).
식을 제외하고는 효과가 그리 크지 않다.
는 분열능력이 거의 없기 때문에 심근세포의 소실이 있는 Adult cardiac myocytes
경우 심부전이 발생하게 된다 따라서 소실된 심근 세포의 자리를 채우기 위해 개발된.
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줄기세포를 이용한 심근재생 치료법은 최근 5년 동안 괄목할 만한 성장을 하게 된다. 이러한 줄기 세포를 분류하는 방법에는 여러 가지가 있지만 크게 분화능력에 따른 분 류, cell marker에 기초를 둔 분류 등이 있지만 보편적인 분류는 embryonic stem
과 로 나누어 설명하고 있다 이중 은
cell adult stem cell . embryonic stem cell
의 로부터 얻어지며 최근
embryonal blastocyst inner cell mass human embryonic
이 심근세포로 분화한다는 보고가 있었다 비록
stem cell (Kehat I et al. 2001).
이 하고 하지만 윤리적인 측면과
embryonic stem cell highly expandable pleuripotent
분리에 힘들다는 점 그리고 거부반응의 단점이 있어 임상적인 응용 단계까지 가는데 많은 문제점을 안고 있다. 하지만 중간엽 줄기 세포 (Mesenchymal stem cells;
는 아직까지 가 발견되지 않았다는 단점은 있으
MSCs) specific identification marker
나 쉽게 얻을 수 있으며 윤리적인 문제가 없고 autologous transplantation이 가능하 여 immune-suppressive therapy가 필요하지 않다는 장점이 있다 (Bodo E. et al.
중간엽 줄기 세포 또한 심근세포의 형태로 분화할수 있으며 이는 여러 면역학 2003).
적인 기법을 통해 밝혀졌었다 (Toma C et al. 2002). 기존의 연구들은 일관되게 심 근 내 중간엽 줄기 세포 이식을 통한 심기능의 호전을 보고하고 있으나 (Tomita S et 이 같은 심기능의 호전은 al. 1999, Kamihata H et al. 2001, Orlic D et al. 2001),
정상 심근과 같은 기능을 하는 완전한 심근 재생이라기 보다는 재형성 과정의 차단과 같은 불완전한 형태의 심근 재생 효과에 의한 것일 가능성이 큰 것으로 판단되고 있 다 기존의 심근 세포와 유기적 연결을 형성하면서 동기화된 수축과 이완을 수행하는. 완벽한 심근을 재생하기 위해서는 심근 세포와 이식 세포간의 기계적 전기적 연결의, 완성이 전제되어야 한다 또한 심장 내로 이식된 이식 세포에 의해 세포간의 전기적. 연결이 손상되거나 부적절한 전기적 자극이 발생하게 되면 치명적인 부정맥을 유발할 수 있다는 가능성이 제시되고 있어 (Menasche P et al. 2003), 세포간의 정상적인 전기적, 기계적 연결 형성에 대한 연구가 필요하다. 중간엽 줄기 세포는 GATA4, 과 같은 심근 특이 유전자들을 소량 발현함을 관찰 Troponin T, MEF2c, Connexin43
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할 수 있으나 계대 배양의 passage가 증가하면서 이러한 특성이 점점 감소하는 것으 로 알려져 있다 그러나 이러한 줄기 세포에서. Connexin 43등의 발현 저하를 극복하 기 위해 심근 세포와의 공배양 (Iijima Y et al. 2003), connexin 43 유전자 과발현
등이 시도 되었으며 이를 통해 형성과 분화의 촉진
(Suzuki et al. 2001) gap junction
을 유도할 수 있었다는 결과가 보고되기도 하였다 그러나 이 같은 연구 결과 들이 추. 시 연구에서 다른 결과를 보이거나 동물 실험에서는 재현되지 않는 등의 제한점으로, 인해 연구자들 사이에 논란이 있는 상태이다.
기존 연구의 결과들을 살펴보면 동물의 심근 내로의 골격근 모세포를 이식한 경우 이식된 골격근 모세포가 심근 세포와 동일한 방향으로 배열하고 심근 세포 사이로 편, 입하는 현상을 자주 관찰할 수 있으며 이 같은 유기적 연결의 형성은 심근 경색 부위, 에 이식된 세포보다는 경색 주변 부위에서 좀 더 흔히 관찰된다고 보고하고 있다 이 같은 현상은 세포 배양에서는 관찰되지 않았던 것 (Chedrawy EG et al. 2003).
으로 심근 세포와의 상호 작용이 골격근 모세포의 분화와 심근 내로의 유기적 결합에, 중요한 역할을 하며 심장 내의 반복적인 수축과 이완에 의한 압력 변화 등의 물리적, 환경 또한 중요한 역할을 할 수 있음을 시사하고 있다.
연구의 목적 2.
현재까지의 연구들을 보면 중간엽 줄기 세포 이식을 통한 심기능 호전의 기전에 대 해서 확실히 밝혀져 있지 않은 상태이다 따라서 본 연구는 백서를 이용한 심근 경색. 모델을 확립하고 여러 가지 surface marker에 대한 분석으로 중간엽 줄기 세포의 특 성을 살펴보고 이식된 중간엽 줄기 세포가 심장내에서 심근 세포로 분화하는지를 확 인하고 또한 주변 심근 세포와 gap junction을 이루는 지를 알아보고 세포의 이식 여 부에 따른 심기능의 회복을 심장초음파를 통해 확인하고자 한다.
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연구 대상 및 방법
연구 대상 동물 1.
중간엽 줄기 세포를 분리하고 심근 경색 모델에 이용된 백서는 11 주령의 Fischer 백서 대한 바이오 링크 충북 한국 를 이용 하였으며 동물실에서 약 주
344 inbred ( , , ) 1
간의 검역 및 순화기간을 거쳐 건강한 동물만을 선발하여 사용하였다 사육환경은 온. 도 22±2 ,℃ 상대습도 50±10%, 환기횟수 12-18 /회 시간, 조명 12시간, 조도
룩스를 유지하였으며 동물 케이지 에
150-300 , polycarbonate (260X420X180mm) 마리씩 사육하였다 순화기간을 거쳐 실험에 사용될 당시 체중은 주
2-3 . 220-250g, 12
령 상태였다.
연구대상세포의 배양 2.
골수 유래 중간엽 줄기 세포는 안트로젠㈜로부터 공급 받았으며 방법을 간단히 살 펴보면 심근 경색 백서를 만들기 1주일 전에 희생시킨 Fisher 344 백서의 대퇴골을 근육이나 다른 조직이 붙어있지 않게 잘 떼어내고 오염원을 제거하기 위하여 여러번 로 세척한다 이후 뼈의 양끝을 를 사용하여 잘라 내고 이를 포셉으
HBSS . bone cutter
로 잡고 주사기로 배지를 빠른 속도로 통과시켜 빠져 나온 세포들을 원심분리하여 모 으고 flask에 접종하여 키운다 약. 3일 후 조심스럽게 배지를 제거하고 새로운 배지로 갈아주고 5~6일 째에 subculture 하고 며칠 후 subculture하여 제 2 계대 배양을 통 해 중간엽 줄기 세포를 확보한다 또한 중간엽 줄기 세포에. vybrant DiI (molecular 를 이용하여 표지를 한 후 심근 경색 모델 한 마리당 필 peobes, Eugene, OR, USA)
요한 세포 수인 1X106개 만큼 분리하여 저온 상태에서 이동하였다.
연구 대상군 3.
중간엽줄기세포가 심근세포로 분화 하는지와 세포의 이식 여부에 따른 심기능의 호
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전을 분석하기 위하여 다음과 같은, 3개의 연구군을 대상으로 연구를 시행하였다.
만 시행한 군 [1]. Sham operation
심근 경색을 시행 한 후 를 주입한 군
[2]. media
심근 경색을 시행 한 후 중간엽 줄기 세포를 주입한 군 [3].
을 이용한 특성 분석 4. Fluorescence activated cell sorting MSCs
를 시행하여 심근세포의 특이 단백질 발현에 대해 분석하였다 구체적
FACS analysis .
인 방법은 다음과 같다. 1x106이 되도록 cell을 PBS에 현탁시킨 후 약 100 mL의 양 을 조정하였다. anti-Troponin T (Santa cruz Biotechnonolgy, Goat monoclonal antibody), anti-Connexin 43 (Santa cruz Biotechonology, Rabbit monoclonal 를 각각 를 첨가한 후 실온에서 시간 동안 반응을 하였다 이 후
antibody) 10mcL 1 .
를 첨가한 후 으로 분간 원심분리하고 침전된 세포를 로 재현탁시키는
PBS 400g 5 PBS
과정을 3번 반복하여 세포를 수세하였다. Fluorochrome라벨 된 항 면역글로불린 항 체(DAKO Goat Immunoglobulins-FITC, DAKO Rabbit Immunoglobulins-FITC)를 로 희석하여 적어도 분간 실온에서 배양한 후 번 수세하였다 위의
3% BSA/PBS 30 3 .
과정에서 준비된 세포를FACS (Fluorescence-activated cell sorter, FACS Caliber
Ⓡ, BD)로 분석하였다.
을 통한 중간엽 줄기 세포의 기본 특성 파악 5. RT-PCR
심근 경색 부위에 중간엽 줄기 세포를 주입 한 후의 심근 세포로의 분화가 어느 정 도로 진행하는 지에 대한 대조의 목적으로 중간엽 줄기 세포의 total RNA 를 분리한 후 , Table에 기술된 조건을 이용하여 reverse transcriptase-polymerase chain
방법을 통하여 심근특이 유전자인
reaction (RT-PCR) α β, Myosin heavy chain, 그리고 의 발현 정도를 평가하였다 Connexin 43, Troponin T, GATA4,MEF2c ANP
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Table 1. Primers used for RT-PCR (Renicke JH et al. 2002)
심근 경색 모델의 확립과 중간엽 줄기 세포의 심근내 주입 6.
심근 경색은 다음과 같은 방법으로 유도하였다. 실험동물에게 케타민 (Ketamin)
와 자일라진 를 혼합하여 복강내로 주사하여 전신마취
100mg/kg (Xylazine) 10mg/kg
를 유도한 후 16 gauge 정맥 내 유치 카테타를 기관내로 삽입하고 소동물용 인공호 흡기 (Harvard rodent ventilator model 683, Harvard apparatus, Holliston, MA, 를 이용하여 일회 호흡량 전 후 분당 회로 양압 기계환기를 실시하였다
USA) 2cc , 90 .
좌측 제4 늑간을 절개하고 흉곽으로 들어간 뒤 심막을 절개하고 수술용, 6-0 백색 견 사를 이용하여 좌측 관동맥이 주행한다고 추측되는 우심실 유출로와 좌심방이 사이의 심근을 묶어 관상동맥의 혈류를 완전 차단시켰다 이어 흉곽을 차례로 봉합하고 흉곽. 내의 공기를 제거하여 기흉이 발생하지 않도록 처치하고 피부를 봉합한 후 기계환기
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로부터 서서히 이탈하여 소생시켰다 심근 경색. 1주일 후 동일한 방법으로 개흉한 후 준비된 중간엽 줄기 세포를 경색조직 변연부의 심근에 주입하였다 주입된 세포의 수. 는 각각 1X106개로 총 용량은 배양액을 포함하여 100 lμ이다. 세포의 주입은
에 주사 바늘을
Hamilton syringe(Hamilton company, Reno, NV, USA) 22 gauge
연결하여 시행하였다 주입 위치는 좌심방이. (left atrial appendage)를 젖혀 올리고 심 실 전체가 드러나게 한 후 심실 기저부에서 심실 중간부의 기저부측 1/3 부위에 심실 이 창백해진 부위 좌 우측에 주입하였으며, 4군데에 나누어 주입하였다 주입 당시 먼. 저 심근에 바늘을 찌르고 주사기의 피스톤을 후진하여 혈액이 역류하는 것이 없음을 관찰하여 심실강내에 바늘이 들어가 세포가 심실내강의 혈류로 유입되는 것이 없음을 확인하였다 적절한 주입이 되면 주입 부위가 부풀어 오르게 된다. . 경색을 만든 뒤 백서는 사육 상자 하나에 2-3마리씩 넣은 다음 상기와 같은 서식 환경에서 물과 표준 사료를 제한 없이 먹이고, 12 시간의 낮과 밤의 주기를 유지할 수 있는 장소에서 사 육하였다.
심초음파 검사 7.
실험동물의 좌심실의 기능변화를 관찰하기 위하여 4번에 걸쳐 Acuson 128-XP 심 초음파 시스템(Acuson, FL, USA)에 7.0MHz 탐촉자(probe)를 부착하여 심초음파 검 사를 실시하였다 두명의 검사자가 이중 맹검으로 심장초음파를 시행하였으며 모든 측. 정값은 최소한 3개 이상의 비트에서 측정한 값의 평균으로 계산하였다 심근 경색을. 만들 때와 같은 약물과 용량으로 복강내 주사로 마취를 유도한 후 기계환기 없이 경 색을 만들기 최소한 사흘 전에 경색 전 기초 심초음파 검사를 실시하였고 세포 주입 직전인 경색유도 7일째 경색유도, 4주째 그리고 경색유도 8주후에 심초음파 검사를 반복적으로 실시하여 경색의 유무를 관찰하고 미국 심초음파 학회의 권고사항에 따라 이면성(2 dimensional) 심초음파 검사를 실시한 후 100mm/sec의 속도로 M-mode 심초음파 검사를 실시하여 좌심실 이완기말 직경(LVEDD, left ventricular
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end-diastolic dimension), (LVESD, left ventricular end-systolic 전벽과 후벽의 수축기와 이완기의 두께
dimension), (AWT, anterior wall thickness, 를 측정하였고 이로부터 좌심실 내경 단축율
PWT, posterior wall thickness) (FS:
과 좌심실 구혈률 fractional shortening = ((LVEDD-LVESD)/LVEDD) X 100)
을 계산하였다 심근경색 유 (Ejection fraction = (LVEDD^3 - LVESD^3)/LVEDD^3) .
도의 성공은 전벽의 수축력이 감소하여 벽운동이 없어진 것으로 경색유도 7일 후 의 심초음파 검사 에서 결정하였다 심초음파 결과의 분석은 심근경색이 성공적으로. 유도된 백서를 1 /2 /3군 군 군 각각 10/14/15마리로 배정 하였다.
조직학적 분석 8.
관류 고정후 적출된 심장은 좌 우심방과 우심실을 조심스럽게 분리하고 조직 절단, 을 위한 몰드에 적출한 심장을 올리고 심장의 기저부에서 심첨에 이르는 장경에 수직 이 되도록 심장을 3등분하였다 이후 기저부. 1/3 부분만을 조직검사에 이용하였다 이. 조직은 파라핀 블록을 만들고 5 mμ 두께로 박절하여 각 심장당 40-50장의 조직편을 얻었다 박절된 조직편은 기저부에서 심첨부 방향으로 일련번호를 붙이고. 1, 4, 7,
번의 조직편은 염색을 실시하였고
10, 13 H&E(Hematoxylin & Eosin) 2, 5, 8, 11,
번의 조직편은 염색을 시행하였으며 번
14 MT(Masson's trichrome) 3, 6, 9, 12, 15 의 조직편은 면역세포염색을 실시하였다 (Scarabelli T et al. 2001). H&E 염색조직 과 MT 염색조직 중 기저부로부터 다섯 절편을 4배 시야에서 디지털화하고 Image 을 경색둘레 비율 analysis system(Scion Image, Scion Corporation, USA)
경색부위 외경 심장 외경 을 계산하였다 (infarction circumference ratio (%)=( / )X100)
(Shyu KG et al. 2002). 또한 Image analysis system을 이용하여 경색부위의 면적 을 측정한 후 다음과 같은 방법으로 경색 면적 비율 (infarction area ratio (%)=(경색 부위 면적 전체 좌심실벽 면적/ )X100)을 구하였다. 경색둘레 비율과 경색면적 비율은 경색유도 8주후 조직에서 측정하였으며 양 군에서 5마리씩을 사용하였다 그러므로.
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각 백서당 다섯 절편 그리고 다섯 마리를 사용하였으므로 각 군당 25절편에서 경색 둘레 비율과 경색 면적 비율을 구하여 평균하였다.
면역 세포 염색을 통한 심근 세포 분화 증명 9.
경색후 8주째 적출된 심장으로 면역 세포염색을 시행하였다 면역 세포 염색을 위하. 여 조직을 4% paraformaldehyde를 이용하여 15분간 고정하였다 면역 세포 염색을. 통하여 분석을 시행하였으며, 이때 이용된 항체는 anti-Troponin I (Santa cruz Biotechnonolgy, Goat monoclonal antibody, 1:100), anti-Connexin 43 (Santa 였다 형광 이차 항체는 cruz Biotechonology, Rabbit monoclonal antibody, 1:100) .
각각 TRITC-ConjugatedGoat Anti-Mouse Immuno-globulin (ZYMED, U.S.A.), FITC-Conjugated Rabbit Anti-Mouse Immunoglobulin(DakoCytomation, Denmark) 을 이용하였다.
통계적 분석 방법 9.
통계적 분석은 SPSS 10.0 (SPSS. Inc) 프로그램을 이용하여 시행하였으며 연속, 변수에 대해서는 Wilcoxon rank sum test를 시행하였고 유의수준, 0.05를 적용하여 통계적 유의성을 평가하였다.
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연구 결과
골수 유래 중간엽 줄기 세포 특성 분석 1.
제대혈 유래 중간엽 줄기 세포의 표면항원을 확인하기 위해 FACS 분석을 시행하였 다. CD14, CD34 (gp105-120), CD45 (leukocyte common antigen), CD51-61,
그리고 등의 혈액관련 항원은 모두 음성이었으며 골수 또는
HLA-DR. Stro-I ,
기원의 중간엽 줄기 세포에서 양성으로 알려져 있는
Embryonic Stem cell integrins
CD29 (β1-integrin), CD44 (hyaluronate receptor), CD105 (endoglin), CD90 그리 고 CD166 등의 항원은 모두 양성이었다 그림( 1).
Figure 1. Surface markers of mesenchymal stem cells
A) Positive surface molecules (markers of mesenchymal stem cells).
B) Negative surface molecules (markers of hematopoietic cells).
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또한 cardiomyocyte-specific transcription factors의 분석을 위한 RT-PCR 분석에 서 양성대조군인 인간심근세포에서는 모든 심근세포 특이 유전자의 발현을 관찰할 수 있었으며 중간엽줄기세포는 자체로 어떠한 전처치를 하지 않아도 GATA4, Troponin 와 같은 심근특이 유전자들을 극히 소량 발현함을 관찰할 수 T, MEF2c, Connexin43
있었다 그림( 2).
Figure 2. RT-PCR analysis of cardiomyocyte-specific transcription factors.
Mesenchymal stem cells already expressed GATA-4, MEF-2c and ANP and human myocardium was used as positive control. GAPDH is internal control.
심초음파 검사 2.
기초 심초음파 검사와 경색유도 7일째 경색유도, 4주째 그리고 경색유도 8주후에 실 시된 심초음파 검사의 결과 특히, 8주째 각군의 결과는 Table 2와 같다 경색유도. 1
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주일 후 심초음파 검사에서 경색부위가 분명하지 않거나 경색부위가 관찰되지 않아 추적검사가 어렵거나 경색 유도의 실패가 의심되는 대상동물은 도살하고 기초 심초음 파 검사 결과 등을 없애고 추적에서 제외시켰다.
Table 2. Transthoracic echocardiographic measurements of rat heart at 8 wks
기초 심초음파 검사에서 양 군의 좌심실 이완기말 직경과 수축기말 직경 좌심실 내, 경 단축율 등의 심초음파적 지표들은 유의한 차이가 없어 동일 조건의 심장 기능을 가진 대상 동물이 선정되었음을 확인하였다 심근 경색후. 8주때 실시된 심초음파 검사 에서 media injection group과 MSCs injection group간에 좌심실 이완기말 직경
과 좌심실 수축기 후벽두께
(0.64 ± 0.05 cm vs 0.61 ± 0.12 cm, p=NS) (0.21 ± 는 통계적으로 유의한 차이가 없었으나 좌심실 0.05 cm vs 0.20 ± 0.03 cm, p=NS) ,
수축기말 직경 (LVESD; 0.50 ± 0.07 cm vs 0.45 ± 0.12 cm, p<0.05), 좌심실 내 경 단축율 (0.22 ± 0.07% vs 0.28 ± 0.08%, p<0.05), 좌심실 구혈률 (0.51 ±
좌심실 수축기 전벽 두께
0.13% vs 0.61 ± 0.12%, p<0.05), (0.08 ± 0.02% vs 에 유의한 차이가 있었다 그림 상기 결과를 종합하면 중 0.12 ± 0.04%, p<0.05) ( 3).
간엽 줄기 세포를 이용한 심근 경색 치료가 media group에 비해 좌심실 수축기말 직 경을 감소 시키고 좌심실 수축 기능을 향상 시키고 전벽의 수축기 두께를 유지시켜 전반적인 심기능의 호전을 가져오게 된다는 점을 알 수 있겠다 또한 그림. 4를 보면 각 군사이의 이면성 심초음파와 M-mode를 보여주고 있는데 각군 마다의 특징을 잘
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A. B. C.
Figure 3. Changes of echocardiographic data after MSC injection
A) LVESD was smaller in MSC group than media group. B) Improved LV systolic function in MSC group. C) LVAWT was thicker in MSC group than media group. (* p<0.05)
조직학적 분석 3.
경색유도 8주후의 심장조직 검사에서 경색둘레 비율 (infarction circumference
은 주입군에서 주입군에 비하여 유의하게 작았으며
ratio) MSC media (22.5 ± 6.8%
그림 경색면적 비율 도 역시
vs 29.6 ± 5.4%, p<0.05) ( 5), (infarction area ratio) 주입군에서 주입군에 비하여 유의하게 작았다
MSC media (24.7 ± 7.4% vs 31.7 ±
6.5%, p < 0.05).
- 14 - Figure 4. Echocardiogram at 8 weeks after injection
A. Sham operation group - normal echocardiographic findings
B. Media injection group - dilated left ventricle and akinesia of anterior wall C. MSC injection group - borderline left ventricular cavity size and akinesia of anterior wall
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MSC injection Media injection
Figure 5. Morphologic study at 8 week after myocardial infarction.
(* p<0.05)
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심근세포와 중간엽 줄기세포 상호 작용에 의한 분화유도 4.
심근특이 단백질의 발현과 세포 세포 연결을 알아보고자 심근 경색후- 8주째 희생된 백서로부터 얻은 조직으로 면역형광염색을 실시하였다. DiI로 염색된 중간엽 줄기 세 포에 Connexin 43이 발현됨을 관찰할수 있었으며 (총 15마리중 2마리, 13.3%) 의 발현은 기존의 심근세포와 중간엽 줄기 세포 사이에서 발현됨을 관찰 Connexin 43
할 수 있었다 그림( 6). 또한 DiI 로 염색된 중간엽 줄기세포가 cardiac Troponin I 를 발현함을 관찰할 수 있었다 총( 15마리중 5마리, 33.3%). Connexin43 은 세포와 세포사이에 gap junction을 이루는 데서 중요한 역할을 하는 단백질로 알려져 있으며 이러한 단백질의 발현은 주로 DiI로 염색된 중간엽줄기세포와 염색되지 않은 심근세포 사이에 형성되었다 반면 중간엽줄기세포들 사이에서는 관찰되지 않아 세포 세포간의. - 을 이루는데 있어서는 심근세포가 중요한 역할을 할 것으로 생각되는 gap junction
결과라 하겠다.
Figure 6. Immunohistochemical staining suggest MSCs differentiation to cardiomyocytes after in vivo implantation.
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Connexin 43 expression (Upper), Cardiac Troponin I expression (Bottom) at 8 weeks after MSC injection.
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고찰
골수 유래 중간엽 줄기 세포 특성 1.
지난 수년동안 줄기 세포를 분리하기 위해 embryonic, fetal, adult tissue등을 이 용하여 왔다 이러한 연구들 중에 많은. adult tissue들로부터 줄기 세포들이 발견이 되고 이러한 줄기 세포는 조직의 재생과 치료에 기여하고 있다는 사실이 알려지면서 학계는 술렁이게 된다 중간엽 줄기세포는 골수내 세포중에. 0.001% - 0.01%의 빈도 로 존재하는 세포이기는 하지만 배양을 하게되면 쉽게 증식하기 때문에 줄기세포 치 료에서의 사용에는 제약이 없다.
골수로부터 분리된 fibroblastic한 세포를 일반적으로 bone marrow stromal cell이 라고 명명하는 데 이러한 stromal cell 모두에게서 multipotent한 능력이 있는것은 아 니다 (Pittenger MF et al. 1999). 여러 연구자들의 연구에 의해 발견된 stromal cell 에 포함되는 다양한 세포들은 여러 연구자들 사이에서 서로 다른 이름으로 불리워 지 고 있어 매우 혼란스럽다 또한 이러한 다양한 세포를 분류하기 위해. fluoresceinated
를 이용한 를 해보지만 줄기 세포가 아닌 세포에서도 이러한
antibody flow cytometry
가 발현되기 때문에 만 가지고 분류하기도 힘들게 된
surface marker surface marker
다 그러나 중간엽 줄기 세포를 분리하고 배양하는데 있어. surface marker는 중요한 의미를 갖는다 초기 계대 배양을 통해 얻어진 중간엽줄기 세포는 크기와 모양이 균일. 하고 fibroblastic한 외양을 가지고 있다. Hematopoietic 세포에서 나타나는 CD3, CD4, CD6, CD9, CD10, CD11a, CD14, CD15, CD18, CD21, CD25, CD31, CD34, CD36, CD38, CD45, CD49d, CD50, CD62E,L,S, CD80, CD86, CD95, CD117,
들은 에서 발현되지 않으나
Cd133, SSEA-1 MSC CD13, CD29, CD44,
CD49a,b,c,e,f, CD51, CD54, CD58, CD71, CD73, CD90, CD102, CD105, CD106, CDw119, CD120a, CD120b, CD123, CD124, CD126, CD127, CD140a, CD166, 은 발현이 되는 특징을 P75, TGFb1R, TGFbIIR, HLA-A,B,C, SSEA-3, SSEA-4, D7
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가진다 (Pittenger MF, Martin BJ. 2004). 배양 단계에서의 중간엽줄기세포의 특징은 초기에는 이러한 surface marker나 모양에서 약간의 차이를 보이는 다양한 세포 군 으로 존재하지만 여러단계의 계대 배양을 거치게 되면 굉장히 균일한 self renewal의 특성을 가지는 세포군을 형성하게 된다 본 실험에서도 백서 심근 경색 모델에 중간엽. 줄기 세포를 주입하기 전 세포들이 제대로 된 MSC의 특성을 가지고 있는지 확인하기 위해 표면항원을 확인하기 위한 FACS 분석을 시행하였으며 세포의 표면항원이 MSC 가 가지는 표면 항원의 특징을 가지고 있음을 확인하였다.
중간엽 줄기 세포의 심근세포로의 분화 및 의 형성
2. gap junction
로 인해 심근 세포가 소실되고 기전이 부재하면 결국 심부전
MI endogenous repair
이 초래될수 밖에 없다 손상된 심근이 비 심근 세포인. fibrous scar로 치환되어 병적 인 심실 remodeling이 발생하면 심실 기능의 소실이 오게 되는데 이 경우 cellular
을 하여 를 치료할 수 있다는 가능성이 제시되어 왔다
transplantation MI (Kao RL et
라고 명명된 후 임상 적용의 단계까지 발전하게 al. 1997). Cellular cardiomyoplasty
된다. Adult cardiomyocyte는 재생 능력이 없으나 최근 성인 심장내에도 심장 줄기 세포가 존재함이 알려져 있으나 아직 기능에 대해서는 알려져 있지 않다 (Anversa P
따라서 을 주입하게 되는데 여기에 사용되는 세포들은
et al. 2002). exogenous cell
fetal cardiomyocytes(Kessler PD et al. 1999), skeletal myoblast(Murry CE et 가 있다 이 al. 1996), endothelial(Fuchs S et al. 2001) or mesenchymal lineages . 중 skeletal myoblast가 많이 이용되었는데 그러나 myoblast는 committed
로 로 분화하는 것이지 심장 세포로 분화하
progenitor cells mature skeletal myocyte
는 것은 아니다. 그러나 MSCs는 심근내로 주입되었을때 cardiomyocyte-like
을 가지는 세포로 분화하게 된다 심근 재생
phenotype (Pittenger MF et al. 2000).
치료에 골수 세포가 처음으로 이용된 때는 1999년이다 이식된 골수 세포는 실제로는. 는 아니다 초기 연구에 의하면 골수 세포 이식후 이식전에 관찰되지 purified MSCs .
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않았던 muscle-specific protein이 발현되었다고 보고하고 있다 이후. 5-azacytidine 을 전처치한 골수 세포가 myogenic 분화를 촉진 시킨다는 보고가 있었다 심근 경색. 부위에 주입된 MSCs는 alpha-actinin, troponin-T, myosin heavy chain-MHC 등을 발현하여 myogenic lineage로 분화함이 밝혀져 왔다 (Shake JG et al. 2002). 또한
과 을 담당하는 이 발현되어
intercellular connection electrical coupling Connexin-43
심근 세포로 분화 했을 가능성을 시사하는 보고도 있으나 그렇지 않다는 상충된 보고 도 있다 본 연구에서도 주입전의. MSCs에서는 관찰되지 않았던 cardiac Troponin, 이 이식후에 조직의 면역 염색에서는 발현되고 있어 주입된 가 심
Connexin-43 MSCs
근 세포로 분화 했음을 확인 할수 있었으며 주로 주변 심근 세포와의 사이에서 이 발현되어 있어 가 심근 세포로 분화하는데 주변 심근 세포가
Connexin-43 MSCs
중요한 역할을 함을 확인할수 있었다.
심근 경색에서 중간엽 줄기 세포 이식후 심기능의 개선과 조직학적 특성 3.
심근 경색후 세포 치료를 받지 않은 media 주입군에서는 경색 부위 심장벽의 두께 가 줄어들고 운동장애가 발생하여 결국 remodeling을 통해 전체적인 심장의 크기가 증가하는 심부전의 양상을 볼수 있었다 그러나 중간엽 줄기 세포를 주입한 군에서는. 경색 부위의 심장벽의 두께가 유지되며 이로인해 심근벽의 운동이 보존되어 결국 심 장 수축 기능의 회복이라는 결과를 가져왔다 또한 주지할 만한 점은 줄기 세포를 주. 입한 곳이 경색 주변부라는 사실이다 경색 부위에 세포를 주입하게 되면 주변에 심근. 세포가 없어 gap junction의 형성을 통한 전기적 기계적 연동을 통한 심장의 수축기, 에 기여를 할 수 없다는 보고가 있다 경색후. 8주째 희생시킨 백서의 심장 조직을 살 펴보면 심근 경색 주변부의 두께가 잘 유지되어 있으며 전체적인 심근 경색의 크기도 감소되어 있는 것을 살펴볼 수가 있다 따라서 주입된 줄기 세포가 죽지 않고 유지된. 후 전체적인 심장의 수축 기능을 회복 시키기 위해서는 주변 심근 세포와 같이 존재 해야 한다는 사실을 알수 있었다.
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결론
심근 경색후에 발생하는 심부전에 대한 치료법 중 최근 많은 연구가 진행되고 있는 세포 이식 중 중간엽 줄기 세포 이식은 골격근 모세포나 embryonic stem cell이 가 지는 치명적인 단점 즉 심근 세포로 분화가 되지 않거나 윤리적인 문제 등이 없는 방, 법으로 최근 많이 이용되고 있다 그러나 이러한 세포 이식으로 인한 심기능 호전에도. 연구 마다 상반된 결과를 보이고 있고 더욱이 심기능 호전의 기전에 대해서는 확실히 밝혀지지 않고 있다 본 연구의 결과를 보면 백서의 대퇴골의 골수에서 분리 배양한. , 중간엽 줄기 세포가 이식전에는 심근 세포의 표지를 가지고 있지 않았으나 백서를 이 용한 심근 경색 모델에서 직접 심근 경색의 주변부에 주입을 한 후 살펴본 조직 소견 특히 면역 염색의 소견을 보면 심근 세포로의 분화가 있었다고 생각할 수 있는
이나 가 발현되어 있어 의 형성을 통한
Connexin-43 cardiac Troponin I gap junction
심근 세포와의 유기적 연결이 분화된 중간엽 줄기 세포가 심근내에서 동기화된 기계 적 수축을 통해 심기능의 복원을 가져 왔다고 볼 수 있겠다 또한 본 연구의 또 하나. 의 가치는 국내에서 아직 보편화 되어 있지 않은 백서의 심장초음파를 이용해 중간엽 줄기 세포 이식 후 심기능의 개선을 평가 하였다는 점이다. Media 주입군에서는 관찰 되지 않은 심기능 개선의 효과가 MSCs를 주입한 군에서 있었던 이유는 심근 경색 부 위의 심근 두께가 얇아지는 것을 막아 remodeling의 발생을 억제하였기 때문이며 이 로 인해 전반적인 수축기능의 개선이 있었던 것으로 생각 할수 있겠다 그러나 본 연. 구에서 알 수 있었듯이 심근내 주입된 중간엽 줄기 세포 모두에서 Connexin-43이나 가 발현된 것은 아니었다는 점이며 여기서 생각할 수 있는 점은 cardiac Troponin I
중간엽 줄기 세포가 심근 세포로 분화하는데는 주변 심근 세포의 역할이 중요한 것은 사실이나 이외에도 다른 여러 가지 인자가 있을 수 있다는 사실이다 따라서 본 연구. 의 결과를 토대로 향후 모든 중간엽 줄기 세포가 심근 세포로 분화될 수 있는 연구가 진행되길 바란다.
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