Effect of Spatholobi Caulis Extract in Acute Liver Injury

DOI 10.17480/psk.2021.65.4.284

종 설(Review)

계혈등 추출물이 급성 간 손상에 미치는 효과

오민혁* · 박해진** · 신미래* · 노성수*^,#

*대구한의대학교 한의과대학 본초약리학교실, **대구한의대학교 산학협력단 DHU 바이오융복합시험센터

Effect of Spatholobi Caulis Extract in Acute Liver Injury

Min Hyuck Oh*, Hae-Jin Park**, Mi-Rae Shin*, and Seong-Soo Roh*^,#

*Department of Herbology, Korean medicine of College, Daegu Haany University

**DHU Bio Convergence Testing Center

(Received May 6, 2021; Revised June 17, 2021; Accepted June 29, 2021)

Abstract This study aimed to examine the protective effect of the water extract from Spatholobi Caulis (SC) on rats with acute liver injury (ALI) induced by thioacetamide (TAA) and its underlying mechanism. ALI was induced by intraperitoneal injection with TAA for 3 days in a row and the rats were administered SC (100 or 200 mg/kg) 1 h 30 min prior to the TAA treatment. Myeloperoxidase (MPO) was measured in serum and malondialdehyde (MDA) was measured in serum and liver tissue, as markers related to oxidative stress. Further, inflammation-related proteins and apoptosis proteins were investigated using western blot analysis. SC treatment significantly reduced the levels of MPO and MDA. Further, SC treatment significantly reduces the mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway, including p-JNK, p-ERK, and p-p38, and reduces the expression of pro-inflammatory signaling factors. Furthermore, it effectively decreased the expression of Bax, Cytochrome C, and Cleaved Caspase-3 in liver tissue. Taken together, SC treatment alleviate0d the severity of ALI via inhibition of inflammation through both the MAPK pathway and Matrix metalloproteinase (MMPs)-dependent apoptosis.

Keywords Spatholobi Caulis, Thioacetamide, Acute liver injury

서 론(Introduction)

간은 에너지대사, 내인성 및 외인성 물질에 대한 해독 작용을 수행하는 기관으로 물질대사 과정에서 많은 활성산소를 생성하 고 과도하게 발생된 활성산소는 산화적 스트레스를 유발한다.

산화적 스트레스에 의한 세포 내 반응은 cytokine, 성장인자나 호르몬의 작용과 분비의 조절, 이온 수송의 영향, 전사의 변화 및 세포사멸로 나누어지며 다양한 유전자의 세포 내 신호전달 체계(signal transduction pathway)에 영향을 주는데, 분자 수준에 서의 정확한 기전은 알려져 있지 않으나 그 중 연구되고 있는 신호전달 체계는 mitogen-activated protein kinase (MAPK) 체계 를 들 수 있다.

간 독성 물질인 thioacetamide (TAA)는 간에서 microsomal mixed-function oxidase에 의해 생체전환되어 급성 간손상을 유 발하며,

간세포에 Ca

을 비정상적으로 유입시킴으로써 산화

적 인산화 작용을 억제하여 간세포호흡을 억제한다.

현대 의학 시스템에서 간 질환 치료를 위해 많은 연구를 수 행하고 있으나 신체 내 안전성 평가와 임상 시험에서의 효과를 나타내는 약물은 드물며, 약으로 인한 위장 장애, 피부 질환과 같은 부작용이 문제가 되는 부분이다. 이에 대체 약물로 부상하 고 있는 것은 부작용이 적은 약용식물의 활용이며, 현재까지도 간 질환을 완화하기 위한 효과적이고 안전한 대체 요법 중 하 나로 사용되고 있다.

계혈등(Spatholobi Caulis)은 콩과(Leguminosae) 밀화두(Spathol- obus suberectus Dunn)의 덩굴줄기로 보혈활혈(補血活血) 효과가 있어 어혈(瘀血), 월경불순(月經不順), 빈혈(貧血)의 치료에 사용 되고 있으며,

계혈등의 구성성분으로는 formononetin, daidzein, isoliquiritigenin, sativan, stigmasterol, campesterol, medicagol 및 pseudobaptigenin 등의 flavonoid와 sterol 계열 화합물이 등이 알 려져 있다.

최근 연구에는 염증억제,

항산화 효과,

면역 조절 작용,

세포주기 억제 및 세포사멸유도 작용

등의 다 양한 약리 작용을 가지는 것으로 보고되어 있다.

본 연구에서는 염증을 억제시켜준다고 알려진 계혈등 물 추 출물의 간 보호효과를 규명하기 위해 TAA로 간손상을 유발한 Sprague-Dawley (SD) rat 를 활용하였다. 또한, TAA로 유발한 계

#

Corresponding author

Seong-Soo Roh, Department of Herbology, College of Korean Medi- cine, Daegu Haany University, Republic of Korea

Tel: +82-53-770-2350, Fax: +82-53-768-6340

E-mail: [email protected]

혈등 간 보호효과의 기존 연구가 있으나, 기전을 달리보고 있다.

따라서, 간 TAA를 유발에 따른 산화적 손상, 염증 및 세포사멸 의 억제를 확인하였으며, 간 질환 치료의 후보 소재로의 가능성 을 제시하고자 한다.

방 법(Methods)

실험 동물

6 주령의 SD-rat를 체중 200 g 내외(대한바이오링크, 충북)로 구 매하여, 물과 고형사료(조단백질 18% 이상, 조지방 5.0% 이상, 조섬유 5.0% 이하, 조회분 8.0% 이하, 칼슘 1.0% 이상, 인 0.85%

이상, 칼륨 0.55% 이상, 나트륨 0.25% 이상, 마그네슘 0.15% 이 상, NIH-41, Zeigler Bros, Inc., Gardners, PA, USA)를 충분히 공급하였다. 1주간 실험실 환경에 적응시킨 후, 본 실험에 사용 하였다. 동물 사육실의 조건으로는 conventional system으로 온 도 22±2

C, 습도 50±5%, 명암 주기는 12시간 주기로 조절하였 다. 동물실험의 윤리적, 과학적 타당성 검토 및 효율적인 관리 를 위해 대구한의대학교 동물실험윤리 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee: IACUC)의 승인(승인번호: DHU 2020-078)을 받았다.

시료추출

본 연구에 사용한 계혈등은 옹기한약국(대구, 한국)에서 구입 한 것을 대한약전외한약(생약) 규격집에 맞추어 관능검사 후 약 전 규격에 적합한 것만을 정선하여 사용하였다. 계혈등의 총 분 량 300 g에 증류수 3000 mL를 가해 열탕 추출기에서 2시간 추 출하여 얻은 추출액을 여과한 다음, 감압 추출장치(N-1100, Eyela, Japan)로 농축하였다. 동결건조기(FreeZone 1, Labconco, France) 를 이용해 완전히 건조시켜 계혈등 추출물(SC)은 18.5 g의 파우 더를 얻었으며 수율은 6.2%였다. 파우더는 −80

C 에 보관 후 사 용하였다.

시약

본 실험에 사용된 diethylene glycol, sodium hydroxide, 1,1,3,3-tetramethoxypropane, 2-thiobarbituric acid, thioacetamide, potassium persulfate, phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)는 Sigma Aldrich Co., Ltd. (St. Louis, MO, USA) 에서 구입하여 사 용하였다. Phosphoric acid는 Duksan company (Ansan, Korea), n-Butanol 은 daejung CHEMICALS & METALS CO.,LTD (Siheung, Korea) 에서 구입하였으며, ECL Western Blotting Detec- tion Reagents 는 GE Healthcare (Arlington Height, IL, USA)로부 터 구입하여 사용하였다. c-Jun, phospho-c-Jun NH2-terminal kinase (p-JNK), phospho-extracellular signal-regulated kinase (p- ERK), phospho-p38 (p-p38), Bax, Cytochrome C, Cleaved Caspase-3, matrix metalloproteinase-2 (MMP-2), matrix metallo- proteinase-8 (MMP-8), matrix metalloproteinase-9 (MMP-9), β- actin, histone와 2차 항체인 rabbit lgG antibody, mouse lgG

antibody 는 GeneTex, Inc. (San Antonio, TX, USA)에서 구입하여 사용하였다. 단백질 정량을 위한 bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit 는 Thermo Scientific (Rockford, IL, USA)에서 구입하였 으며, protease inhibitor mixture, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)는 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Osaka, Japan) 에서 구입하였다.

TAA 로 유발된 급성 간 손상 동물모델

실험군은 정상군(Normal), 대조군(Control), silymarin 추출물을 100 mg/kg body weight 로 투여한 군(Silymarin), 계혈등 추출물을 100 mg/kg body weight로 투여한 군(SC100), 계혈등 추출물을 200 mg/kg body weight로 투여한 군(SC200)으로 각 군별로 8마 리씩 5군으로 나눈 후, 1주일간 적응시킨 다음 실험에 사용하였 다. 모든 쥐는 일정한 시간에 1회/1일 체중을 측정하였다. 정상 군을 제외한 나머지 군은 1회/1일 3일 동안 TAA 200 mg/kg body weight 를 복강 투여하였으며, 약물처리군은 해당 약물을 3일간 경구 투여하였다.

실험 종료 당일 마취 후, 복대 정맥에서 혈 액을 채취하여 4,000 rpm, 4

C에서 10분간 원심 분리한 다음,

−80

C에 보관하였으며, 실험동물의 간 조직은 적출하여 −80

C 에 보관하였다.

혈청 myeloperoxidase 측정

혈청에서 myeloperoxidase (MPO) 측정은 myeloperoxidase activity assay kit (Biovision inc. Milpitas ca, USA) 의 프로토콜 에 따라 측정하였다.

Malondialdehyde (MDA) 측정

혈청 내에서 malondialdehyde (MDA)가 thiobarbituric acid (TBA)와 반응하여 형성되는 2-thiobarbituric acid-reactive sub- stances (TBARS)를 Mihara와 Uchiyama

의 방법에 따라 측정하 였다. 표준물질로는 1,1,3,3-tetramethoxypropane를 사용하였으며, 시료와 1% phosphoric acid을 혼합한 다음, 0.67% thiobarbituric acid을 첨가해 95

C에서 45분간 끓인 후, butanol과 혼합하였다.

원심 분리기(3000 rpm, 10분)를 사용하여 상층액을 UV-VIS 분 광 광도계(infinite M 200 Pro, Tecan, Switzerland)로 흡광도 540 nm 에서 측정하였다.

조직학적 관찰

간 조직을 10% neutral buffered formalin에 24시간 고정시킨 다음, graded alcohol로 탈수시키고 나서 파라핀으로 포매하여 block을 제작한다. Microtome으로 5-μm 두께의 조직 절편을 제 작해 hematoxylin & eosin (H&E) 염색을 시행한 뒤, xylene clearing 을 거쳐 permount로 처리한 후, 광학현미경(DSCHX50V, Sony, Tokyo, Japan) 를 이용하여 촬영하였다.

조직 Western blotting

간 조직에서 세포질을 얻기 위해 100 mM Tris-HCl (pH 7.4),

5 mM Tris-HCl (pH 7.5), 2 mM MgCl

, 15 mM CaCl

, 1.5 M sucrose, 0.1 M DTT, protease inhibitor cocktail 을 첨가한 buffer A를 넣고 tissue grinder (BioSpec Product, Oklahoma, USA)로 분쇄하여 ice 위에서 30분간 방치 시킨 후, 10% NP-40 용액을 첨가하였다. Vortex하여 12,000 rpm으로 2분간 원심분리 후 세포 질을 포함하고 있는 상층액을 분리하였다. 핵을 얻기 위해 10%

NP-40 가 더해진 buffer A에 두 번 헹구고 150 µL의 buffer C (50 mM HEPES, 0.1 mM EDTA, 50 mM KCl, 0.3 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.1 mM PMSF, 10% glycerol) 를 첨가하였으며, 10분 간격으로 3번의 vortex를 한 후, 4

C에서 12,000 rpm으로 10분간 원심분리하였다. 그 다음, 핵을 포함하고 있는 상층액을 얻어

−80

C에서 각각 냉동 보관하였다. 간 조직(제거) 세포질 내 p- JNK, p-ERK, p-p38, Bax, Cytochrome C, Cleaved Caspase-3, MMP-2, MMP-8, MMP-9 및 β-actin과 핵 내의 c-JUN와 histone 단백질 발현을 측정하기 위하여, 8-12 µg의 단백질을 8-15% SDS- polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동 후, acrylamide gel을 nitrocellulose membrane 으로 이동시켰다. 준비된 membrane에 각 각의 1차 antibody (1:1000)를 처리하여 4

C에서 overnight 시킨 다음, PBS-T로 6분마다 5회 세척하고, 각각 처리된 1차 항체에 사용되는 2차 항체(1:3000)를 사용하여 상온에서 1시간 30분 반 응시킨 후, PBS-T로 6분마다 5회 세척하였다. 그리고 enhanced chemiluminescence (ECL) 용액에 노출시킨 후, Sensi-Q 2000 Chemidoc (Lugen Sci Co. Ltd, Seoul, Korea) 에 감광시켜 단백질 발현을 확인한 다음, 해당 band를 ATTO Densitograph Software (ATTO Corporation, Tokyo, Japan) 를 사용하여 band를 정량하였 다. 각각의 단백질 수준은 정상군의 단백질 수준으로 나눈 후 상대적 비로 나타내었다(represented as 1).

통계분석

In vivo 수치는 평균과 표준편차로 표시하였다. 모든 in vivo 수치는 SPSS program for windows version 25.0 (SPSS Inc.,

Chicago, IL USA)로 one-way analysis of variance (ANOVA) test 를 실시하였으며, 각 데이터의 통계적 유의성은 Least Significant Difference (LSD) test로 검증하였고, 정상군과 대조군, 대조군과 약물 투여군 사이에 유의성은 p-value <0.05에서 검증하였다.

결 과(Results)

체중변화와 간 중량 분석

실험기간 동안 체중 변화는 Normal군 대비 Control군에서 2.2 배 유의적으로 감소하였고(p<0.001), Control군 대비 Silymarin군 과 SC100군에서 21%로 유의적으로 증가하였으며, SC200군에서 도 26%로 유의하게 증가하였다(p<0.05, resp.).

간 중량에서 Normal군 대비 Control군은 42%로 유의하게 증 가하였고 Control군 대비 SC100군에서는 2%로 감소하는 경향을 보였으며, Silymarin군과 SC200군에서는 8%로 유의하게 감소하 였다(p<0.05, resp.) (Fig. 1).

MPO 와 MDA 분석

혈청에서 MPO 측정 결과, MPO에서는 Normal군 대비 Control 군에서 40%로 유의하게 증가하였고(p<0.001), Control군 대비 SC200군에서는 14%로 유의하게 감소하였다(p<0.01).

혈청과 조직에서 MDA 측정 결과, 혈청에서 Normal군 대비 Control군에서 2.86배 유의하게 증가하였고(p<0.001), Control 대 비 Silymarin군과 SC200군에서는 24%와 20%로 유의하게 감소 하였다(p<0.01, p<0.05, resp.). 조직에서는 Normal군 대비 Control 군에서 34%로 유의하게 증가하였고(p<0.05), Control군 대비 SC100군과 SC200군에서 24%와 32%로 유의하게 감소하였다 (p<0.05, p<0.01, resp.) (Fig. 2).

간 조직학적 분석

간 조직에 H&E 염색 후, 광학 현미경을 사용하여 관찰한 결

Fig. 1. Body weight change and liver to body weight ratio. Body weight change; (A), Liver to body weight ratio; (B). Normal: nomarl rat,

Control: TAA-induced rat, Silymarin: TAA-induced with Silymarin 100 mg/kg body weight rat, SC100: TAA-induced with Spatholobi Caulis

100 mg/kg body weight rat, SC200: TAA-induced with Spatholobi Caulis 200 mg/kg body weight rat. All data are expressed means±SED

(n=8). Significance:

p<0.001 vs. normal group, **p<0.05 vs. control group.

과, Normal군에서는 세포질과 원형의 핵이 모두 뚜렷하고, 세포 의 괴사나 염증세포의 침윤과 같은 이상소견을 찾아볼 수 없는 정상적인 간 조직을 보였다. Control군에서는 TAA에 의해 국소 적 공포(vacuolization)가 나타났으며, 염증세포의 출현과 간손상 병변이 나타난 것을 확인할 수 있다. 그에 반해, SC200군에서는 Control 군에 비하여 국소적 공포와 염증세포가 감소되어 간손상 병변이 완화되는 모습이 나타났다(Fig. 3).

간 조직 내 염증관련 인자 발현

간 조직에서 염증관련 인자인 c-JUN, p-JNK, p-ERK 및 p-p38 의 발현을 확인한 결과, c-JUN은 Normal군 대비 Control군에서

58% 로 유의하게 증가하였으며(p<0.01), Control군 대비 Silymarin 군에서 44%로 유의하게 감소하였고(p<0.001), SC100군과 SC200 군에서도 34%와 41%로 유의하게 감소하였다(p<0.01).

p-JNK는 Noraml군 대비 Control군에서 29%로 유의하게 증가 하였고(p<0.05), Control군 대비 Silymarin군에서 19%로 감소하 는 경향이 나타났으며, SC100군과 SC200군에서는 23%, 29%로 유의하게 감소하였다(p<0.05, p 0.01, resp.).

p-ERK 는 Normal군 대비 Control군에서 29%로 유의하게 증가 하였고(p<0.05), Control군 대비 Silymarin군, SC100군 및 SC200 군에서 유의하게 감소하였다(p<0.01, p<0.05, p<0.05, resp.).

p-p38 은 Normal군 대비 Control군에서 30%로 유의하게 증가 Fig. 3 Histopathological analysis. Liver tissue were stained with H&E (Scale bar: ×200). (A): Normal; (B): TAA-induced rat; (C): TAA- induced with Silymarin 100 mg/kg body weight rat; (D): TAA-induced with Spatholobi Caulis 100 mg/kg body weight rat; (E): TAA-induced with Spatholobi Caulis 200 mg/kg body weight rat

Fig. 2. Effects of SC on MPO and MDA levels. Myeloperoxidase (MPO) in serum; (A), Malonaldehyd (MDA) in liver serum and tissue; (B).

Normal: nomarl rat, Control: TAA-induced rat, Silymarin: TAA-induced with Silymarin 100 mg/kg body weight rat, SC100: TAA-induced with

Spatholobi Caulis 100 mg/kg body weight rat, SC200: TAA-induced with Spatholobi Caulis 200 mg/kg body weight rat. All data are expressed

means±SEM (n=8). Significance:

p<0.05,

p<0.001 vs. normal group, *p<0.05, **p<0.01 vs. control group.

하였으며(p<0.01), Control군 대비 Silymarin군에서는 14%로 감 소하였고 SC100군과 SC200군에서 17%와 23%로 유의하게 감 소하였다(p<0.05, p<0.01, resp.) (Fig. 4).

간 조직 내 간 세포 사멸관련 인자 발현

간 조직에서 간 세포 사멸관련 인자인 Bax, Cytocrome C 및 Cleaved Casepase-3 의 발현을 확인하였다.

Bax 은 Normal군 대비 Control군에서 31%로 유의하게 증가하 였으며(p<0.01), Control군 대비 Silymarin군과 SC100군은 24%로 유의하게 감소하였고(p<0.01) SC200군은 25%로 유의하게 감소 되었다(p<0.01).

Cytocrome C 은 Normal군 대비 Control군에서 15%로 유의하 게 증가하였으며(p<0.05), Control군 대비 Silymarin군과 SC200군 에서 17%와 15%로 유의하게 감소하였다(p<0.01).

Cleaved Caspase-3 은 Normal군 대비 Control군에서 54% 증가 하였으며(p<0.01), Control군 대비 모든 약물투여군에서 34%, 29%

및 36%로 유의하게 감소하였다(p<0.01) (Fig. 5).

간 조직 내 기질 금속단백분해효소관련 인자 발현

간 조직에서 matrix metalloproteinases (MMP)관련 인자인 MMP-2, MMP-8 및 MMP-9의 발현을 확인한 결과, 각각 Normal 군 대비 Control군은 21%, 52% 및 28%로 모두 유의하게 증가 하였고(p<0.01, p<0.001, p<0.05 resp.), 이러한 증가는 SC200군 은 14%, 24% 및 28%로 모두 유의하게 감소하였다(p<0.01) (Fig.

6).

고 찰(Discussion)

계혈등(Spatholobi Caulis)은 중국의 복건, 광동, 광서, 운남 등

지에 분포하는 콩과(Leguminosae)에 속한 밀화두(Spatholobus

suberectus DUNN)의 등경(藤莖)을 건조한 것으로, 성질은 온(溫),

무독하며 맛은 고미감(苦微甘)하다. 간(肝), 신경(腎經)에 작용해

행혈보혈(行血補血), 활혈거어(活血去瘀) 및 서근활락(舒筋活絡)

하는 효능이 있어 월경부조(月經不調), 혈허경폐(血虛經閉), 관절

산통(關節 痛), 통경(痛經) 및 풍습비통(風濕痺痛) 등을 치료한다.

Fig. 4. Expression of inflammation-related proteins in liver. (A): c-Jun; (B): phospho-c-Jun NH2-terminal kinase (p-JNK); (C): phospho-

extracellular signal-regulated kinase (p-ERK); (D): phospho-p38 (p-p38), Normal: nomarl rat, Control: TAA-induced rat, Silymarin: TAA-

induced with Silymarin 100 mg/kg body weight rat, SC100: TAA-induced with Spatholobi Caulis 100 mg/kg body weight rat, SC200: TAA-

induced with Spatholobi Caulis 200 mg/kg body weight rat. All data are expressed means±SD (n=8). Significance:

p<0.05,

p<0.01 vs. the

normal group, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs. the control group.

TAA 는 산화적 스트레스, 지질 과산화 및 간손상으로 이어지 는 염증을 유발한다

. 이에 본 연구에서는 수컷 SD-rat에 TAA (200 mg/kg/day) 를 3일간 복강 투여를 한 후, 급성 간 손상을 유 발했다. 동시에 계혈등 열수 추출물(100 or 200 mg/kg) 3일간 경 구투여하였다. 부검으로 얻은 혈청을 사용하여 MPO와 MDA를 측정하였으며, 간 조직을 병리학적으로 분석하였다. 또한, 간 조 직을 western blotting 분석을 통해 MAPK, apoptosis 및 기질 금 속단백분해효소 관련 인자들의 발현을 확인하였다.

Heme-containing peroxidase 인 MPO는 hypohalous acids를 포 함하는 특정 reactive oxygen intermediates의 생성을 통해 염증반 응의 매개체로 알려져 있다.

MPO 측정 결과, Normal군 대비 Control 군에서 40% 유의하게 증가하였고 Control군 대비 SC200 군에서 14% 유의하게 감소하였다.

MDA는 세포막에서 고도불포화 지방산이 과산화지질의 최종 단계에서 생성되는 주요 반응성 알데히드 중 하나이며, 자유기 에 의해 세포막 지질의 불포화지방산들이 산화적 분해를 일으 키는 것으로 지질 과산화가 지표가 되고 있다.

MDA 측정 결과, 혈청과 조직에서 Normal군 대비 대조군에서 2.86배, 1.34 배 유의하게 증가하였으며 Control군 대비 SC200군에서는 20%

와 32%로 유의하게 감소하였다.

조직병리학적 분석 결과, SC200군에서는 TAA에 의해 발생되 는 국소적 공포와 염증세포를 감소시켜 간손상 병변을 개선하

는 모습을 보임으로써 간 보호 효과를 발휘하는 것으로 판단된다.

이후 간 조직을 사용하여 MAPK을 western blotting으로 분석 하였다. c-Jun은 분화 인자, 특수 약물, 스트레스 및 열 충격과 같은 다양한 요인에 의해 유발되며,

산화 환원에 민감한 전 염 증 전사 인자이고, 주로 MAPK 경로와 인산화를 통한 번역 후 변형에 의해 조절된다.

MAPK 신호체계는 세포 성장과 분 화의 조절, 사이토카인과 stress에 대한 세포 반응의 조절에 중 요한 역할을 하며,

세포 외 환경으로부터 세포질을 통해 핵으 로 정보를 전달하는데 중요한 역할을 하고 있으며, 최소 3가지 의 신호전달 경로가 존재한다.

ERK 신호전달 경로에서 활성 화된 ERK는 다양한 전사 인자를 인산화할 수 있다. ERK가 자 극 인자에 의해 광범위하게 활성화되는 반면, stress 반응 경로 의 부분을 구성하고 염증성 사이토카인과 같은 인자 때문에 유 도된 세포 스트레스가 p38과 JNK를 활성화시킨다.

c-JUN 은 TAA 투여에 의해 대조군에서 58%로 증가하였으나 모든 약물 처리에 의해 유의적으로 감소하였다. 또한 p-JNK, p-ERK 및 p- p38은 Normal군 대비 Control군에서 모두 유의하게 증가하였으 며, Control군 대비 SC200군에서 MAPK 3인자 모두 유의하게 감소하였다.

Apoptosis 에 직접적으로 관여하는 인자로 알려져 있는 Bax는 정상세포에서는 세포질이나 mitochondria 외막에 안정된 상태로 존재하지만, 스트레스와 같은 자극에 민감하게 반응하여 mito- Fig. 5. Expression of apoptosis-related proteins in liver. (A): Bax; (B): Cytochrome C; (C): Cleaved Casepase-3. Normal: nomarl rat, Control:

TAA-induced rat, Silymarin: TAA-induced with Silymarin 100 mg/kg body weight rat, SC100: TAA-induced with Spatholobi Caulis 100 mg/kg body weight rat, SC200: TAA-induced with Spatholobi Caulis 200 mg/kg body weight rat. All data are expressed means±SD (n=8).

Significance: #p<0.05, ##p<0.01 vs. the normal group, *p<0.05, **p<0.01 vs. the control group.

chondria 내로 이동하게 되면 Cytochrome C의 방출을 유도하는 것으로 보고되고 있다.

방출된 Cytochrome C는 caspase cascade 를 유발하여 최종 effector caspase-3의 활성을 통하여 apoptosis 를 일으키며,

caspase-3 는 가장 마지막에 활성화되는 caspase로 서, 많은 주요 세포 단백질의 특이적인 절단을 촉매 하여 사멸 시키는 단백질이다.

간 조직에서 western blotting 분석을 통해 apoptosis 관련 단백질 발현 측정 결과, Bax, Cytochrome C 및 Cleaved Caspase-3 는 Normal군 대비 Control군에서 모두 유의하 게 증가하였으며 Control군 대비 SC200군에서 모두 유의하게 감 소하였다.

산화적 스트레스는 MMP의 발현을 활성화시키는 것으로 알 려져 있으며, MMP는 단핵구, 대식세포, 내피세포 및 평활근세 포를 포함하는 다양한 세포에서 생성이 되는 단백분해효소이 다.

MMP 매개 단백질 분해는 백혈구 이동을 촉진할 뿐만 아 니라 세포외기질 (ECM)에서 세포 사멸을 유발할 수 있다고 보 고되어 있다. 또한, MMP-2, 8, and 9의 조절은 알콜성 간질환 의 발달을 개선시켜준다고 하였다. 따라서 본 연구에서 MMP- 2, 8, 및 9를 측정하였다.

MMP-2, MMP-8 및 MMP-9 발현 측 정 결과, Normal군 대비 Control군에서 모두 유의하게 증가하였 으며 Control군 대비 SC200군에서 모두 유의하게 감소하였다.

이는 계혈등에서 MAPK에서 야기된 염증과 MMPs에 의존한 apoptosis의 조절을 통하여 간 보호 효과를 나타냈다.

결 론(Conclusion)

본 연구에서는 TAA에 의해 간손상이 유발된 SD-rat의 계혈등 추출물의 간 보호효과를 평가하였다. 계혈등 추출물 투여에 의 해 TAA에 의해 증가하였던 MPO와 MDA 활성을 유의하게 감 소하여 산화적 스트레스를 억제하였으며, 간 조직 내 MAPK 경 로의 억제와 MMPs의 조절을 통해 간세포내 염증과 세포사멸을 효율적으로 억제시키는 것으로 확인되었다.

따라서 계혈등 추출물은 TAA로 유발된 간손상 동물모델에서 간 보호효과를 보이는 것으로 사료된다.

감사의 말씀(Acknowledgment)

이 논문은 2021년도 정부(과학기술정보통신부)의 재원으로 한 국연구재단의 지원을 받아 수행된 연구임(No. 2018R1A5A 2025272)

Fig. 6. Expression of matrix metalloproteinases-related proteins in liver. (A): metalloproteinases-2 (MMP-2); (B): metalloproteinases-8 (MMP-8); (C): metalloproteinases-9 (MMP-9). Normal: nomarl rat, Control: TAA-induced rat, Silymarin: TAA-induced with Silymarin 100 mg/kg body weight rat, SC100: TAA-induced with Spatholobi Caulis 100 mg/kg body weight rat, SC200: TAA-induced with Spatholobi Caulis 200 mg/kg body weight rat. All data are expressed means±SD (n=8). Significance:

p<0.05,

p<0.01,

p<0.001 vs. the normal group, *p<0.05,

**p<0.01, ***p<0.001 vs. the control group.

Conflict of Interest

모든 저자는 이해 상충을 가지고 있지 않음을 선언한다.

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Authors’ Positions

Min Hyuck Oh : Graduate student Hae-Jin Park : Researcher

Mi-Rae Shin : Professor Seong-Soo Roh : Professor