수핵 탈출 형태에 따른 섬유모세포성장인자의 발현

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목 적 :탈출된 수핵의 자연적인 재흡수가 보고된 이후로 이에 대한 많은 기전이 연구 보고되어 왔다. 특히 재흡수 기전의 하나로 염증 반응에 의한

대포식세포의 포식 작용 및 신생 혈관의 무혈성 수핵 내로 성장함이 관여한다는 주장이 발표되어 왔다. 따라서 본 논문의 목적은 각 유형의 수핵 탈 출증에서 신생 혈관의 지표인 섬유모세포성장인자를 정량 비교하여 혈관 신생의 정도를 비교하고, 탈출된 수핵의 신생 혈관을 관찰하는 것이다.

대상 및 방법 : 제 4-5요추간 수핵 탈출증으로 수술받은 27명의 환자로부터 수핵 조직을 채취하였으며, 5명의 척추 골절 및 특발성 측만증 환자에서 얻은 수핵 조직을 대조군으로 하였다. 자기 공명 영상 및 수술 소견으로 이들 수핵 탈출은 돌출형, 탈출형 그리고 격리형으로 분류하니, 돌출형 7예, 탈출형 10예 그리고 격리형 10예이었다. 조직들의 섬유모세포성장인자를 western blot 방법으로 분석하여 각 유형간 상대적 정량 비교를 하였으며, H-E 염색과 CD34 면역조직화학법으로 수핵 내에 혈관조직이 관찰되는지 그리고 된다면 혈관 내피 세포가 염색되는지 관찰하였다.

결 과 : 섬유모세포성장인자의 발현양은 돌출형에서는 대조군과 비교하여 유의하게 증가하지 않았으나(p>0.05), 탈출형은 돌출형에 비해 유의하게 증가하고(p<0.05), 격리형도 탈출형에 비해 유의하게 증가하였다(p<0.05). 면역조직학적 검사에서 격리형 수핵의 변연부에서 신생 혈관을 관찰할 수 있었다.

결 론 :격리형에서 신생 혈관의 성장에 따른 탐식 작용에 의하여 자연 흡수가 더 활발히 일어나며, 무혈성 수핵 조직에 혈관이 침투하여 자연 흡수

에 관여함을 증명할 수 있었다.

색인 단어 : 추간판탈출증, 재흡수, 격리형, 섬유모세포성장인자, 면역조직화학법

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수핵 탈출 형태에 따른 섬유모세포성장인자의 발현

하기용∙신재혁∙황승현

가톨릭대학교 의과대학 강남성모병원 정형외과

서 론

Guinto 등⁹⁾이 처음으로 탈출된 수핵의 자연적인 흡수를 보고 한 이래로 최근에는 수핵 탈출증의 자연적 재흡수가 컴퓨터 단 층 촬영, 혹은 자기 공명 영상으로 확인되고 있으며 탈출된 수 핵의 유형별에 따라 재흡수에 대한 여러 기전이 보고되었다.

Coventry 등⁶⁾은 30세 미만의 나이에서의 정상 수핵은 무혈관 조직이라고 발표하였다. Carreon 등⁴⁾은 추체 연골 종판(carti- lage end plate)이 신생 혈관의 형성에 중요한 역할을 한다고 하였으며, 추체 종판이 다량 포함된 수핵 탈출에서는 섬유륜만 포함된 수핵 탈출과는 다르게 신생 혈관이 자라지 않으며, 따라 서 자연적인 재흡수가 일어나지 않는다고 하였다. 그러나 Komori 등¹²⁾은 탈출된 수핵의 재흡수가 자기 공명 영상 추시상 이주된 탈출 수핵에서 흔히 일어난다고 하였으며, Maigne 등¹³⁾ 도 탈출된 수핵의 크기가 클수록 재흡수가 빨리 된다고 전산 단 층 촬영 추시로 보고하면서 이는 섬유륜의 외연이 파열되며 수핵 이 경막외 공간으로 들어갔기 때문이라 가정하였다. Ozaki 등¹⁷⁾ 은 탈출된 수핵이 파열된 후종인대를 관통하였는지 여부가 탈출

수핵의 크기 감소에 오히려 더 중요하다고 하였다. 특히 격리형 수핵은 경막의 혈류에 노출이 되며, 염증 반응, 혈관 신생이 수 핵의 변연부에서 일어나고, 대포식세포의 포식작용에 의해 수핵 의 재흡수가 일어난다고 하였다. 그러나 신생 혈관으로 인한 수 핵의 재흡수의 정확한 기전은 잘 밝혀지지 않고 있다. Take- hara²⁰⁾는 섬유모세포성장인자는 섬유모세포, 혈관 내피 세포 그 리고 상피세포의 분열 및 이주를 자극하여 신생 모세 혈관과 육 아 조직의 형성에 관여한다고 하였다. Alvarez-Mendoza 등¹⁾은 면역염색연구를 통해 CD34는 혈관내피세포에만 특이하게 존재 한다고 하였다. 따라서 본 연구는 탈출된 수핵의 유형에 따른 신생 혈관의 성장을 섬유모세포성장인자를 이용하여 정량 비교 분석하고, 각 유형별에 따른 신생혈관의 분포를 혈관 내피 세포 특이 염색을 통해 증명하고자 시행케 되었다.

연구 대상 및 방법

27명의 과거 수술의 경험은 없는 환자로부터 제 4-5요추간 수핵 제거술 시에 채취하였다. 환자의 평균 연령은 46세 범위 (21-59세)이었다. 이 중 여성이 16명이었고, 남성이 11명이었 다. 모든 환자는 심한 방사통을 하지에 호소하고 있었으며, 증상 263

263 통신저자 : 하 기 용

서울시 서초구 반포동 505 가톨릭대학교 강남성모병원 정형외과

TEL: 02-590-1464∙FAX: 02-535-9834 E-mail: [email protected]

발현 4주 이내에 수술을 시행하였으며, 평균 증상 발현부터 수 술까지의 기간은 9일(2일-4주)이었다. 탈출된 수핵 조직의 유형 은 다음과 같이 분류하였다. 돌출형(protruded) 수핵: 섬유륜 의 외측연을 뚫지 않은 수핵 탈출증; 탈출형(extruded) 수핵:

후종인대를 뚫은 수핵 탈출증; 격리형(sequestrated) 수핵: 후 종인대를 뚫고, 수술 소견상 경막외 부골화 증상을 보이는 수핵 탈출로 분류하였다. 대조군으로는 5예의 특발성 척추 측만증 및 척추 골절에서 전방 교정술 및 기기 고정술의 수술로부터 채취 한 정상적인 수핵 조직을 대상으로 하였다. 이들의 평균 연령은 21세 범위(17-23)이었다. 따라서 채취한 조직은 유형의 분류에 따라 7예의 돌출형, 10예의 탈출형 그리고 10예의 격리형 수핵 으로 구성되었다.

2. Western blot

채취된 조직의 일부는 즉시 액화 질소에 보관 후, -70℃에서 실험까지 보관하였다. 실험시 정상적인 실내 온도에서 조직을 녹였다. 조직을 미세 조직 분쇄기로 PBS 완충액과 항단백질분 해효소의 혼합액에서 갈아서 12.5% SDS polyacrylamide gel 에서 전기영동시킨 후, nitrocullolose membranes (PVDF;

Millipore, Bedford, MA)으로 전기적으로 전사시켰다. 단백질 의 labelling은 실온에서 avidin-biotin peroxidase complex method로 실시하였다. Membrane을 다클론성 토끼섬유모세포 성장인자 항체(Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA)와 60분 동안 반응시키고 PBS로 세척하였다. Membrane 을 다시 goat anti-rabit Ig-alkP 항체(StressGen Biotechnolo- gies Corp., Victoria BC, Canada)와 60분간 반응시키고, PBS 로 세척 후, avidin-biotin peroxidase로 1분 동안 가온시키고 세척 후 가시화시켰다. 각 유형별 b-FGF 단백질량을 ANOVA 로 비교 분석하고, p-value가 0.05 이하에서 의미 있는 것으로 판단하였다.

3.조직학적 관찰

1^{) H-E 염색}

조직을 formalin 용액을 이용하여 고정한 후, 저 농도에 서 고농도 알코올을 이용하여 수분을 제거하고, 탈알콜 과정과 xylene으로 투명 과정을 거친 후 연질 파라핀부터 경질 파라핀 까지 항온기에 침투시켜 파라핀 포매 블록을 만들었다. 박절기 로 조직을 5 m로 자른 후, 각각의 조직을 H-E 염색하였다.

2) 면역조직화학적 관찰

파라핀 포매 조직을 5 m로 잘라 슬라이드에 부칙시킨 후 탈 파라핀 과정 및 재수화 과정을 시행하였다. 내인성 과산화효 소의 저지를 위해 조직 절편을 7분간 절대 메탄올내 3% H2O2

용액으로 처리하였다. 비특이적인 항원-항체 결합을 억제하기

위해 정상 인체 혈청에 30분간 반응시킨 뒤 1:50으로 희석 된 혈관 내피 세포의 특이 항체인 CD34 항체(Biomeda, Foster city, CA)를 실온에서 60분간 반응시켰다. 이차 항체로 biotiny- lated Ig (DACO, Glostrup Denmark)을 실온에서 10분간 반 응시킨 뒤, streptavidin을 가하고 실온에서 10분간 반응시켰다.

발색제로는 DAB를, 대조 염색제로는 H-E 염색을 사용하였다.

조직의 판독은 서로 다른 두 판독자가 각각 가장 혈관 밀도가 높은 세 부위를 택하여 광학현미경 200배 시야에서 양성인 혈관 의 수를 세어 증례별 평균치를 구하였다. 혈관 중에서 6-8개 이 상의 적혈구가 들어갈 만한 큰 직경의 혈관, 두꺼운 근층이 있 는 혈관과 괴사, 염증 및 경화가 있는 부위는 수복반응으로 인 한 이차적인 혈관의 증식이 나타나는 곳이므로 제외하였다. 한 개의 혈관 내피세포 또는 내강이 없는 내피세포의 소집단은 세 포 하나 하나를 각각 한 개의 혈관으로 간주하여 계산하였다.

연구 대상의 미세 혈관 밀도 평균치를 구하여 서로의 상관 관계 를 계산하였다.

결 과

각 유형을 전기 영동한 결과, 섬유모세포성장인자의 유형별 농도차이가 육안적으로 식별되었다(Fig. 1). 이를 영상 분석기 로 분석하여 상대적 차이를 수치화 하였다. 수핵탈출의 형태에 따른 섬유모세포 성장인자의 발현량의 평균값을 살펴보면 대조 군은 100.0±5.6, 돌출형은 108.4±7.5, 탈출형은 237.6±8.5, 격 리형은 496.8±6.0이었다. 섬유모 세포 인자의 발현을 ANOVA 로 분석한 결과, 대조군과 비교하여 돌출형은 의미 있는 증가를 나타내지 않았으나(p>0.05), 탈출형은 돌출형에 비해 그리고 격

Fig. 1. Western blot analysis for b-FGF showing gradually increasing band density in the extruded and sequestrated type of HNP. Bands illustrated are as follows: marker (M), protruded (1), extruded (2), sequestrated (3) and control (4).

M 1 2 3 4

←b-FGF 213128

42 31

18

리형은 탈출형에 비해서도 각각 의미 있는 증가를 나타내었다 (p<0.05). 따라서 섬유모세포 성장인자의 발현은 돌출형에서는 큰 증가를 나타내지 않았으나, 돌출형에 비해 탈출형에서는 의 미 있는 증가를 그리고 격리형에서는 탈출형에 비하여 의미 있 는 증가를 보였다(p<0.05).

2.조직학적 관찰

무혈성 조직인 수핵내부에 혈관조직이 분포함이 격리형 탈출 수핵의 H-E 염색에서 관찰되었고(Fig. 3), CD34 면역조직화 학적 염색을 통하여 혈관 내피 세포들이 분포함이 관찰되었다 (Fig. 4). 그러나 대조군 및 돌출형에서는 혈관 내피 세포들을

관찰할 수 없었으며, 탈출형 10예 중 3예, 격리형 10예 종 5예 에서 혈관 내피 세포들은 관찰할 수 있었다.

신생 혈관의 수는 광학 현미경 200배 시야에서 탈출형 3예에 서 평균 25±4.5개, 격리형 5예에서 평균 47±5.5개로 평균치는 격리형에서 높게 나타났으나 통계학적으로 유의하지는 않았다.

고 찰

Saal 등¹⁹⁾은 수핵 탈출시 통증은 phospholipase A2 등에 기 인한 염증 반응이 더 우선한다고 하였으며, 스테로이드의 경막 외 공간에의 주입의 통증 감소 효과를 주장하였다. 또한 탈출된 수핵이 신경주위 섬유화를 일으키지는 않음을 보이며, 보존적 요법의 가능함을 보고하였다. Bozzao 등³⁾ 및 Saal 등¹⁹⁾은 탈출 수핵이 수술을 하지 않아도 재흡수 되는 것을 자기 공명 영상 추시로 발표하면서 수핵 크기가 크게 탈출될수록 재흡수가 빨리 일어난다고 하였다. Yukawa 등²³⁾은 보존적으로 치료하였을 경 우 임상 증상 호전이 1년에 걸쳐 일어나며, 자기 공명 영상 검 사상의 탈출 수핵 크기 감소는 이후에도 지속된다고 보고하였 다. 또한 Komori 등¹²⁾도 임상 증상의 호전이 자기 공명 영상 검사에서의 크기 감소보다 선행되어 나타난다고 보고하였다.

Barbareschi 등²⁾은 종양내 신생 혈관의 연구를 통해 혈관의 형성 자극과 억제 자극이 균형을 이루고 있으며 혈관 신생에 관 여하는 단백질이나 혈관 형성을 억제하는 단백질을 정량 분석하 는 것이 혈관의 신생의 지표로 사용될 수 있다고 하였다. 따라 서 섬유모세포성장인자(b-FGF), 혈관내피세포성장 인자(vas- cular endothelial growth factor, VEGF) 등이나, 자연적 혈 관 내피 형성 억제 인자들의 분석이 신생 혈관의 밀도 분석에 이용될 수 있다고 하였다. 또한 형성된 신생 미세 혈관들이 fac- Fig. 2.The graph illustrates the relative density of b-FGF in differ-

ent types of HNP. Data of control (cont), protruded (pro), extrud- ed (ext), and sequestrated (seq) types are illustrated. The aster- isk denotes a statistically significant (p<0.05) difference between each type of HNP.

600

500

300

200

100

0 cont pro ext seq

b-FGF

Type of HNP Relative expression of b-FGF

*

*

Fig. 3.H-E stain of sequestrated nucleus pulposus tissue. The sample was obtained at the margin of the sequestrated disc.

Capillaries and thin-walled vessels of neovascularization (arrow) are seen infiltrating into the originally avascular nucleus pulposus with chondrocytes and fibroblasts (H-E ×400).

Fig. 4. Light micrograph of the disc tissue from the sequestrated type of HNP illustrating immunostaining for CD34. The specifical- ly stained endothelial cells of neovascularization in the nucleus pulposus are illustrated in red (arrow) (H-E ×400).

tor VIII, CD31 및 CD34 등의 항체의 면역 조직 화학법을 통 해 확인될 수 있다고 하였다. Gomm 등⁸⁾은 섬유모세포성장인 자의 다클론성 항체 및 avidin-biotin peroxidase 연구를 통한 조직 분포 연구에서 이들은 혈관 주위 근상피세포의 기저막 주 변에 존재한다고 발표하였다. 기타 Nanus 등¹⁵⁾은 단클론성 항 체로, Reed 등¹⁸⁾은in situ hybridization의 방법으로 각각 섬유 모세포성장인자의 분포를 증명하였다.

Watanabe 등²¹⁾은 섬유모세포성장인자는 중배엽 및 신경외 배엽 유래 세포에 강력한 유사분열능력 유도능력을 갖고 있으 며, 포유동물군에서 섬유모세포성장인자의 cDNA의 발현은 숙 주 세포의 형질 전환(transformation)을 통해 혈관 조직의 신생 으로 이어진다고 하였다. Minamide 등은 섬유모세포인자를 토 끼의 수핵에 반응시킨 후 경막외공간에 재삽입시킨 결과 대조군 에 비해 증가된 혈관 신생과 염증세포 침착, 그리고 이에 따른 큰 재흡수를 관찰하였다고 발표하였다.

Ikeda 등¹⁰⁾은 탈출 수핵 조직으로부터 세포 침윤, 혈관 신생 그리고 육아 조직들의 염증 반응을 관찰하였으며 이러한 세포들 은 주로 CD68 면역조직화학적 염색을 통해 대포식세포와 소량 의 T-임파구로 구성된다고 발표하였다. 또한 대포식세포 주변 에 collagenase 및 elastase를 ELISA 분석 방법을 통해 관찰하 고 이 효소들이 proteoglycan과 collagen의 분해 작용을 하며 세포 침투가 일어난다고 발표하였다. Ito 등¹¹⁾은 CD68의 면역 조직화학적 염색을 통해, 과립구중 섬유모세포형 방추형의 세포 (spindle-shaped, fibroblast-like cells)는 대부분 대포식세포라 는 것을 발표하였으며, 염증 세포의 침윤은 대포식세포, 과립구, 그리고 임파구 등으로 구성되며, 격리형 탈출 수핵에서 돌출 및 탈출형보다 자주 신생 혈관이 관찰된다고 하였다. 또, 과립구 및 임파구의 분포가 적은 점으로부터 염증의 정도는 강하지 않다고 주장하였다. Doita 등⁷⁾은 탈출된 수핵의 섬유 연골 조직 외연의 육아 조직에서 섬유모세포성장인자 및 anti-interleukin-1, intracellular adhesion molecule-1, lymphocyte function- associated antigen 등의 염증 매개 물질이 관찰됨과, 섬유모세 포인자는 탈출 및 격리형에서 돌출형에 비해 높게 나타나나 탈 출형과 돌출형의 수핵 탈출에서 통계학적 의의는 없다고 하였 다. 그러나 본 연구에서는 탈출형과 돌출형이 통계학적 의의가 있는 차이를 보였다. 또한 섬유모세포인자로 인해 탈출된 수핵 조직에서의 혈관 신생이 촉진될 수 있다는 것을 알 수 있었으며, 다른 저자들이 발표한 탈출형 혹은 격리형에서 자연적인 재흡수 가 돌출형에서 보다 더 많이 일어난다는 주장과 일치하였다.

Matsubara 등¹⁴⁾은 포식 작용과 재흡수 등의 또 다른 기전이 후종인대를 뚫은 탈출 수핵 조직과 연관이 있을 것이라 가정하 였다. Ozaki 등¹⁷⁾은 또한 수핵이 탈출 후 후종인대를 뚫을 경우, 이는 더 강한 혈관 신생 반응에 노출될 수 있다고 보고하였다.

Nohara 등¹⁶⁾은 경막외 공간에서의 임파 순환이 포함되었을 것이 라 하였으며, Ikeda 등¹⁰⁾은 또한 탈출 혹은 격리된 수핵은 포식 작용에 의해 재흡수될 것이라 하였다. 그들은 또한 후종인대를

뚫은 탈출과 뚫지 않은 탈출 모두에서 염증 반응이 일어나는 것 을 보고하며, 탈출된 수핵이 혈류에 노출되면 염증 반응이 일어 났고, 대포식세포의 포식작용이 일어난다고 하였다. Yasuma 등

22)은 증상 발현 이후 2주 이상 경과한 탈출 수핵에서 혈관들이 관찰되므로 혈관 신생의 기간을 2주라 주장하였다. Chitkara⁵⁾는 혈관 신생 유무를 결정 짓는 것은 증상의 기간이며, 1개월 이내 의 증상 기간의 군에서는 12.5%에서, 6개월 이상의 증상의 군에 서는 82%에서 혈관 신생이 관찰되었다고 보고하였다. Ito 등¹¹⁾ 은 35명의 환자 중 30명의 신생 혈관이 관찰된 군의 평균 증상 지속 기간은 45일 이었으며, 나머지 5명의 혈관이 관찰 안된 군 의 평균 증상 지속 기간은 20.6일이라고 보고하였다. 본 연구에 서 비교적 낮은 신생 혈관 발생률을 보인 것은 대부분 조기 수 술로 인해 증상 지속 기간이 평균 9일로 짧았고 이에 따라 신생 혈관이 미처 자라 들어가기 전에 수핵이 제거되었기 때문이라 생각된다.

Yasuma 등²²⁾은 30세 이전의 수핵은 무혈관조직이나, 40세 이후부터는 퇴행성 변화로 인해 수핵 내로의 혈관 침투가 관찰 됨을 사체 조직 연구를 통해 관찰하였다. 따라서 수핵 내부의 혈관은 퇴행성에 기인하며 돌출형의 경우 혈관이 관찰되면 퇴행 성에 기인하였을 가능성이 높다고 하였다. 탈출형은 섬유륜의 외연과 추체와의 연결에 결함이 발생하고 수핵이 이를 통해 노 출된 후 염증 반응이 일어난 것으로 이러한 수핵의 외연에 나타 나는 혈관은 염증반응을 통해 이차적으로 신생된 혈관이라 할 수 있다고 보고하였다. Maigne 등¹³⁾은 돌출형은 섬유륜의 외연 이 경막외 공간과 수핵을 차단시킴으로서 염증반응 및 혈관 침 투로부터 보호된다고 주장하였다.

본 연구에서 섬유모세포인자의 발현은 탈출 및 격리형에서 대 조군보다 높게 나타났다. 또한 격리형 탈출증에서는 섬유모세포 성장인자가 돌출형 및 탈출형에서보다 높게 나타나서, 보다 많 은 혈관 신생을 나타낼 것이라는 것을 알게 되었다. 그러나 돌 출형은 대조군보다 높은 평균치를 보였으나, 통계적으로 의미있 는 범위로는 나타나지 않았으며 이는 섬유륜의 외연이 수핵과 경막외 공간과를 차단함으로써 염증 반응과의 격막 역할을 하였 다고 판단된다. 따라서 염증반응이 탈출형 및 격리형 수핵에서 나타났으며, 유형에 따라 발현의 정도에 차이가 인정된다는 것 을 알 수 있다. 결국 혈관 신생이 수핵의 흡수에 관여하는 중요 한 기전의 하나라는 것을 알 수 있다.

결 론

격리형 수핵에서, 돌출형이나 탈출형에서 보다, 유의하게 많 은 양의 섬유모세포 성장인자가 관찰되었다. 이는 격리형에서 신생 혈관의 성장에 따른 탐식 작용에 의하여 자연 흡수가 더 활발히 일어나며, 무혈성 수핵 조직에 혈관이 침투하여 자연 흡 수에 관여함을 추론케 하였다.

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Purpose :To clarify b-FGF expression in different types of herniated nucleus pulposus (HNP) as angiogenesis marker, and to identify the novel vasculature in avascular nucleus pulposus.

Materials and Methods :Twenty-seven disc specimens removed surgically from patients who underwent discectomy for L4-5 HNP. The control disc specimens were obtained from five patients who underwent surgery for spine fracture or idiopathic scolio- sis. According to MRI and operative findings, HNP was classified into 3 groups; protruded, extruded and sequestrated. The study involved; 7 protruded cases, 10 extruded cases and 10 sequestrated cases. Specimens were analyzed by western quantitative comparisons were performed upon the different bands. H-E stain and immunohistochemistry of CD 34 were performed to identify vessels in the avascular nucleus pulposus.

Results : The expression of b-FGF was not significantly increased in the protruded disc (p>0.05), but was significantly increased in the extruded disc as compared with the protruded disc (p<0.05) and in the sequestrated disc in compared with the extruded disc (p<0.05). Immunohistochemical study revealed novel vasculature at the periphery of the sequestrated disc.

Conclusion :It is possible to confirm that sequestrated HNP is exposed to more vigorous regression via new vessel infiltration into the avascular nucleus pulposus tissue.

Key Words : HNP, Resorption, Sequestrated, b-FGF, Immunohistochemistry

Expression of b-FGF in Different Type of Herniated Nucleus Pulposus

Kee-Yong Ha, M.D., Jae-Hyuk Shin, M.D., and Seung-Hyun Hwang, M.D.

Department of Orthopaedic Surgery, Kang-Nam St. Mary’s Hospital, The Catholic University of Korea, College of Medicine, Seoul, Korea

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