Effect of Kyejakjimo-tangkami (Gu?sh?ozh?m?-t?ngji?w?i) on Osteoarthritis

桂芍知母湯加味方이 골관절염에 미치는 영향

홍성민⋅오민석

대전대학교 한의과대학 한방재활의학과교실

Effect of Kyejakjimo-tangkami (Guìsháozhīmǔ-tāngjiāwèi) on Osteoarthritis

Seong-Min Hong, K.M.D., Min-Seok Oh, K.M.D.

Department of Oriental Rehabilitation Medicine, College of Korean Medicine, Dae-Jeon University

RECEIVED September 16, 2013 REVISED October 1, 2013 ACCEPTED October 2, 2013

CORRESPONDING TO

Min-Seok Oh, Department of Oriental Rehabilitation Medicine, College of Korean Medicine, Dae-Jeon University, 1136, Dunsan-dong, Seo-gu, Daejeon 302-869, Korea

TEL (042) 470-9424 FAX (042) 470-9005 E-mail [email protected]

Copyright © 2013 The Society of Korean Medicine Rehabilitation

Objectives The purpose of this study is to prove the effect of Kyejakjimotangkami(KMK) on osteoarthritis.

Methods We checked antioxidant activity and measured production of IL-1β, IL-6, TNF-α in RAW 264.7 cell after treat by KMK. Then we measured hind paw weight of Wister Rat with arthritis induced by MIA after KMK oral administration, checked Prostaglandin E2, IL-1β, IL-6, TNF-α, Osteocalcin, TIMP-1, MMP-9, LTB-4 in serum, ran histopathological test and μCT-arthrography.

Results 1. DPPH radical Scavenging was increased depend on concentration of KMK ethanol extract in RAW 264.7 cell. 2. Production of NO was significantly decreased by KMK ethanol extract on concentration of 200μg/ml in RAW 264.7 cell. 3. Production of IL-1β was significantly decreased by KMK ethanol extract on concentration of 200μg/

ml. And Production of IL-6 ,TNF-α were significantly decreased KMK ethanol extract of every concentration in RAW 264.7 cell. 4. Result of checking hind paw weight when ad- ministered KMK ethanol extract to Wister Rat with arthritis induced by MIA was sig- nificantly higher than control group and similar to normal group. 5. Production of Prostaglandin E2, IL-1β, Osteocalcin, TIMP-1, MMP-9 and LTB-4 in serum was sig- nificantly decreased by KMK ethanol extract after administerd to Wister Rat with arthritis induced by MIA. 6. In Hematoxylin & Eosin staining and Safranin-O staining, we could find inflammation of synovial cell, infiltration of macrophage and granulocyte and degeneration of cartilage and bone were decreased in comparison with control group. 7. When checked cartilage volume to examine degree of cartilage degeneration using μCT-arthrography, volume of cartilage was increased in comparison with control group.

Conclusions Comparison of the results for this study showed that KMK ethanol extract have anti-inflammatory effectiveness and can protect cartilage and bone. So we expect that KMK can be used as a effective drugs for osteoarthritis. (J Korean Med Rehab 2013;23(4):39-57)

Key words Kyejakjimotang (KMK), Osteoarthritis, Cytokine, MIA induced arthritis, Cartilage

서론»»»

관절염은 관절을 침범하는 모든 염증을 일컫는 용어로

써 여러 관절에 비특이적인 염증성 반응을 야기하여 동통

과 강직을 나타낸다

. 골관절염은 국소 관절에 지속적으

로 유리질 연골의 손상과 변성을 가져오는 관절병증으로

Herb name Pharmacognostic nomenclatures Amount (g)

炮附子 Aconiti Tuber Praepareta 4

灸甘草 Glycyrrhizae Radix Praeparata 4

麻黃 Ephedrae Herba 6

生薑 Zingiberis Rhizoma Crudus 6

白朮 Atractylodis Rhizoma Alba 8

知母 Anemarrhenae Rhizoma 8

白芍藥 Paeoniae Radix Alba 10

川牛膝 Cyathulae Radix 10

桂枝 Cinnamomi Ramulus 12

防風 Saposhnikoviae Radix 12

鷄血藤 Spatholobi Caulis 12

Total amount 92

Table I. The Prescription of KMK 연골의 소실과 관절간격의 감소, 골비대, 골증식체의 생

성과 같은 연골하골의 변화를 유발하고 통증, 관절의 변 형, 기능 악화를 초래하며 퇴행성 관절질환, 골관절증, 비 대성 골관절염으로 불린다

.

서양 의학에서 골관절염의 치료는 증상 개선에 초점을 맞추어 소염진통제, 연골보호제 등의 약물 치료와 비약물 치료를 복합하여 사용하고 있으나

, 소염진통제의 경우는 장기간 복용 시 위장관의 부작용을 일으킬 우려가 있으 며

, 인공관절 치환술 또한 여러 합병증 등이 문제점으로 대두되고 있는 실정이다

. 최근에는 골관절염의 진행에 중요한 역할을 하는 tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β) 등의 cytokine을 억제하는 면역 학적 관점의 약물로 접근하고 있다

.

한의학에서는 대부분의 관절질환을 人體의 正氣가 虛 한 상태에서 肌肉經絡에 風寒濕 邪氣의 침범으로 氣血運 行이 不暢하게 되어 발생하는 痺症의 범주에 속하며

이 중 관절을 중심으로 나타나는 질환을 關節痺症이라고 하 였고

, 關節에 麻木, 酸痛, 疼痛, 屈伸不利와 심하면 强直 性 變形까지도 초래한다고 하였으며, 특히 무릎의 골관절 염은 膝痛, 膝腫, 鶴膝風, 膝痺 등으로 표현하였다

.

桂芍知母湯은 󰡔金匱 ^要 略󰡕

에서 "祛風散寒除濕하고 淸 熱한다"하여 歷節風에 사용하는 처방

으로, 김 등

의 연 구에서 혈액학적으로 소염, 진통작용이 있음을 보고하였 으나 골관절염에 대한 조직면역학적 접근은 없었다.

이에 저자는 골관절염에 대한 桂芍知母湯의 효과를 조 직면역학적 관점에서 알아보고자 桂芍知母湯에 活血去瘀 하고 關節을 通利시키며 肝腎을 滋養하여 筋骨을 강하게 하는 川牛膝

과 行血補血, 舒筋活絡하는 효능이 있는 鷄 血藤

을 가하여 RAW 264.7 세포에서의 항산화능과 IL- 1β, IL-6, TNF-α 등의 cytokine 생성량을 측정하였고, monosodium iodoacetate (MIA)로 관절염이 유발된 Wister Rat에서 뒷발 체중부하측정, 혈청 내 Prostaglan- din E2, IL-1β, IL-6, TNF-α, Osteocalcin, TIMP-1, MMP-9, LTB4 생성량 측정 및 병리조직학적 검사와 μCT- arthrography 등을 시행하여 유의한 결과를 얻었기에 보 고하는 바이다.

재료 및 방법»»»

1. 재료

1) 세포

실험에 사용된 RAW 264.7 세포는 한국세포주은행(서 울, 한국)에서 구입하였다.

2) 약재

본 실험에 사용한 桂芍知母湯加味(Kyejakjimotangkami, KMK)의 구성 약재들은 대전대학교 지역혁신센터 동서생 명의학 연구센터(TBRC)에서 구입하여 정선 후 사용하였 고, 그 내용과 분량(1첩)은 󰡔金匱 ^要 略󰡕

에 준하였다 (Table I).

3) 동물

실험에 사용한 동물은 수컷 6주령의 Wistar Rat (170~

200 g)로 ㈜오리엔트바이오(성남, 한국)에서 공급받았다.

동물은 실험 당일까지 고형사료(5L79, 오리엔트바이오, 성남, 한국)를 충분히 공급하고 온도 22±2

C, 습도 55±

15%, 12시간 명암주기(light-dark cycle)의 환경에서 1주

간 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 본 실험은 대전대 동

물실험윤리위원회의 승인(승인번호 - DJUARB2012-011)

을 받아 동물윤리준칙에 의거하였다.

4) 시약 및 기기 (1) 시약

Lipopolysaccharide (LPS), dimethylsulfoxide (DMSO) 및 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), Fetal Bovine Serum (FBS), Penicillin 및 Streptomycin (Hyclone, Logan, Ut, USA), Cell via- bility assay kit (Daeillab service, 서울, 한국), Nitric Oxide detection kit (Intron Biotechnology, 수원, 한국) 을 구입하였다. Cytokine Milliplex Map Immunoassay kit은(Millipore, Bellerica, MA, USA), HPLC 분석에 이용 된 water와 acetonitrile은(Ducksan, 한국), Rat Total MMP-9 kit, LTB4 Kit, Rat TIMP-1 Kit, Rat IL-6 Kit, Rat TNF-α Kit, Prostaglandin E2 Kit, Rat IL-1β Kit은 (R&D System, Minneapolis, USA), 주정 추출에 이용된 주정은 ㈜대한주정판매(전주, 한국)에서 구입하였다. 양 성대조군에는 Indomethacin (Sigma, USA), 골관절염 유 발 주사제로는 Monosodium iodoacetate (MIA) (Sigma.

Chemical, Cat. No. I2512, USA), 마취제로는 Zoletil (Virbae, France) Rompun (바이엘코리아, 서울, 한국)을 사용하였다. Hematoxylin and Eosin 염색과 Safranin-O 염색에는 Hematoxylin (Merck, Germany), Eosin Y (Wako, Japan), Safranin-O (Merck, Germany)를 사용하 였다.

(2) 기기

실험에 사용된 기기는 Rotary vacuum evaporator (EYELA, Japan), Freeze dryer (일신, 한국), ELISA read- er (Molecular Devices, USA), Luminex (Millipore, USA), HPLC (Shimadzu LC-20AD, Japan), HPLC column (ACE 5 C18, 250×4.6 mm, 5μm), Flow cytometry system (BD Biosciences immunocytometry systems, USA), In- capacitance Test Meter (IITC Life Science, California, USA), BD Ultra-Fine ll (Becton, Dickinson and Com- pany, USA), Light Microscope (Carl ZEISS AXIOSKOP- 40, Germany), μCT arthrography (SKYSCAN, Optoscan, Belgium)를 이용하였다.

2. 방법

1) 시료 추출

KMK 2첩을 분말하여 80% 주정 2,000 ml에 넣고 7일 동안 침지 후 여과하여, 그 여액을 rotary evaporator를 이용하여 50 ml로 감압, 농축하여 동결건조 하였다. 또한 KMK 개별약재를 80% 주정 500 ml에 포부자, 자감초, 마 황, 생강, 백출, 지모, 백작약, 천우슬, 계지, 방풍, 계혈등 30 g을 넣고, 약재별로 각각 3시간동안 환류추출 하였다.

그 여액을 rotary evaporator를 이용하여 50 ml로 감압, 농축하여 동결건조 하였다.

2) HPLC 분석

KMK 주정 추출물 및 11가지 개별약재의 주정 추출물 30 mg을 주정 1 ml에 녹여 0.45μm membrane filter로 여과 후 이 중 20μl를 HPLC 시료로 사용하였다. HPLC 는 Shimadzu사(Japan)의 system controller (CBM-20A), pump (LC-20AD), column oven (CTO-20A), autosam- pler (SIL-20A), PDA detector (SPD-M20A)를 사용하였으 며, column은 ACE 5 C18 (250×4.6 mm, 5μm)을 사용 하였다. HPLC는 water (A)와 acetonitrile (B)로 gradient elution system을 적용시켜 0% (5분 B), 0~40% (25분 B), 40~65% (10분 B), 65~100% (10분 B)로 설정하였다. 유 속은 1.0 ml/min이었으며 column 온도는 40

C를 유지하 여 분석하였다. UV wavelength는 知母의 경우 210 nm, 白朮은 220 nm, 白芍藥은 230 nm, 川牛膝은 245 nm, KMK와 炮附子, 灸甘草, 麻黃, 防風, 鷄血藤은 254 nm 그 리고 桂枝와 生薑은 280 nm로 설정하여 분석하였다.

3) 세포독성 측정

RAW 264.7 cells은 96 well plates에 1×10

cells/well

로 분주하여 24시간 동안 배양 한 후, KMK 주정 추출물

을 각각 50, 100, 200μg/ml의 농도로 처리하여 24시간

동안 배양하였다. 배양 후, 10μl의 WST solution을 첨가

한 후 CO

배양기(37

C, 5% CO

)에서 30분 반응 시킨

후, 450 nm에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대

한 세포 생존율을 백분율로 표시 하였다.

4) 항산화능 측정

(1) 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 소거능 자유라디칼 소거 활성 시험은 안정한 자유라디칼 DPPH 를 사용하는 방법으로 주정에 용해시킨 0.2 mM의 DPPH 용액 150μl와 KMK 주정 추출물을(25, 50, 100, 200, 400, 800μg/ml) 100μl를 각각 혼합하고, 37

C에서 30 분간 반응 시킨 후, 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.

대조군은 시료액 대신 증류수를 넣었으며 DPPH 용액 대 신 주정을 넣어 보정값을 얻었다. DPPH 소거율은 아래 의 식에 따라 계산하였다.

소거율(%)=(

대조군의 흡광도- 시료 첨가군의 흡광도

)×100 대조군의 흡광도

(2) 세포내 ROS 활성

RAW 264.7 세포 내에서 reactive oxygen speies (ROS) 를 측정하기 위하여 2',7'-dichlorofluorescin diacetate (DCF-DA)를 이용하였다. 48 well plate에 RAW 264.7 세 포를 2×10

cells/well이 되게 분주하였다. 24시간 동안 배양 한 후, KMK 주정 추출물(25, 50, 100, 200μg/ml) 을 처리하고, LPS 1μg/ml을 처리하여, 다시 24시간 동안 37

C, 5% CO

배양기에서 배양하였다. 배양 후, 1,200 rpm에서 5분간 원심 분리하여 모은 세포를 차가운 PBS 로 2회 세척한 후, DCF-DA 10μM이 되도록 첨가하여 15분 동안 빛이 차단된 상온에서 염색하였다. 염색 후 차 가운 PBS를 넣어 1,200 rpm에서 5분간 원심 분리한 다음 상층액을 제거하고 다시 PBS 400μl를 부유시켜 유세포 분석기(Flow cytometer, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ U.S.A)를 이용하여 형광강도의 세기에 따른 변 화를 분석하였다.

(3) 세포내 NO 생성량

NO의 농도는 배양액 내의 nitrite 농도를 Griess Re- agent System을 이용하여 측정하였다. RAW 264.7 cells 은 96 well plates에 1×10

cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양 한 후, KMK 주정 추출물(50, 100, 200μg/ml) 을 처리하고, LPS 1μg/ml을 처리하여, 다시 24시간 동안 배양하였다. N1 buffer를 50μl를 각 well에 처리한 후, 10분간 상온에서 암소 반응 후, N2 buffer 50μl를 각

well에 처리하고, 10분간 반응시킨 후, 540 nm에서 흡광 도를 측정하였다. Nitrite standard의 농도별 표준곡선을 이용하여 배양액의 NO 농도를 결정하였다.

5) 사이토카인 생성량

RAW 264.7 cells을 6 well plates에 3×10

cells/ml이 되도록 분주하고, 24시간 동안 배양한 후, KMK 주정 추 출물(50, 100, 200μg/ml)을 처리하고, LPS 1μg/ml을 처리하였다. 24시간 동안 배양한 후 세포배양액을 수거하 여 배양액에 함유된 IL-1β, IL-6, TNF-α를 custom- made 4-plex cytokine Milliplex panel을 이용하여 측정 하였다.

6) 관절염유발

Zoletil (Virbae, France) 0.5 ml+Rompun (Bayer Korea, 한국) 0.1 ml로 Rat를 마취시킨다. 마취 후 왼쪽 무릎 주변을 깨끗이 제모한 후 골관절염 유발물질인 MIA : Monosodium iodoacetate (Sigma. Chemical Co. Ltd, Cat. No. I2512)를 당뇨주사기를 사용하여 왼쪽 무릎 관 절강 내에 50μl (60 mg/ml)씩 투여하였다.

7) 약물투여

Wister Rat에 MIA를 주사하여 관절염을 유발시킨 후, 일주일이 경과된 이후부터 매일 오전 10시에 대조군에는 생리식염수 2 mg/㎏를, 양성대조군에는 Indomethacin (Sigma Co. USA)을 2 mg/㎏, KMK 투여군에는 KMK를 211 mg/㎏로 4주 동안 경구투여 하였다. MIA 투여 7일 후에 각 군을 정상군, 대조군, 양성대조군, KMK 투여군 으로 하여 각 군당 6마리씩 사용하였다.

8) 뒷발 체중부하측정

뒷발 체중부하는 Incapacitance test meter (IITC Life Science, california, U.S.A)를 이용하여, 플라스틱방에 비 스듬히(기울기 60도) 세운 후 각 뒷발에 가해진 세기를 10초에 걸쳐 평균을 산출하였다. 처치된 동측의 뒷발에 분포된 체중의 백분율은 다음과 같은 방정식을 이용하여 계산하였다.

(유발된 하지의 무게/정상 하지의 무게)×100

9) 혈액분석

최종 실험 종료 후 튜브형 주사기를 이용하여 심장에 서 채혈하였다. 전혈을 바이오톡스텍(주)(청주, 한국)에 의뢰하여 AST, ALT, BUN, Creatinine을 측정하였다.

10) 혈청내 염증관련 매개인자 측정 (1) Prostaglandin E2 생성량

Calibrator Diluent RD5-56을 비특이적 결합(non-spe- cific binding)을 한 well에 200μl, zero standard well에 150μl 넣고, standard, sample (정상군, 대조군, 양성대 조군, KMK 투여군)을 150μl 씩 넣었다. NSB well을 제 외한 나머지 well에 Primary Antibody Solution을 50μl 넣고 1시간 동안 실온에서 반응한 뒤 Proteoglycan E2 conjugate를 50μl넣고 2시간 동안 실온에서 반응하였다.

수세 용액(400μl)으로 4회 wash한 뒤 Substrate solution 을 200μl 넣고 빛을 차단한 뒤 30분 동안 실온에서 반응 하였다. 마지막으로 Stop solution을 100μl넣고 micro- plate reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

(2) TNF-α 생성량

Diluent RD1-41을 50μl 넣은 후에 standard, sample (정상군, 대조군, 양성대조군, KMK 투여군)을 50μl 씩 넣고 2시간 동안 실내에서 배양하였다. 5회 wash한 뒤 TNF-α conjugate를 100μl 넣고 2시간 동안 실온에서 배양하였다. Substrate Solution을 100μl 넣고 빛을 차단 한 뒤 30분 동안 실온에서 배양하였다. Stop solution을 100μl넣고 microplate reader로 450 nm로 측정하였다.

(3) IL-1β 생성량

Diluent RD1-21을 50μl 넣은 후에 standard, sample (정상군, 대조군, 양성대조군, KMK 투여군)을 50μl 씩 넣고 2시간 동안 실온에서 배양하였다. 5회 wash한 뒤 IL-1β conjugate를 100μl 넣고 2시간 동안 실온에서 배 양하였다. Substrate Solution을 100μl 넣고 빛을 차단한 뒤 30분 동안 실온에서 배양하였다. Stop solution을 100 μl넣고 microplate reader로 450 nm로 측정하였다.

(4) IL-6 생성량

Diluent RD1-54을 50μl 넣은 후에 standard, sample (정상군, 대조군, 양성대조군, KMK 투여군)을 50μl 씩 넣고 2시간 동안 실온에서 배양하였다. 5회 wash한 뒤 IL-6 conjugate를 100μl 넣고 2시간 동안 실온에서 배양

하였다. Substrate Solution을 100μl 넣고 빛을 차단한 뒤 30분 동안 실온에서 배양하였다. Stop solution을 100 μl넣고 microplate reader로 450 nm로 측정하였다.

(5) Osteocalcin 생성량

Biotinylated Osteocalcin을 각 well에 100μl 씩 넣고 실온(18~22

C)에서 30±5분 동안 배양하였다. 수세 용액 (400μl)으로 5회 wash한 뒤 Primary Antibody와 Pri- mary Incubation Buffer를 1:100 비율로 혼합하여 각 well에 150μl 씩 넣고, Standards (CAL0-5), sample (정 상군, 대조군, 양성대조군, KMK 투여군)을 각각 20μl 씩 넣은 후 커버를 닫고 실온에서 microplate shaker (300 rpm)로 60±5분 혼합하였다. 5회 wash 후, Secondary Antibody를 각 100μl 씩 넣고 microplate shaker (300 rpm)로 60±5분 혼합하였다. 다시 5회 wash 후, Sub- strate Solution를 각 100μl 씩 넣고 빛을 차단한 상태로 microplate shaker (300 rpm)로 15±2분 혼합하였다, Stop solution을 100μl 넣고 microplate reader로 450 nm로 측정하였다.

(6) TIMP-1 생성량

Diluent RD1-21을 각 well 50μl 씩 넣고 Standard, sample (정상군, 대조군, 양성대조군, KMK 투여군)을 50 μl 씩 넣고 1분 동안 가볍게 두드려 혼합한 후 커버를 닫고, 실온(18~22

C)에서 2시간 배양하였다. 5회 wash 후 Rat TIMP-1 Conjugate 100μl를 각 Well에 넣고 실온 에서 2시간 배양 하였다. 다시 5회 wash 후 Substrate Solution 100μl 씩 넣고 빛을 차단한 상태로 실온에서 30분 배양하였다. Stop Solution 100μl 씩 넣고 잘 혼합 한 후 microplate reader로 450 nm로 측정하였다.

(7) MMP-9 생성량

Diluent RD1-34을 각 well 50μl 씩 넣고 Standard, sample (정상군, 대조군, 양성대조군, KMK 투여군)을 50 μl 씩 넣고 1분 동안 가볍게 두드려 혼합한 후 커버를 닫고, 실온(18~22

C)에서 2시간 배양하였다. 5회 wash 후 Rat MMP-9 Conjugate 100μl 를 각 Well에 넣고 실온 에서 2시간 배양하였다. 다시 5회 wash 후 Substrate Solution 100μl 씩 넣고 빛을 차단한 상태로 실온에서 30분 배양하였다. Stop Solution 100μl 씩 넣고 잘 혼합 한 후 microplate reader로 450 nm로 측정하였다.

(8) LTB4 생성량

Diluent RD5-52을 비특이적 결합(non-specific bind-

Fig. 1. Image of cartilage degener- ation using μCT-arthrography in joint tissue of MIA-induced rat os- teoarthritis.

Source of figure: Piscaer TM, Waar- sing JH, Kops N, Pavljasevic P, Verhaar JA, van Osch GJ, Weinans H. In vivo imaging of cartilage de- generation using mCT-arthrography.

Osteoarthritis and Cartilage. 2008;

16:1011-7.

ing)을 한 well에 100μl, zero standard well에 50μl 넣 고, standard, sample (정상군, 대조군, 양성대조군, KMK 투여군)을 50μl 씩 넣었다. NSB well을 제외한 나머지 well에 Primary Antibody Solution을 50μl 넣고 커버를 닫은 후 microplate shaker (500±50 rpm)로 60±5분 동 안 실온(18~22

C)에서 반응한 뒤 LTB4-conjugate를 50μl 넣고 microplate shaker (500±50 rpm)로 180±5분 동안 실온에서 반응하였다. 수세 용액(400μl)으로 4회 wash 한 뒤 Substrate Solution을 200μl 넣고 빛을 차단한 뒤 30분 동안 실온에서 반응하였다. 마지막으로 Stop sol- ution을 100μl넣고 microplate reader로 450 nm에서 흡 광도를 측정하였다.

(9) 병리조직학적 검사

μCT (SKYSCAN, Belgium)촬영이 끝난 후 무릎 부위 를 절단하여 10% EDTA가 포함된 10% 포르말린 용액에 넣어 관절 조직을 탈칼슘화시켰다. Radiographic techni- que을 이용하여 decalcification 유무를 확인한 후 파라핀 왁스에 관절 조직을 넣고 고정한 다음 coronal section을 실시하였다. 탈칼슘화 과정을 거쳐 파라핀으로 고정된 조 직을 7μm의 크기로 자른 뒤, hematoxylin and eosin (H&E) 및 safranin-O 염색을 실시하여 조직의 상태를 관 찰하였다. 염증 반응 발생 유무나 활막세포의 증식, 염증 세포의 조직 침윤 여부는 H&E 염색 결과에서 확인할 수 있으며, proteoglycan 층을 염색하는 Safranin-O 염색 결 과에서는 연골 조직의 손상 여부를 확인하였다.

(10) μCT-arthrography 검사

μCT 측정은 조영제인 HEXABRICS 320 (Guerbet, France)를 꼬리 정맥에 주사 후 μCT-arthrograpy를 사용

하여 무릎관절 연골파괴정도를 파악하기 위하여 연골량 (cartilage volume)을 아래 그림과 같이 측정 및 분석하였 다(Fig. 1).

3. 통계처리

실험 결과는 SPSS 11.0의 unpaired student's T-test를 사용하여 통계처리 하였으며 p＜0.05, p＜0.01 및 p＜

0.001 수준에서 유의성을 검정하였다.

결과»»»

1. HPLC 분석

KMK 주정 추출물 및 개별약재 주정 추출물을 HPLC로 pattern 분석한 결과, 자감초(C)의 경우 glycyrrhizin을, 생강(E)은 6-gingerol을, 백작약(H)은 paeoniflorin을 그리 고 계지(J)의 경우 cinnamic acid를 각각 지표성분으로 확 인할 수 있었다. 그 외 KMK 및 개별약재도 같은 조건으 로 분석하여 성분 pattern을 확인할 수 있었다(Fig. 2).

2. 세포독성에 미치는 영향

RAW 264.7 세포주 세포 생존율은 대조군을 100.0±

2.0%로 나타냈을 때, KMK 주정 추출물 투여군은 50μg/

ml 농도에서 105.4±1.4%, 100μg/ml 농도에서 98.8±

6.3%, 200μg/ml 농도에서 87.3±5.6%의 세포 생존율을

Fig. 2. HPLC chromatogram of 70%

ethanol extract of KMK (A), Aconiti Tuber Praepareta (B), Glycyrrhizae Radix Praeparata (C), Ephedrae Herba (D), Zingiberis Rhizoma Cru- dus (E), Atractylodis Rhizoma Alba (F), Anemarrhenae Rhizoma (G), Paeoniae Radix Alba (H), Cyathulae Radix (I), Cinnamomi Ramulus (J), Saposhnikoviae Radix (K) and Spa- tholobi Caulis (L). Column; ACE 5 C18 (250×4.6 mm, 5μm), sample injection volume; 20μl, mobile phase; H

O(A)/ACN(B) gradient elution: 0% (5 min B), 0∼40% (25 min B), 40∼65% (10 min B), 65∼

100% (10 min B), flow rate; 1.0

ml/min, detector; PDA detector.

Fig. 3. Effects of KMK on the cell viability of RAW 264.7 cells. Cells were treated with control (0μg/ml), 50, 100, 200 μg/ml of KMK for 24 hrs. Cell viability was determined using the WST assay. The results are expressed as mean±SEM from three independent experiments.

Fig. 4. DPPH free radical scavenging activity of KMK at vari- ous concentration. Extracts were incubated with DPPH sol- ution at 37

C for 30 mins. Activities were determined by meas- urement of absorbance at 517 nm. The results are expressed as mean±SEM from three independent experiments.

Fig. 6. Effects of KMK on NO production in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. Cells were treated with LPS (1μg/ml) and control (0μg/ml), 50, 100, 200μg/ml of KMK for 24 hrs. The results are expressed as mean±SEM from three independent experiments. Significant value was calculated by compared with Control group by student's t-test (***p＜0.001).

Fig. 5. Effects of KMK on the ROS production in RAW 264.7 cells. The RAW 264.7 cells were stimulated with LPS and treat- ed with medium, control (0μg/ml), KMK (50, 100, 200μg/ml) for 24 hours. The ROS production was analysed following in- cubation with DCFH-DA by flow cytometry. The results were presented by the mean±S.E.

나타났다(Fig. 3).

3. 항산화능에 미치는 영향

1) DPPH 소거능

KMK 주정 추출물의 DPPH 소거율은 25μg/ml 농도에 서 16.4±4.3%, 50μg/ml 농도에서 22.8±2.5%, 100μg/

ml 농도에서 30.9±4.6%, 200μg/ml 농도에서 47.0±

6.2%, 400μg/ml 농도에서 56.3±6.5%, 800μg/ml 농도 에서 77.3±4.7%로 나타내었다(Fig. 4).

2) ROS 생성량

KMK 주정 추출물의 ROS 생성 저해 활성은 대조군을 100.0±2.0%로 나타냈을 때, 정상군은 36.4±2.6%, KMK 투여군은 50μg/ml 농도에서 121.8±11.2%, 100μg/ml 농도에서 116.3±5.0%, 200μg/ml 농도에서 97.1±12.5%

로 나타내었다(Fig. 5).

Fig. 7. Effects of KMK on LPS-stimulated IL-1β production in RAW 264.7 cells. Cells treated with LPS (1μg/ml) and control (0μg/ml), 50, 100, 200μg/ml of KMK for 24 hrs. The results are expressed as mean±SEM from three independent experi- ments. Statistically significant value was calculated by com- pared with Control group by student's t-test (*p＜0.05).

Fig. 8. Effects of KMK on LPS-stimulated IL-6 production in RAW 264.7 cells. Cells treated with LPS (1μg/ml) and control (0μg/ml), 50, 100, 200μg/ml of KMK for 24 hrs. The results are expressed as mean±SEM from three independent experi- ments. Significant value was calculated by compared with Control group by student's t-test (***p＜0.001).

Fig. 9. Effects of KMK on LPS-stimulated TNF-α production in RAW 264.7 cells. Cells treated with LPS (1μg/ml) and control (0μg/ml), 50, 100, 200μg/ml of KMK for 24 hrs. The results are expressed as mean±SEM from three independent experi- ments. Significant value was calculated by compared with Control group by student's t-test (*p＜0.01, **p＜0.001).

3) Total nitric oxide 생성량

KMK 주정 추출물의 NO생성량은 대조군을 100±4.9%

로 나타냈을 때, 정상군은 41.6±2.3%, KMK 투여군은 50 μg/ml 농도에서 127.0±3.4%, 100μg/ml 농도에서 96.6±8.7%, 200μg/ml 농도에서 63.0±2.2%로 나타나 KMK 투여군 200μg/ml 농도에서 유의성 있는(p＜0.001) 감소를 나타내었다(Fig. 6).

4. Cytokine 생성량에 미치는 영향

1) IL-1β 생성량

KMK 주정 추출물의 IL-1β 생성량은 대조군을 100.0

±0.4%로 나타냈을 때, 정상군은 23.4±8.6%, KMK 투여 군은 50μg/ml 농도에서 113.3±16.1%, 100μg/ml 농도 에서 110.0±14.1%, 200μg/ml 농도에서 75.5±15.4%로 나타나 대조군에 비해 KMK 투여군은 200μg/ml 농도에 서 유의성 있는(p＜0.05) 감소를 나타내었다(Fig. 7).

2) IL-6 생성량

KMK 주정 추출물의 IL-6 생성량은 대조군을 100.0±

0.4%로 나타냈을 때, 정상군은 1.8±2.3%, KMK 투여군 은 50μg/ml 농도에서 61.8±13.1%, 100μg/ml 농도에 서 59.9±11.8%, 200μg/ml 농도에서 42.9±8.6%로 나

타나 대조군에 비해 KMK 투여군 모든 농도에서 유의성 있는(p＜0.001) 감소를 나타내었다(Fig. 8).

3) TNF-α 생성량

KMK 주정 추출물의 TNF-α 생성량은 대조군을 100.0

±0.4%로 나타냈을 때, 정상군은 21.2±18.8%, KMK 투

여군은 50μg/ml 농도에서 94.9±3.4%, 100μg/ml 농도

에서 88.8±3.2%, 200μg/ml 농도에서 85.6±3.2%로 나

Fig. 10. Effects of KMK on weight changes in the hind legs of MIA-induced osteoarthritis rats.

Normal: Normal wister Rat group, Control: MIA-induced osteo- arthritis group, Indomethacin: MIA-induced osteoarthritis group treated with Indomethacin (2 mg/kg), KMK: MIA-induced os- teoarthritis group treated with KMK (211 mg/kg).

Values represent the means±SD. Statistically significant value compared with control by T test (**p＜0.05, ***p＜0.001).

Fig. 11. Effect of KMK on the ALT(a) and AST(b) in MIA-induced osteoarthritis rats.

Normal: Normal wister Rat group, Control: MIA-induced osteoarthritis group, Indomethacin: MIA-induced osteoarthritis group treated with Indomethacin (2 mg/kg), KMK: MIA-induced osteoarthritis group treated with KMK (211 mg/kg).

Values represent the means±SD.

타나 대조군에 비해 KMK 투여군 모든 농도에서 유의성 있는(p＜0.01, p＜0.001) 감소를 나타내었다(Fig. 9).

5. 뒷발의 체중부하에 미치는 영향

Weight bearing 측정 경우, 대조군의 측정값을 100±

11.2%로 나타냈을 때, 정상군에서 166.9±2.3%, Indom- ethacin 투여군은 164.1±4.7%, KMK 투여군은 152.7±

7.4%로 대조군에 비해 양성대조군과 KMK 투여군 모두에 서 유의성 있는(p＜0.05, p＜0.001) 증가를 나타내었다

(Fig. 10).

6. 간 기능에 미치는 영향

간 기능 측정의 지표 성분인 ALT는 정상군이 32.0±

1.7 (U/L), 대조군이 33.7±1.2 (U/L)로 나타냈고, 양성대 조군에서는 37.7±4.2 (U/L), KMK 투여군에서는 41.0±

8.2 (U/L)로 나타냈고, AST는 정상군이 130.0±8.7 (U/L), 대조군이 162.7±7.1 (U/L)로 나타냈고, 양성대조군에서 는 160.0±15.1 (U/L), KMK 투여군에서는 151.7±44.1 (U/L)로 나타내었다(Fig. 11).

7. 신 기능에 미치는 영향

혈청 중의 BUN 농도는 측정한 결과, 정상군이 15.30

±0.89 mg/dl, 대조군이 18.10±1.45 mg/dl로 나타냈으 며, 양성대조군에서는 18.90±2.03 mg/dl, KMK 투여군 은 17.97±7.65 mg/dl로 나타냈고, 혈청 중의 creatinine 농도는 정상군은 0.530±0.02 mg/dl, 대조군은 0.55±

0.02 mg/dl로 나타냈으며, 양성대조군에서는 0.58±0.01

mg/dl, KMK 투여군은 0.58±0.04 mg/dl로 나타내었다

(Fig. 12).

Fig. 13. Effects of KMK on levels of Prostaglandin E2 in the serum of MIA-induced osteoarthritis rats.

Normal: Normal wister Rat group, Control: MIA-induced osteo- arthritis group, Indomethacin: MIA-induced osteoarthritis group treated with Indomethacin (2 mg/kg), KMK: MIA-induced os- teoarthritis group treated with KMK (211 mg/kg).

Values represent the means±SD. Statistically significant value compared with control by T test (*p＜0.05, ***p＜0.001).

Fig. 14. Effects of KMK on levels of TNF-α in the serum of MIA-induced osteoarthritis rats.

Normal: Normal wister Rat group, Control: MIA-induced osteo- arthritis group, Indomethacin: MIA-induced osteoarthritis group treated with Indomethacin (2 mg/kg), KMK: MIA-induced os- teoarthritis group treated with KMK (211 mg/kg).

Values represent the means±SD. Statistically significant value compared with control by T test (*p＜0.05).

Fig. 12. Effect of KMK on the BUN (a) and creatinine (b) in MIA-induced osteoarthritis rats.

Normal: Normal wister Rat group, Control: MIA-induced osteoarthritis group, Indomethacin: MIA-induced osteoarthritis group treated with Indomethacin (2 mg/kg), KMK: MIA-induced osteoarthritis group treated with KMK (211 mg/kg).

Values represent the means±SD.

8. 혈청내 염증관련 매개인자 생성에 미치는 영향

1) Prostaglandin E2 생성량

혈청 내의 Prostaglandin E2 생성량은 대조군의 생성량 을 100.0±13.2%로 나타냈을 때, 정상군이 24.7±4.9%, 양성대조군이 42.2±9.5%, KMK 투여군이 55.3±25.6%

로 대조군에 비해 양성대조군과 KMK 투여군 모두에서 유의성 있는(p＜0.001, p＜0.05) 감소를 나타내었다(Fig.

13).

2) TNF-α 생성량

혈청 내의 TNF-α 생성량은 대조군의 생성량을 100.0

±12.3%로 나타냈을 때, 정상군은 82.8±18.5%, 양성대 조군이 85.0±9.0%, KMK 투여군이 92.1±7.5%로 대조군 에 비해 유의성은 없으나 감소를 나타내었다(Fig. 14).

3) IL-1β 생성량

혈청 내의 IL-1β 생성량은 대조군의 생성량을 100.0±

1.3%로 나타냈을 때, 정상군은 67.8±3.6%, 양성대조군

Fig. 15. Effects of KMK on levels of IL-1β in the serum of MIA-induced osteoarthritis rats.

Normal: Normal wister Rat group, Control: MIA-induced osteo- arthritis group, Indomethacin: MIA-induced osteoarthritis group treated with Indomethacin (2 mg/kg), KMK: MIA-induced os- teoarthritis group treated with KMK (211 mg/kg).

Values represent the means±SD. Statistically significant value compared with control by T test (**p＜0.01, ***p＜0.001).

Fig. 16. Effects of KMK on levels of IL-6 in the serum of MIA- induced osteoarthritis rats.

Normal: Normal wister Rat group, Control: MIA-induced osteo- arthritis group, Indomethacin: MIA-induced osteoarthritis group treated with Indomethacin (2 mg/ kg), KMK: MIA-induced os- teoarthritis group treated with KMK (211 mg/kg).

Values represent the means±SD. Statistically significant value compared with control by T test (*p＜0.05).

Fig. 17. Effects of KMK on levels of Osteocalcin in the serum of MIA-induced osteoarthritis rats.

Normal: Normal wister Rat group, Control: MIA-induced osteo- arthritis group, Indomethacin: MIA-induced osteoarthritis group treated with Indomethacin (2 mg/kg), KMK: MIA-induced os- teoarthritis group treated with KMK (211 mg/kg).

Values represent the means±SD. Statistically significant value compared with control by T test (***p＜0.001).

Fig. 18. Effects of KMK on levels of TIMP-1 in the serum of MIA-induced osteoarthritis rats.

Normal: Normal wister Rat group, Control: MIA-induced osteo- arthritis group, Indomethacin: MIA-induced osteoarthritis group treated with Indomethacin (2 mg/kg), KMK: MIA-induced os- teoarthritis group treated with KMK (211 mg/kg).

Values represent the means±SD. Statistically significant value compared with control by T test (***p＜0.001).

이 80.2±4.1%, KMK 투여군이 84.9±6.9%로 대조군에 비해 양성대조군과 KMK 투여군 모두에서 유의성 있는(p

＜0.001, p＜0.01) 감소를 나타내었다(Fig. 15).

4) IL-6 생성량

혈청 내의 IL-6 생성량은 대조군의 생성량을 100.0±

14.0%로 나타냈을 때, 정상군은 77.2±11.4%, 양성대조

군이 78.5±11.1%, KMK 투여군이 86.5±11.7%로 대조 군에 비해 양성대조군에서 유의성 있는(p＜0.05) 감소를 나타내었다(Fig. 16).

5) Osteocalcin 생성량

혈청 내의 Osteocalcin 생성량은 대조군의 생성량을

100.0±8.5%로 나타냈을 때, 정상군은 41.2±3.0%, 양성

Fig. 19. Effects of KMK on levels of MMP-9 in the serum of MIA-induced osteoarthritis rats.

Normal: Normal wister Rat group, Control: MIA-induced osteo- arthritis group, Indomethacin: MIA-induced osteoarthritis group treated with Indomethacin (2 mg/kg), KMK: MIA-induced os- teoarthritis group treated with KMK (211 mg/kg).

Values represent the means±SD. Statistically significant value compared with control by T test (**p＜0.01, ***p＜0.001).

Fig. 20. Effects of KMK on levels of LTB4 in the serum of MIA-induced osteoarthritis rats.

Normal: Normal wister Rat group, Control: MIA-induced osteo- arthritis group, Indomethacin: MIA-induced osteoarthritis group treated with Indomethacin (2 mg/kg), KMK: MIA-induced os- teoarthritis group treated with KMK (211 mg/kg).

Values represent the means±SD. Statistically significant value compared with control by T test (*p＜0.05, ***p＜0.001).

대조군이 60.1±4.1%, KMK 투여군이 55.2±7.1%로 대조 군에 비해 양성대조군과 KMK 투여군 모두에서 유의성 있는(p＜0.001) 감소를 나타내었다(Fig. 17).

6) TIMP-1 생성량

혈청 내의 TIMP-1 생성량은 대조군의 생성량을 100.0

±1.6%로 나타냈을 때, 정상군은 54.4±3.9%, 양성대조 군이 72.0±4.2%, KMK 투여군이 79.3±4.9%로 대조군에 비해 양성대조군과 KMK 투여군 모두에서 유의성 있는(p

＜0.001) 감소를 나타내었다(Fig. 18).

7) MMP-9 생성량

혈청 내의 MMP-9 생성량은 대조군의 생성량을 100.0

±1.8%로 나타냈을 때, 정상군은 50.0±4.1%, 양성대조 군이 64.6±1.0%, KMK 투여군이 79.6±8.3%로 대조군에 비해 양성대조군과 KMK 투여군 모두에서 유의성 있는(p

＜0.001, p＜0.01) 감소를 나타내었다(Fig. 19).

8) LTB4 생성량

혈청 내의 LTB4 생성량은 대조군의 생성량을 100.0±

12.3%로 나타냈을 때, 정상군은 67.4±10.2%, 양성대조 군이 69.8±6.5%, KMK 투여군이 75.8±16.2%로 대조군 에 비해 양성대조군과 KMK 투여군 모두에서 유의성 있 는(p＜0.001, p＜0.05) 감소를 나타내었다(Fig. 20).

9. 병리조직학적 변화에 미치는 영향

1) Hematoxylin & Eosin 염색

조직 염색 결과 정상군의 관절은 활막 조직이 정상적 으로 위치한 반면, 대조군은 관절 주변에 대식세포, 과립 구세포, 단핵구 세포의 과다 침투가 일어났으며, 연골과 뼈의 침하로 관절 조직의 손실이 일어난 것으로 나타났 다. 양성대조군과 KMK 투여군은 관절 주변에 대조군에 서 관찰된 대식세포, 과립구세포, 단핵구 세포의 과다 침 투에 의한 연골과 뼈의 침하 등이 상대적으로 감소하였다 (Fig. 21).

2) Safranin-O 염색

조직 염색 결과 정상군의 관절 연골을 빨간색으로 전 체가 염색되어 proteoglycan 함유량이 많은 상태로 관찰 되었다. 대조군은 관절 주변에 염증세포의 침투가 일어나 빨간색으로 염색된 연골조직이 거의 사라진 것을 관찰할 수 있었다. KMK 투여군은 연골의 파괴정도가 대조군에 비해 감소하여 빨간색으로 염색된 범위 및 강도가 증가되 어 나타났다(Fig. 22).

10. 연골량에 미치는 영향

연골량이 정상군이 4.64 mm

, 대조군이 1.15 mm

, 양

Fig. 21. Effects of KMK on joint pathology (Hematoxylin & Eosin staining) from joint tissue of MIA- induced osteoarthritis rats (×100).

Normal: Normal wister Rat group, Control: MIA-induced osteoarthritis group, Indomethacin: MIA-induced osteoarthritis group treated with In- domethacin (2 mg/kg), KMK: MIA- induced osteoarthritis group treated with KMK (211 mg/kg).

Fig. 22. Effects of KMK on joint pathology (Safranin-O staining) from joint tissue of MIA-induced osteo- arthritis rats (×100).

Normal: Normal wister Rat group, Control: MIA-induced osteoarthritis group, Indomethacin: MIA-induced osteoarthritis group treated with In- domethacin (2 mg/kg), KMK: MIA- induced osteoarthritis group treated with KMK (211 mg/kg).

성대조군이 3.70 mm

, KMK 투여군이 1.73 mm

로 양성

대조군과 KMK 투여군에서 증가를 나타내었다(Fig. 23). 고찰»»»

골관절염은 연령, 인종, 혹은 지역을 막론하고 가장 흔

한 관절 질환으로 신체가 노화됨에 따라 관절을 보호하고

Fig. 23. Effects of KMK on volume of cartilage using μCT-ar- thrography in joint tissue of papain-induced rat osteoarthritis.

Normal: Normal wister Rat group, Control: MIA-induced osteo- arthritis group, Indomethacin: MIA-induced osteoarthritis group treated with Indomethacin (2 mg/kg), KMK: MIA-induced os- teoarthritis group treated with KMK (211 mg/kg).

있는 연골의 손상 또는 퇴행성 변화로 인해 관절을 이루 는 뼈와 인대 등에 손상이 일어나고 염증과 통증이 생기 는 질환이다

. 골관절염이 이환된 관절에서는 연골의 국 소적인 퇴행성 변화, 연골하골의 비대, 주변 골연골부의 과잉골 형성, 관절의 변형 등이 관찰되며, 임상적으로 반 복적인 통증, 관절 강직감 및 점진적인 운동 제한 등이 초래된다

.

골관절염의 발병기전은 불명확한데 초기에는 연골세포 에 가해지는 불균등한 압력과 물리적인 장력을 이기기 위 해 연골세포가 기능적으로 변화하고 부분적인 세포의 괴 사 및 반응성 증식이 일어나 세포분열과 대사활성이 증가 되어 연골세포의 집락이 형성되고 collagen과 proteogly- can의 생산이 증가된다

. 이로 인해 연골의 비후가 나 타나며 이러한 보상성 기전들이 관절의 기능을 수년 동안 잘 유지시켜주게 되나 지속적인 기계적 스트레스로 연골 세포에 역학적 및 생화학적 변화가 나타남으로써

관절 강내로 protease, collagenase 등의 분해효소의 분비가 증 가되어 proteoglycan 합성의 저하와 교원질대사에 변화가 초래되어 결과적으로 관절연골 표면의 변성 및 탈락이 나 타나고 연골하골이 경화되고 골극을 형성하는 골관절염 이 발생하는 것으로 보고되어 있다

.

노화가 진행되면 정상적으로 연골에 존재하는 교원질 의 성분이 변화하고 keratan sulfate의 증가, chondroitin sulfate 감소, proteoglycan 함량 감소, 세포충실성(cell- ularity)의 감소 등과 같은 외견상 관찰되지 않는 미세한 퇴행성 변화가 일어난다. 연골에 가해지는 기계적 과부하 는 궁극적으로 연골세포에서 IL-1β 및 TNF-α 등의 분 비를 자극하고 이에 따른 collagenase, proteinase 등 기 질 금속단백 분해효소(matrix metallo-proteinase, MMPs)

의 분비가 증가되고 proteoglycan 합성율이 떨어지면서 기질내 대사성 산물들이 증가하여 연골의 전층이 손실된 다

.

韓醫學에서 골관절염은 痺證에 속하며 이는 風寒濕熱 의 邪氣가 인체의 榮衛失調, 腠理空疎 혹은 正氣虛弱을 틈타 經絡으로 침입하거나 關節에 응체됨으로써 血氣運 行을 저해하여 발생하는 것으로 여겨지고 있다

.

痺症의 槪念을 󰡔黃帝內經󰡕

에서는 "痺者痛也"라 하였 으며, 張

은 "痺者閉也…壅閉經絡血氣不行"이라 하였다.

또한 󰡔黃帝內經 素問ㆍ五藏生成論󰡕

에 "臥出而風吹之 血凝於膚者爲痺"라고 하였고, 󰡔黃帝內經 素問ㆍ痺論󰡕

에서 "風寒濕三氣雜至合而爲痺也"라 하여 痺는 風寒濕의 三邪가 經絡에 阻滯되어 氣血이 不暢하게 되니 臨床的으 로 筋骨, 肌肉關節 등에 疼痛, 酸脹, 重着, 麻木, 關節의 腫大, 屈伸不利의 症狀을 隨伴하게 되는 것이다.

痺症의 原因에 대하여 󰡔金匱 ^要 略󰡕

에서 "短氣自汗出 歷節疼不可屈伸此皆飮酒汗出當風所致"라 하여 飮酒汗出ㆍ 風邪을, 󰡔巢氏諸病源候論󰡕

에서 "由人體虛 腠理開 故受 風邪也"라 하여 體虛ㆍ風邪를, 痺症의 分類에 있어 󰡔黃帝 內經 素問ㆍ痺論󰡕

에서는 風寒濕 三邪의 偏勝에 따라 行痺, 痛痺, 着痺로 分類하였으며, 張

은 行痺를 痛處가 일정치 않고 關節에 不定流走한다고 하여 歷節疼痛之類 라고 하였고, 痛痺를 寒氣凝結에 의한 陽氣가 不行한 所 致로서 痛有定處한다고 하여 痛風이라고 하였으며, 着痺 는 濕에 의하므로 肢體重着하고 疼痛이 흩어지지 않으며 麻木과 같다고 하였다.

桂芍知母湯은 歷節風에 사용하는 처방으로

, 桂芍知母 湯加 味方 (KMK)은 桂芍知母湯에 川牛膝과 鷄血藤을 가 한 처방이다. 鷄血藤

은 行血補血, 舒筋活絡하는 효능이 있으며 류마토이드 관절염 환자의 활막세포에 면역반응 을 나타내고 collagen으로 유발된 생쥐의 관절염을 억제 하는 효과가 있음이 보고되었다

. 川牛膝

은 活血去 瘀하고 關節을 通利시키며 肝腎을 滋養하여 筋骨을 강하 게 하는 效能이 있어 관절염에 다용되는 약재이다. 이와 비슷한 처방인 관절6호방

이 기존에 Type II collagen으 로 유발된 류마토이드 관절염에 면역학적 기전으로 유의 한 효과를 보인 적이 있어 KMK 역시 골관절염에 유사한 효과를 기대할 수 있다.

MIA로 유발된 골관절염 동물모델은 Kalbhen and

Blum

에 의해서 닭을 이용해 최초로 시도된 후 mice 및

rat 등의 동물에서도 골관절염 모델로 사용되었다.

MIA를 관절강내에 주입하면 glyceraldehyde-3-phos- phate dehydrogenase 활성이 억제되며, 연골세포의 해당 작용(glycolysis)이 차단되어 연골세포의 괴사가 초래되 며

, MIA에 대해 용량 의존적으로 Proteoglycan 합성이 감소되어 관절연골의 변성 및 괴사가 진행된다

. MIA 유발 골관절염에서 연골의 조직학적 및 형태학적 변화는 사람의 골관절염과 매우 유사하여

골관절염과 관련된 많은 연구에서 이용되어 왔다.

이에 본 연구에서는 RAW 264.7 세포에서 KMK의 항 산화능과 IL-1β, IL-6, TNF-α 등의 cytokine 생성량을 측정하고 MIA로 관절염이 유발된 Wister Rat에 KMK를 투여하고 뒷발 체중부하측정, 혈액 내 Prostaglandin E2, IL-1β, IL-6, TNF-α, Osteocalcin, TIMP-1, MMP-9, LTB4 측정, 병리조직학적 검사와 μCT-arthrography 등 을 시행하였다.

KMK 주정추출물은 RAW 264.7 세포주에서 세포독성 을 나타내지 않았으며(Fig. 3), MIA로 골관절염이 유발된 Wister Rat의 간장과 신장에도 영향을 미치지 않아(Fig.

11, 12), 독성이 없는 안전한 약물임을 확인하였다.

Free Radical은 정상적인 신체 대사과정 중에 생성된 한 개 이상의 비공유전자를 가진 불안정한 상태의 이온으 로 DNA 손상을 일으키고 단백질의 과산화물을 생성하며 지질과산화를 유발하는 등 여러 염증반응과 연관되어 노 화 및 조직손상과 밀접한 관련이 있다

. NO는 short- lived free radical로 혈관의 긴장, 혈소판 기능, 신경 전 달, 면역 기능에서 중요한 역할을 하며 류마토이드 관절 염 및 골관절염 등과 같은 질병의 다양한 과정동안 과량 생산된다

. NO의 과생산은 지속적인 염증과 조직 손상 에 관련되어 있는데, 관절염 실험 모델에서 NO의 생합성 이나 활성을 조절함으로써 관절염 병태가 개선됨을 확인 할 수 있었다

. ROS는 연골조직을 파괴하는 물질 중 하 나로 추측되고 있으며 superoxide radical, hydrogen peroxide, hydroxyl radical, hypochlorous acid 등이 이 것에 속하며, superoxide radical, hydrogen peroxide은 직접적으로 조직을 손상시키지는 않지만 여러 기전에 의 해서 반응성 높은 hydroxyl radical로 전환되어 조직에 손 상을 주는 것으로 알려져 있다

.

본 실험에서 KMK 주정 추출물의 RAW 264.7 세포에 서 DPPH 소거율은 농도 의존적으로 증가되었다(Fig. 4).

NO생성량은 대조군을 100±4.9%로 나타냈을 때 200μg/

ml 농도에서 63.0±2.2%로 나타나 유의성 있는 감소를 나타내었고(Fig. 6) ROS 생성 저해 활성은 대조군과 유의 한 차이를 나타내지 않았다(Fig. 5).

IL-1과 TNF-α, IL-6 등의 cytokine은 관절의 여러 자 극이나 조직의 손상에 대한 연골세포의 반응으로 작용하 여 연골세포의 이화 및 동화 작용을 나타내며

, 관절 기 질의 중요 요소인 Proteoglycan의 합성과 분해의 불균형 을 유발하여 골관절염을 일으킨다

.

IL-6은 IL-1과 TNF-α에 의해 분비가 촉진되는 급성 조 절 단백질로 골관절의 염증반응에 주된 매개 작용을 하여 혈청 및 관절염으로 손상된 관절의 관절액에서 활성도가 증가하며, 골관절염의 활성도와 연관성이 있다

. TNF- α와 IL-1β는 주로 대식세포에서 분비되고, T세포와 B 세포의 기능을 증가시키며, 호중구, 림프구, 단핵구의 화 학유주 및 섬유모세포를 증식시키고 활막섬유모세포와 연골세포에 작용해서 Prostaglandin E2와 Collagenase 생 산을 촉진한다

. TNF-α는 화상, 자외선, 세균감염 등 여러 스트레스에 대해 가장 먼저 반응하여 혈장 백혈구의 도달을 유도하고, IL-1, IL-6 및 matrix metalloproteinases (MMPs) 등의 cytokine등의 생산을 유발하여 세포손상, 세포자멸사, shock등의 생물학적 반응을 유도하는 것으 로 알려져 있다

. 골관절염에서는 IL-1β와 함께 관절연 골 기질로부터 Proteoglycan의 소실율 증가 및 재합성 억 제 작용을 통해 골관절염의 유발및 진행 유도의 역할을 하는 것으로 알려져 있다

.

본 실험에서 KMK 주정 추출물의 RAW 264.7 세포에 서 IL-1β 생성량은 200μg/ml 농도에서 75.5±15.4%로 대조군에 비해 유의성 있는 감소를 나타내었고(Fig. 7).

IL-6 생성량은 KMK 50μg/ml 농도에서 61.8±13.1%, 100μg/ml 농도에서 59.9±11.8%, 200μg/ml 농도에서 42.9±8.6%로 나타나 모든 농도에서 대조군에 비해 유의 성 있는 감소를 나타내었다(Fig. 8). 또한 TNF-α 생성량 역시 50μg/ml 농도에서 94.9±3.4%, 100μg/ml 농도에 서 88.8±3.2%, 200μg/ml 농도에서 85.6±3.2%로 나타 나 모든 농도에서 대조군에 비해 유의성 있는 감소를 나 타내었다(Fig. 9).

이상과 같이 KMK 주정 추출물은 염증 관련 사이토카 인의 생성을 억제함을 알 수 있었다.

MIA로 골관절염이 유발된 Wister Rat의 뒷발 체중부하

측정 결과 KMK 투여시 152.7±7.4%로 정상군(166.9±

2.3%) 및 양성 대조군과(164.1±4.7%) 거의 비슷한 수준 을 나타내었으며 대조군에 비해 매우 유의성 있는 증가를 나타내었다(Fig. 10). 이는 KMK 투여로 환측의 관절 기 능이 회복되어 체중을 지지할 수 있음을 나타내는 것으로 관절염으로 인한 통증의 감소와 관절연골의 회복을 의미 한다 할 수 있다.

Prostaglandin은 통증과 염증에 관여되며, 위장관계 점 막에서 세포보호, 신장 혈류량과 기능 유지, 그리고 신체 의 평형 유지 등에 매우 중요한 역할을 한다

. Prost- aglandin E2은 COX 활성에 따른 주요 산물로서 TNF-α 와 IL-1β에 의해 생산이 촉진된다. 염증 질환, 자가면역 질환 그리고 종양성 질환의 병리에서 중요한 역할을 하 며, 특히 염증 반응의 중요한 매개물질로 작용한다

.

Osteocalcin은 골아세포에서 생산되는 단백질로 골대사 의 지표인자이다. 성장호르몬의 작용으로 골아세포가 증 식되고 교원섬유와 Alkaline phosphatase 등과 함께 작용 이 촉진된다. 혈청내 Osteocalcin은 골아세포의 활성도를 나타낸다. 관절염에서 Osteocalcin의 생산이 증가되었다 면 관절내 골소실을 의미하는 것이라 할 수 있다

.

MMPs는 암세포와 활막세포가 생체 내에서 세포외기질 단백질(extracellular matrix protein)에 작용하여 침입을 하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 전이 및 침투 유발효소이다. TNF-α와 IL-1β에 의해 MMPs의 생산 및 분비가 촉진되며 연골세포에서 생성되는 sulfate proteo- glycan, 제 2형 Collagen 등의 연골 특이세포외기질단백 질(extracellular matrix protein, ECMP)의 생산과 분해의 항상성을 깨뜨린다. 이중 MMP-3와 MMP-9은 Collagenase 로서 연골세포의 파괴에 결정적인 역할을 하며 연골의 proteoglycan의 분해에 관여한다고 증명된 바 있다

.

혈관 신생 억제 단백질로 알려진 TIMP는 MMP와 1:1 로 결합하여 효소활성을 저해하여 혈관 신생의 균형을 조 절하고 관절에서 MMP에 의한 연골의 손상을 방지하는데 기여할 수 있을 것이라 알려져 있다

.

LTB4는 골대사에 영향을 미치며 류마티스 관절염, 골 관절염, 치주염 같은 염증 유발성 골손실 질환에서 형성 이 증가되었으며 LTB4 수용체 길항제는 류마티스 관절염 을 완화시켜 파골세포에 의한 뼈흡수를 촉진하는 것으로 알려져 있다

.

본 실험에서 KMK 주정 추출물을 MIA로 골관절염이

유발된 Wister Rat에 투여했을 때 혈청내 Prostaglandin E2는 대조군에 비해 유의성 있는 감소를 나타내었다(Fig.

13). 혈청 내의 TNF-α생성량과 IL-6 생성량은 대조군에 비해 유의한 차이가 없었으나 IL-1β 생성량은 대조군에 비해 유의성 있는 감소를 나타내었다(Fig. 15).

혈청 내의 Osteocalcin 생성량과 TIMP-1 생성량은 대 조군에 비해 유의성 있는 감소를 나타내었고(Fig. 17, 18). MMP-9 생성량과 LTB4 생성량 역시 대조군에 비해 유의성 있는 감소를 나타내었다(Fig. 19, 20).

이상과 같이 KMK 주정 추출물은 염증관련 매개인자의 생성에 유의하게 작용하는 것을 알 수 있었다.

병리조직학적 변화를 살펴보기 위하여 Hematoxylin &

Eosin 염색을 하였을 경우 대조군에 비하여 대식세포, 과 립구세포, 단핵구 세포의 과다 침투에 의한 연골과 뼈의 침하 등이 상대적으로 감소하였다(Fig. 21). 또한 Safranin-O 염색을 한 결과 대조군에서는 거의 빨간색 염 색이 보이지 않았으나 KMK투여군에서는 빨간색으로 염 색된 범위 및 강도가 증가되었다(Fig. 22). 실험종료 후 조형제인 헥사브릭스(HEXABRICS 320)를 무릎 관절에 주 사 후 μCT-arthrography를 사용하여 연 무릎관절 연골 파괴정도를 연골량(cartilage volumne)으로 측정 및 분석 하였을 때도 연골량이 대조군에 비해 증가하였다(Fig.

23). 이는 KMK투여군에서 proteoglycan의 함량이 증가 로 연골과 관절조직의 파괴를 감소시킨 것으로 생각된다.

이상의 결과로 보아 KMK는 시험관내에서 뿐만 아니라 생체내에서도 관절조직의 cytokine으로 인한 면역학적 손 상을 방지하고 이로 인한 통증을 조절하며 연골의 손상을 방지하고 골소실을 억제하는 등의 골관절염 치료제로서 의 가능성이 있다고 사료된다. 다만 생리활성을 나타내는 화학성분에 대한 연구와 더불어 활성기전에 대한 분석이 미흡했던 점은 아쉬운 점으로 향후 이에 대한 추가 연구 가 필요할 것으로 사료된다.

결론»»»

桂芍知母湯加味方 (KMK)의 골관절염에서의 치료효과

를 실험적으로 규명하고자, RAW 264.7 세포에서 KMK의

항산화능과 IL-1β, IL-6, TNF-α 등의 cytokine 생성량을

측정하였다. 또한 MIA로 관절염이 유도된 Wister rat에

KMK를 투여한 후 뒷발 체중부하능을 시행하고, 혈액을 통한 Prostaglandin E2, IL-1β, IL-6, TNF-α, Osteocal- cin, TIMP-1, MMP-9, LTB4의 생성량을 측정하였으며, 병 리조직학적 검사와 μCT-arthrography 등을 시행하여 다 음과 같은 결과를 얻었다.

1. DPPH 소거율은 농도 의존적으로 증가되었다.

2. NO생성량은 200μg/ml 농도에서 유의성 있는 감소 를 나타내었다.

3. IL-1β 생성량은 200μg/ml 농도에서 유의성 있는 감소를 나타내었고, IL-6 생성량과 TNF-α 생성량은 모든 농도에서 유의성 있는 감소를 나타내었다.

4. 뒷발 체중부하측정 결과 유의성 있는 증가를 나타내 었다.

5. Prostaglandin E2 생성량은 유의성 있는 감소를 나 타내었다.

6. IL-1β 생성량은 유의성 있는 감소를 나타내었다.

7. Osteocalcin, TIMP-1, MMP-9, LTB4의 생성량은 유 의성 있는 감소를 나타내었다.

8. 병리조직학적 검사에서 연골과 뼈의 침하 등이 감소 하였다.

9. 연골량(cartilage volumne)을 분석한 결과 연골파괴 를 억제하였다.

이상의 성적을 토대로 할 때 계작지모탕은 흰쥐의 골 관절염을 억제하는 것으로 나타나며, 추후 임상적으로 엄 격한 기준을 충족한 연구가 필요할 것으로 사료된다.

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