http://dx.doi.org/10.9721/KJFST.2014.46.5.601
601
©The Korean Society of Food Science and Technology
녹색 및 자색 콜라비 착즙액의 항산화 활성
김단비·오지원·이종석·김영현·박인재
1·조주현
1·이옥환*
강원대학교 식품생명공학과, 1(주) 휴럼 중앙연구소
Antioxidant Activities of Green and Purple Kohlrabi Juices
Dan-Bi Kim, Ji-Won Oh, Jong Seok Lee, In-Jae Park1, Ju Hyun Cho1,and Ok-Hwan Lee* Department of Food Science and Biotechnology, Kangwon National University
1Hurum Central Research Institute
Abstract In this study, we investigated the antioxidant activity of green kohlrabi juice (GKJ) and purple kohlrabi juice (PKJ) using various in vitro methods. The results of 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) and 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS) radical scavenging activities, ferric ion reducing antioxidant power (FRAP), reducing power, and nitrite scavenging activities showed that GKJ possessed higher antioxidant activity than PKJ. Green kohlrabi powder (GKJP) and purple kohlrabi powder (PKJP) inhibited hydrogen peroxide-induced cell death in human dermal fibroblasts. In addition, GKJP and PKJP suppressed intracellular reactive oxygen species (ROS) production induced by hydrogen peroxide in human dermal fibroblasts. These results suggest that green and purple kohlrabi juices are potential natural sources of antioxidants.
Keywords: kohlrabi juice, total phenol content, reactive oxygen species scavenging capacity
서
론
최근 산업구조의 고도화로 인한 급속한 사회변화로 생활양식 의 변화, 환경오염이 심화되고 있으며, 현대인들의 삶에 많은 영 향을 미치고 있다. 특히 다양한 정신적, 육체적 병리현상으로 비 만, 당뇨, 뇌혈관 질환, 심장병, 고혈압 등의 만성퇴행성질환의 발 병률이 증가하는 추세이다(1). 만성퇴행성질환의 주요 원인은 생 물의 대사과정 중 생성되는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)으로서 슈퍼옥사이드(superoxide, O2−), 일중항 산소(singlet oxygen, 1O2), 과산화수소(hydrogen peroxide, H2O2) 등이 포함되며 이들은 불안정하고 반응성이 매우 높아서 체내에 과량 존재할 경 우 세포의 주요 구성 성분인 지질, 단백질, DNA 등의 손상을 일 으켜 산화적 스트레스를 유발하게 된다(2,3). 특히 피부에서의 산 화적 스트레스는 중요한 병리적 요소로 알려져 있다. 활성산소는 피부의 면역기능을 억제시키고, 염증을 유발하여 탄력 감소, 주 름 및 기미, 주근깨 등의 각종 피부질환을 유발하고 결국 피부노 화를 가속화 시키는 원인이 된다(4).콜라비(Brassica oleracea var. gongylodes, kohlrabi)는 양귀비목 (Papaveraceae) 배추(Brassicaceae)과에 속하는 저온성 2년생 초 본의 줄기비대 채소로서, 순무양배추 혹은 구경양배추라고 불린 다. 품종은 아시아군과 서유럽군으로 분류되며, 아시아군의 경우 잎의 색깔이 회색을 띤 녹색이고 구경은 녹색으로 표면이 거칠 다. 주요품종인 서유럽군은 구경이 자주색이며 표면이 매끄럽고 흰 납질로 덮여있다. 줄기가 짧고 지상 2-5 cm의 부분에서부터 줄기가 비대해 순무처럼 되는데 이 부분을 식용으로 이용한다 (5,6). 우리나라에서 콜라비의 본격적인 재배가 이루어진 것은 1998년으로 제주도에서 재배 생산되기 시작되어 2013년 현재 전 국적으로 고르게 재배되고 있다. 콜라비는 antocyanin, caro-tenoid(7), vitamin C(8) 및 glucosinolate(9) 등의 영양성분을 풍부 하게 함유하고 있으며 면역력 향상작용, 소염, 냉증, 신경통, 요 통 및 어깨 결림에 효능이 있다고 민간에서 전해지고 있다(10). 또한 암세포에서의 항증식성(11) 및 항균작용(12)에 대한 연구가 보고되고 있다. 항산화 물질(13)은 세포손상을 유발시키는 산화적 스트레스로 부터 인체를 보호하는 역할을 하며, 다양한 식물자원 및 천연소 재로부터 탐색할 수 있다. 천연 유래의 항산화물질의 경우, 합성 항산화제보다 안전성이 높기 때문에 새로운 천연물을 이용한 천 연 항산화제에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다(14). 따라서, 본 연구에서는 녹색 및 자색 콜라비 착즙액의 항산화 효능을 확인하기 위하여 이화학적 특성(pH 및 oBrix), 총 페놀 함
량, 항산화 효능(oxygen radical absorbance capacity (ORAC), DPPH radical 소거능, ABTS radical 소거능, ferric ion reducing antioxidant power (FRAP), reducing power 및 아질산염 소거능을 평가하였고, 피부 섬유아세포(human dermal fibroblast)에서 과산 화 수소에 의하여 발생하는 산화적 스트레스에 대한 세포 보호 효과를 측정하였으며 H2-2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate
(DCFDA)법으로 관찰하였다. *Corresponding author: Ok-Hwan Lee, Department of Food Science
and Biotechnology, Kangwon National University, Chuncheon, Gangwon 200-701, Korea
Tel: 82-33-250-6454 Fax: 82-33-259-5565
E-mail: [email protected]
Received February 14, 2014; revised March 5, 2014; accepted March 13, 2014
재료 및 방법
실험시약Folin & Ciocalteu’s phenol reagent, gallic acid, sodium carbonate, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), sodium phosphate dibasic, 2,2'-azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride (AAPH), Griess reagent, 6-hydroxy-2,5,7,8,-tetramethylchroman-2-carboxylic aicd (Trolox), sodium nitrite, potassium ferricyanide, potassium persul-fate, 2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine (TPTZ), acetic acid, trichloro-acetic acid (TCA), 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS), N-acetyl-L-cysteine (NAC) 및 H2-DCFDA는 Sigma (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였고, Gel/Mount는 Biomeda (Foster City, CA, USA)로부터 구입하였다. Potassium phosphate monobasic, fluorescein (sodium salt)는 Junsei Chemical (Tokyo, Japan)에서 구입하여 사용하였고, 피부 섬유아세포 배양에 사용된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), penicillin-streptomycin (P/S), phosphate-buffered saline (PBS) 및 trypsin-EDTA는 Gibco (Gaithersburg, MD, USA)로부터 구입 하여 사용하였다.
시료 전처리
본 연구에 사용된 제주산 녹색 및 자색 콜라비는 2013년 10월 춘천 소재 대형마트에서 구입하여 사용하였다. 콜라비는 잎을 제 거하고 비대한 줄기부분은 수세한 후, 가식부만 남도록 과피 부 분을 제거하고 착즙기(HU-400, Hurom Co., Seoul, Korea)를 이용 하여 착즙하였다. 콜라비 착즙액의 수율은 착즙액 무게에 대한 콜라비 원물의 무게를 백분율로 계산하였다. 피부 섬유아세포 실 험에 사용된 콜라비 착즙액은 동결건조기(MCFD8508, Ilshin Lab. Co., Seoul, Korea)를 사용하여 완전 건조시켜 분말화하여 −70oC 에서 냉동보관하면서 시료로 사용하였다.
pH 및 oBx측정
녹색 및 자색 콜라비 착즙액의 pH 측정은 pH meter (pH 510, EUTECH, Co., Anyang, Korea)를 이용하여 3회 반복 측정 후 평 균치를 나타내었고, oBx는 각각의 시료를 500 µL씩 취한 다음 당
도계(PAL-α Brix 0-85%, Atago, Tokyo, Japan)를 이용하여 3회 반복 측정하여 평균값을 산출하였다.
총 페놀 함량 측정
녹색 및 자색 콜라비 착즙액의 총 페놀 함량은 Duval과 Shetty (15)의 방법을 이용하여 측정하였다. 각 시료 1 mL에 2% follin-ciocalteau’s phenol regent 1 mL 첨가한 후 10% Na2CO3 용액을 1 mL을 첨가하여 혼합한 후 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이 후, 상등액을 취하여 microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 750 nm에서 흡광도를 측정하였 다. 표준물질은 gallic acid를 이용하였으며, 표준 검량 곡선(y= 17.098x−0.0415, R2=0.9943)으로부터 총 페놀 함량을 계산하였다. Oxygen radical absorbance capacity (ORAC) 측정
녹색 및 자색 콜라비 착즙액의 ORAC 지수 분석에 이용된 시 료 및 표준물질의 희석은 75 mM sodium potassium phosphate buffer (pH 7.4)를 이용하였다. 시료 25 µL와 40 nM fluorescein 150µL를 black 96-well plate에 첨가한 후, 측정 직전에 peroxy radical 생성제인 150 mM AAPH 25 µL를 첨가하였다. Fluores-cence microplate reader (Spectramax GEMINI EM, Molecular
Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 485 nm에서 전자여기 후 535 nm에서 방출되는 조건으로 37oC에서 90분 동안 매 3분
간격으로 fluorescence의 감소율을 분석하였다. 결과 값은 시료 첨 가구와 무 첨가구의 area under curve (AUC) 값을 나타낸 후, Trolox를 이용하여 작성한 표준 검량 곡선(y=0.955x+0.0596, R2= 0.9984)에 대입하여 나타내었다(16).
Area under curve (AUC)=1+f1/f0+f2/f0+f3/f0+f4/f0+...f31/f0
DPPH radical 소거능 측정 DPPH radical 소거능은 Liang 등(17)의 방법을 변형하여 측정 하였다. 시료는 녹색 및 자색 콜라비 착즙액 원액(100%)을 증류 수를 이용하여 50% 및 10%로 희석하여 사용하였으며, 0.2 mL씩 1.5 mL tube에 취하고 ethanol로 용해한 0.4 mM DPPH 용액 0.8 mL을 첨가하여 혼합한 후 상온에서 10분간 반응하였다. 그리고 microplate reader를 이용하여 490 nm에서 흡광도 값을 측정한 후 다음 식(1)에 대입하여 백분율로 나타내었다.
DPPH radical scavenging activity (%)= ×100 (1)
ABTS radical 소거능 측정
ABTS radical 소거능은 Custdio 등(18)의 방법을 변형하여 측 정하였다. 시료는 녹색 및 자색 콜라비 착즙액 원액(100%)을 증 류수로 50%, 25%로 희석하여 이용하였다. 7.4 mM ABTS와 2.6 mM potassium persulfate를 혼합한 후, 암소에서 24시간 방치하여 양이온(ABTS+)을 형성시킨 후, 750 nm에서 흡광도의 값이 1.7 이 하가 되도록 보정하여 ABTS 용액을 제조하였다. 농도별로 희석 된 시료를 20 µL씩 1.5 mL tube에 취하고 ABTS 용액 1 mL을 첨 가하여 30분 동안 반응시킨 다음, microplate reader를 이용하여 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. ABTS radical 소거능은 다음 식(2)에 의하여 값을 백분율로 나타내었다.
ABTS radical scavenging activity (%)= ×100 (2)
FRAP 측정
FRAP은 Biglari 등(19)의 방법을 변형하여 측정하였다. 시료는 DPPH radical 소거능과 동일하게 사용하였다. 0.3 M sodium ace-tate buffer (pH 3.6), 10 mM TPTZ 및 20 mM FeCl3· 6H2O를 제 조하여 실험직전에 10:1:1의 비율로 혼합하여 FRAP 용액을 제조 하였다. 다음 FRAP용액 1.5 mL에 시료 50 µL, 증류수 150 µL를 첨가한 후 37oC에서 4분간 반응시킨 후, microplate reader를 이용
하여 593 nm에서 흡광도를 측정하였다.
Reducing power
Reducing power는 Jayaprakasha 등(20)의 방법을 변형하여 측정 하였다. 농도별로 희석한 녹색 및 자색 콜라비 착즙액 0.5 mL에 0.2 M phosphate buffer (pH 6.6) 및 1% potassium ferricyanide를 각각 2.5 mL씩 첨가하여 혼합한 후 50oC에서 20분간 반응시켰
다. 다음 10% TCA 용액 2.5 mL을 첨가하여 1,790×g에서 10분간 원심분리 후 상등액 2.5 mL을 취하여 증류수 2.5 mL과 ferric chloride 0.5 mL을 첨가하여 혼합한 후 microplate reader를 사용하 여 655 nm에서 흡광도를 측정하였다. 1 AExperiment AControl ---– ⎝ ⎠ ⎛ ⎞ 1 AExperiment AControl ---– ⎝ ⎠ ⎛ ⎞ ⎩ ⎭ ⎨ ⎬ ⎧ ⎫
아질산염 소거능 측정 녹색 및 자색 콜라비 착즙액의 아질산염 소거능 측정은 Kato 등(21)의 방법을 변형하여 사용하였다. 시료 1 mL에 1 mM NaNO2 용액 1 mL을 첨가하고 0.1 N HCl을 이용하여 pH 1.2로 보정한 후, 증류수를 이용하여 총량을 10 mL로 맞춰주었다. 다음 37oC에 서 1시간 동안 반응시킨 후, 반응액 1 mL을 취하여 2% acetic acid 5 mL과 Griess reagent 0.4 mL를 첨가하여 혼합한 뒤 상온에 서 15분간 방치하였다. Microplate reader를 이용하여 520 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 다음 식(3)에 의하여 값을 백분율로 나 타내었다.
Nitrite scavenging activity (%)= ×100 (3)
세포배양
피부 섬유아세포는 강원대학교 생물공학과 Bioprocess Engineer-ing 실험실로부터 분양받아 본 연구실에서 계대배양하여 사용하 였다(22). 피부 섬유아세포는 실험목적에 따라 9well plate 및 6-well plate에 각각 1×106 cells/well 농도로 seeding한 후, FBS (10%) 및 P/S (1%)를 함유한 저농도 포도당 DMEM (89%)에서 배양하였다. 이 때, 콜라비 착즙액 동결 건조물의 효과를 관찰하 기 위하여 음성대조군에는 아무것도 처리하지 않았으며, 양성 대 조군으로는 항산화제인 NAC를 처리하여 비교하였다. XTT assay를 이용한 세포독성 평가 피부 섬유아세포에 대한 콜라비 착즙액 동결 건조물의 세포 독 성평가는 XTT {2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetra-zolium-5-carboxanilide innersalt} assay kit를 이용하여 측정하였다. 세포는 1×106 cells/well 농도로 96-well plate에 seeding하고 24시
간 후에 녹색 및 자색 콜라비 착즙액 동결 건조물을 각각 10-25 µg/mL을 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 그 후 −20oC에 보관
중인 XTT 및 PMS (N-methylphenazonium methyl sulfate) reagent 를 37oC에서 완전히 해동시킨 후, 1 mL의 XTT reagent와 20 µL
PMS reagent를 혼합하여 XTT working solution을 준비하였다. XTT working solution은 40 µL씩 취하여 각각의 well에 첨가한 후, plate를 바닥에 붙인 상태로 가볍게 흔들면서 혼합하였다. 다 음 빛을 차단하고 CO2 incubator에서 4시간 동안 반응한 후, microplate reader를 이용하여 450 nm 흡광도 값에서 690 nm의 흡 광도 값을 뺀 결과 값으로 세포 독성을 계산하였다. 산화적 스트레스에 의한 세포 손상 보호 효과 측정 산화적 스트레스 요인에 의한 세포 손상 보호 효과는 XTT assay를 변형하여 측정하였다. 먼저 피부 섬유아세포를 96-well plate에 seeding하고 녹색 및 자색 콜라비 착즙액 동결 건조물을 10-50µg/mL의 농도로 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 다음 산화적 스트레스를 유발하기 위하여 1 mM hydrogen peroxide를 3시간 동안 세포에 처리하였다. 배양이 끝난 후, 배지를 제거하
고 각 well에 XTT working solution이 20% 포함된 배지를 200 µL씩 첨가하였다. 다음 빛을 차단하고 CO2 incubator에서 4시간 동안 반응한 후, microplate reader를 이용하여 450 nm 흡광도 값 에서 690 nm의 흡광도 값을 뺀 결과 값으로 세포 손상 보호 효 과를 계산하였다. H2-DCFDA assays를 이용한 산화적 스트레스 관찰 산화적 스트레스를 측정하기 위해 H2-DCFDA assay를 이용하
였다. 피부 섬유아세포를 cover slide가 들어가 있는 6-well plate 에 분주하여 24시간 동안 배양한 후, 녹색 및 자색 콜라비 착즙 액 동결 건조물을 각각 10-50 µg/mL을 처리한 다음 1 mM hydro-gen peroxide를 3시간 동안 처리하여 산화적 스트레스를 유도한 후, 멸균된 PBS (pH 7.4)를 이용하여 2회 세척하였다. 다음 3.7% paraformaldehyde 용액 1 mL를 첨가하여 15분간 실온에서 방치한 뒤 제거하였다. 10 µM H2-DCFDA를 처리한 후 빛이 들어가지 않 도록 주의하여 37oC에서 2시간 동안 반응시킨 뒤 멸균된 PBS를 이용하여 2회 세척하였고, Gel/Mount를 이용하여 마운팅 하였다. 그 후, 역상현미경(Leica DM 3000B, Wetzlar, Germany)로 관찰하 였다.
통계분석
총 페놀 함량과 ORAC 지수의 통계적 분석은 Microoffice Excel 2010 (Microsoft Inc., Redmond, WA, USA) t-test를 이용하여 분석 하였으며 항산화 활성, 아질산염 소거능, 세포독성 및 세포 보호 효과 결과값의 통계처리는 SAS version 9.2 (SAS institute Inc., Cary, NC, USA)를 이용하여 분석하였다. 유의성 분석은 ANOVA 검정을 실시하였으며 Duncan의 다중범위 검정법(Duncan’s multiple range test)으로 유의성은 p<0.05 수준에서 검정하였다.
결과 및 고찰
녹색 및 자색 콜라비 착즙액의 이화학적 특성 녹색 및 자색 콜라비 착즙액의 이화학적 특성은 Table 1과 같 다. 녹색 콜라비 착즙액에서는 pH값이 6.90으로 나타났고, 자색 콜라비 착즙액의 pH값은 6.68로 나타났다. oBx는 녹색 콜라비 착 즙액 7.07oBx, 자색 콜라비 착즙액 7.80oBx로 측정되어 자색 콜 라비 착즙액이 당도가 높은 것으로 나타났다. Lopes 등(23)의 연 구결과에 따르면, 적색 양배추 착즙액의 oBx는 5.66oBx로 측정되 었고, 무의 품종별 이화학적 특성을 나타낸 Ryu 등(24)의 연구에 서는 백광이 5.0oBx로 가장 낮았고, 태백이 6.6oBx로 가장 높게 나타났다. 이와 같은 결과는 양배추와 순무를 교배하여 생산한 콜라비가 양배추와 무보다 높은 당도를 지니고 있음을 나타낸다. 녹색 및 자색 콜라비 착즙액의 총 페놀함량 항산화 활성을 나타내는 물질에는 수산기(-OH)를 2개 이상 가 지고 있는 페놀성 화합물들이 다량 함유되어 있다. 페놀성 화합 물의 수산기는 불안정한 전자를 물로 환원하면서 항산화, 항노화 1 AExperiment AControl ---– ⎝ ⎠ ⎛ ⎞Table 1. Juice yield, pH value, and oBx of green and purple kohlrabi juices
Samples Fresh weight (g) Juice yield (%) pH value oBx
Green kohlrabi 906.60 88.01 06.90±0.001) 7.07±0.17
Purple kohlrabi 1048.60 58.23 6.68±0.01 7.80±0.14
및 항비만 등과 같은 다양한 생리작용과 효능을 나타낸다. 녹색 및 자주색 콜라비 착즙액의 총 페놀함량을 측정한 결과, Table 2 와 같이녹색 콜라비 착즙액에서 153.74 mg GAE/mL으로 자색 콜 라비 착즙액(122.55 mg GAE/mL)보다 높은 함량을 나타내었다. Maeda 등(25)의 녹색, 자색 및 흰색 아스파라거스의 항산화 활성 및 폴리페놀함량에 관한 연구에서 welcome 품종(녹색), gijnlim 품종(녹색), purple passion 품종(자색) 및 gijnlim 품종(흰색)의 총 페놀함량을 조사한 결과, 각각 236, 278, 269 및 142 mg quercetin/ kg로 welcome 품종(녹색)의 경우 purple passion 품종(자색)보다 총 페놀함량이 낮았으나, gijnlim 품종(녹색)의 경우는 purple passion 품종(자색)보다 총 페놀함량이 높게 나타났다. 이는 채소 의 색의 영향보다는 품종간의 차이에 따라 페놀함량의 차이가 있 는 것으로 판단되어진다.
한편, 본 연구에서는 총 프로안토시아니딘 함량도 조사하였으 나, 검출한계 이하로 측정 되었다(data not shown). 이와 같은 결 과는 녹색 및 자색 콜라비의 색이 과육이 아닌 과피에 존재하기 때문에 콜라비 착즙액에는 극히 미량이 함유되어 있는 것으로 사 료된다. 녹색 및 자색 콜라비 착즙액의 항산화 활성 ORAC 지수는 식품에 함유되어 있는 플라보노이드, 비타민 C 등의 항산화 성분항산화의 능력을 분석하여 수치화한 것으로서, radical chain reaction의 주요단계인 수소 전자 전달에서 항산화 성분이 AAPH에 의해 생성된 peroxy radical을 소거하는 과정을 분석하는 방법이다(26,27). 녹색 및 자색 콜라비 착즙액의 ORAC 지수를 측정한 결과는 Table 2와 같다. 녹색 콜라비 착즙액에서 572.74µM TE/mL로 나타났으며, 자색 콜라비 착즙액에서는 664.32 µM TE/mL로 나타났다. 이는 Aaby 등(28)의 페놀 성분의 항산화 활성 연구에서 quercetin의 ORAC 지수는 2.7 µM TE/µM으로 나 타났고, DPPH 활성이 3.8 µM TE/µM으로 나타난 반면, catechin 의 경우 ORAC 지수는 3.9 µM TE/µM으로 나타났고, DPPH 활 성은 3.5 µM TE/µM로 나타난 것과 유사하게 자색 콜라비 착즙 액에 존재하는 페놀 성분이 ORAC assay에서 더 민감하게 반응 한 것으로 판단된다. DPPH radical 소거능은 페놀성 화합물, 방향족 아민류 및 아스 코르빈산 등의 항산화 성분이 수소 혹은 전자를 공여하면서 free radical인 DPPH 보라색 화합물이 탈색되는 원리를 이용하는 측 정 방법이다(29). 녹색 및 자색 콜라비 착즙액의 DPPH radical 소
Fig. 1. DPPH radical scavenging activity (A), ABTS radical scavenging activity (B), FRAP (C), and reducing power (D) of green and purple kohlrabi juices. GKJ, green kohlrabi juice; PKJ, purple kohlrabi juice. Each bar represents the mean±SD of triplicate determinations, n=3. a-fMeans in the same column not sharing a common letter are significantly different (p<0.05) by Duncan’s multiple test.
Table 2. Total phenol content and ORAC value of green and purple kohlrabi juices
Samples Total phenol content (mg GAE1)/mL)
ORAC value (µM TE2)/mL)
GKJ5) 153.74±10.683)*4) 572.74±62.29
PKJ6) 122.55±3.600000 664.32±5.110
1)GAE, gallic acid equivalent 2)TE, Trolox equivalent 3)Each value is mean±SD (n=3).
4)*p<0.01 between two groups (Student’s t-test) 5)GKJ: green kohlrabi juice
거능은 Fig. 1(A)에 나타내었다. 녹색 및 자색 콜라비 착즙액을 농도별로 측정한 결과 10, 50% 및 100%의 농도에서 녹색 콜라 비 착즙액은 DPPH radical 소거능이 31, 63, 68%순으로 나타났 고, 자색 콜라비 착즙액에서는 26, 42, 64%로 농도 의존적으로 DPPH radical 소거능이 상승하는 것으로 나타났다. 이는 총 페놀 함량과 유사한 결과로 페놀성 화합물의 수산기가 전자 공여작용 을 함으로써 총 페놀 함량이 높은 녹색 콜라비 착즙액에서 자색 콜라비 착즙액보다 높은 항산화 활성을 나타낸 것으로 판단되어 진다. 유사하게 Wootton-Beard 등(30)의 연구에서도 23종 야채주 스의 항산화 효능 및 총 페놀함량을 조사한 결과, 총 페놀함량이 가장 높았던 비트주스(3025 µg ferulic acid equivalents/mL)에서 DPPH radical 소거능이 가장 높게 측정되었다.
ABTS radical 소거능은 시료 내의 항산화 성분에 의하여 potas-sium persulfate와 ABTS 시약이 반응하여 생성되는 청록색의 ABTS free radical이 탈색되는 원리를 이용하는 방법이다(31). 녹 색 및 자색 콜라비 착즙액의 ABTS radical 소거능은 25-100%에 서 농도 유의적으로 증가하는 결과(Fig. 1B)를 나타내었으며, 녹 색 콜라비 착즙액 100% 농도에서 57%로 가장 높은 항산화 효 능을 보였고, 자색 콜라비 착즙액 100% 농도에서는 ABTS radical 소거능이 38%로 나타났다.
FRAP은 낮은 pH에서 ferric tripyridyltriazine (Fe3+-TPTZ)혼합물 이 수소를 공여하여 free radical이 안정화되면서 ferrous tripyridyl-triazine (Fe2+ TPTZ)로 환원되는 원리를 이용한 방법이다(32). 녹 색 및 자색 콜라비 착즙액의 FRAP은 10-100%에서 농도가 증가 함에 따라 유의적으로 증가하는 것으로 나타났다(Fig. 1C). 착즙 액 100% 농도에서 비교하였을 때, 녹색 콜라비 착즙액의 경우 흡광도 593 nm에서 O.D.값이 1.0으로 측정되었고, 자색 콜라비 착즙액은 0.49로 나타나 녹색 콜라비 착즙액에서 2배 정도 높은 환원력을 나타내었다.
Reducing power는 ferric-ferricyanide (Fe3+)혼합물이 수소를 공여 하여 free radical을 안정화시켜 ferrous-ferricyanide (Fe2+)로 전환
되는 환원력을 측정하는 방법(33)으로 측정한 결과는 Fig. 1D와 같다. 농도별로 녹색 및 자색 콜라비 착즙액의 환원력을 측정한 결과 농도가 높아짐에 따라 활성이 증가하는 경향을 보였으며, 녹색 콜라비 착즙액의 경우 흡광도 655 nm에서 O.D.값이 0.3으 로 나타난 반면 자색 콜라비 착즙액은 0.18로 나타났다. 이와 같 은 결과는 Carillon 등(34)의 항산화 실험에서 시료의 농도에 따 라 항산화 효능이 상승하는 것과 일치하는 결과이다. 녹색 및 자색 콜라비 착즙액의 아질산염 소거능 아질산염은 식육제품 및 수산물의 가공, 저장과정 중에 발색제 및 보존제로 이용되고 있으며, 식품 중에 존재하는 아민류와 반 응하여 발암물질인 nitrosoamine을 생성하고 과량 섭취 시 meth-emoglobin증과 같은 각종 중독증상을 유발한다(35). 녹색 및 자색 콜라비 착즙액의 아질산염 소거능을 측정한 결과 Fig. 2와 같이 녹색 콜라비 착즙액 100%에서 59%로 가장 높게 측정되었고, 자 색 콜라비 착즙액에서는 45%로 나타났으며, 농도 유의적으로 아 질산염 소거능이 증가하는 경향을 나타내었다. 본 실험에 사용된 pH 1.2 조건은 인체의 위내 pH 조건과 유사한 것으로 녹색 콜 라비 착즙액이 생체 내에서도 우수한 아질산염 소거작용을 통하 여 nitrosoamine의 생성을 억제할 것으로 사료된다. 녹색 및 자색 콜라비 착즙액 동결 건조물의 세포독성 평가 피부는 일상생활 속에서 항상 산소와 접촉하고 자외선에 노출 됨으로써 활성산소종에 의한 피부 노화 촉진과 세포 내 산화 손 상 및 대사활성의 감소를 유도한다. 직접적인 과산화수소, UV 등 과 같은 자극원은 세포의 apoptosis 유발시키고, ROS 발현량을 더욱 증가시킨다고 알려져 있다(36). 콜라비 착즙액이 피부 섬유 아세포의 세포독성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 녹색 및 자 색의 콜라비 착즙액을 농도별로 처리하고 XTT assay 방법으로 세포의 생존율을 측정한 결과(Fig. 3), 10-50 µg/mL에서 독성을 나 타내지 않았다. 따라서 본 연구에서는, 녹색 및 자색 콜라비 착 즙액의 세포 보호 효과 및 항산화 활성을 측정하기 위하여 10-50µg/mL 농도를 이용하여 실험을 진행하였다.
Fig. 2. Nitrite scavenging ability of green and purple kohlrabi juices. GKJ, green kohlrabi juice; PKJ, purple kohlrabi juice. Each bar represents the mean±SD of triplicate determinations, n=3.
a-eMeans in the same column not sharing a common letter are
significantly different (p<0.05) by Duncan’s multiple test.
Fig. 3. Effect of green and purple kohlrabi juice powders on cell viability. Cell viability was measured by XTT assay. Cells were seeded in 96-well plates at a density of 1×106 cells/well in DMEM/ FBS medium and kohlrabi incubated for 24 h prior to treatment at 37oC in 5% CO2. CON, non-treated control group; GKJP, green kohlrabi juice powder pre-treated; PKJP, purple kohlrabi juice powder pre-treated group. Each value is the mean±SD of the results from five different plates (n=5) and is representative of results from at least two different experiments. a-bMeans in the same column not sharing a common letter are significantly different (p<0.05) by Duncan’s multiple test.
Hydrogen peroxide로 유도된 세포 손상에 대한 세포 보호 효과 콜라비 착즙액이 hydrogen peroxide로 유도한 산화적 스트레스 상태에서 피부 섬유아세포의 생존율에 미치는 영향을 XTT assay 로 측정한 결과는 Fig. 4와 같다. 피부 섬유아세포는 1 mM hydro-gen peroxide를 처리함으로써 처리하지 않은 군보다 유의적으로 50% 정도로 생존율이 감소한 반면, 콜라비 착즙액 전처리 군에 서는 농도 의존적으로 산화적 스트레스 영향에 반하여 세포 생 존율이 다시 증가함을 확인하였다. 특히 녹색 콜라비 착즙액 50 µg/mL의 농도에서 양성대조군인 NAC 5 mM 수준까지 세포를 보 호하는 효과를 나타내었으며, 자색 콜라비 착즙액 50 µg/mL에서 도 세포 생존율이 70% 정도로 생존율이 증가하는 경향을 나타 내었다. 이는 Phan 등(37)의 연구에서 페놀성 물질이 세포 보호 효과에 영향을 미친다는 것과 유사한 결과로 총 페놀함량이 더 많았던 녹색 콜라비 착즙액에서 자색 콜라비 착즙액 보다 높은 세포 보호 효과를 나타낸 것으로 사료된다. H2-DCFDA 염색을 통한 형광현미경 분석 콜라비 착즙액 동결건조물의 ROS생성 억제 효과를 평가하기 위하여 H2-DCFDA염색을 통하여 현미경 관찰을 하였다(Fig. 5). Hydrogen peroxide를 처리한 음성 대조군과 콜라비 착즙액 처리 군을 비교하였을 때, 농도 의존적으로 ROS 생성 억제효과를 나 타내었다. 이와 같은 결과는 Bae 등(38)의 연구에서 차가버섯을 처리한 군에서 농도 의존적으로 세포 보호 효과가 증가하였으며, ROS 생성 억제 효과도 증가하는 것과 일치하는 결과이다. 이상 의 결과에 의해 콜라비 착즙액의 다양한 항산화 활성 및 아질산 염 소거능에서 효능을 나타내고 있으며, 피부 섬유아세포에서 세 Fig. 4. Protective effects of green and purple kohlrabi juice
powders against oxidative stress-induced damage in human dermal fibroblast. Cells were seeded in 96-well plates, then green kohlrabi and purple kohlrabi were pre-treated for 24 h and hydrogen peroxide was treated for another 3 h. CON, non-treated control group; H2O2, hydrogen peroxide treated group; NAC+H2O2, NAC pre-treated and hydrogen peroxide treated group; GKJP+H2O2, green kohlrabi juice powder pre-treated and hydrogen peroxide treated group; PKJP+H2O2, purple kohlrabi juice powder pre-treated and hydrogen peroxide treated group. Each value is the mean±SD of the results from five different plates (n=5) and is representative of results from at least two different experiments. a-eMeans in the same column not sharing a common letter are significantly different (p<0.05) by Duncan's multiple test.
Fig. 5. Fluorescence microscopy images of cells stained for ROS. Confluent cells were incubated with green kohlrabi and purple kohlrabi for 24 h prior to exposure to 1 mM hydrogen peroxide for 3 h. ROS production was detected by DCFDA staining. Representative fluorescent images of no hydrogen peroxide controls and hydrogen peroxide-treated cells were obtained using a fluorescence microscopy. Magnification: 50. CON, non-treated control group; H2O2, hydrogen peroxide treated group; NAC+H2O2, NAC pre-treated and hydrogen peroxide treated group; GKJP+H2O2, green kohlrabi juice powder pre-treated and hydrogen peroxide treated group; PKJP+H2O2, purple kohlrabi juice powder pre-treated and hydrogen peroxide treated group.
포 보호 효과 및 ROS 생성 억제 효과가 우수함을 확인하였다. 따라서 콜라비 착즙액은 산화적 스트레스에 대한 세포 손상의 보 호제 및 천연 항산화제로서 응용가능성이 있다고 사료되며, 향후 추가적인 항산화 작용기전 연구를 통하여 식품이나 의약품, 화장 품 등 다양한 분야에서 활용가능성이 기대된다.
요
약
본 연구에서는 녹색 및 자색 콜라비 착즙액의 이화학적 특성 (pH 및 oBx), 총 페놀함량, 항산화 활성(ORAC 지수, DPPH rad-ical 소거능, ABTS radical 소거능, FRAP 및 reducing power), 아 질산염 소거능, 피부 섬유아세포에서의 세포 보호 효과 및 ROS 생성억제 효과를 측정하였다. 총 페놀 함량은 녹색 콜라비 착즙 액(153.74 mg GAE/mL)에서 자색 콜라비 착즙액(122.55 mg GAE/ mL)보다 더 높게 나타난 반면, ORAC 지수의 경우 자색 콜라비 착즙액(664.32 µM TE/mL)에서 녹색 콜라비 착즙액(572.74 µM TE/mL)보다 더 높게 나타났다. DPPH radical 소거능, ABTS rad-ical 소거능, FRAP 및 reducing power에서는 콜라비 착즙액 10, 50, 100% 농도에서 농도 의존적으로 항산화 활성이 증가하는 경 향을 나타내었으며, 같은 농도로 비교하였을 때, 녹색 콜라비 착 즙액에서 자색 콜라비 착즙액보다 높은 항산화 활성을 보였다. 아질산염 소거능에서도 녹색 콜라비 착즙액이 자색 콜라비 착즙 액보다 높은 효능을 나타내었다. 피부 섬유아세포에서는 녹색 및 자색 콜라비 착즙액을 동결 건조하여 사용하였으며 10, 25, 50 µg/mL의 농도에서 독성을 나타내지 않았다. Hydrogen peroxide로 산화적 스트레스를 유도한 상태에서 세포 보호 효과를 측정한 결 과 10 µg/mL의 농도에서는 녹색 및 자색 콜라비 착즙액에서 hydrogen peroxide를 처리한 군과 차이를 나타내지 않았으나, 25, 50µg/mL의 농도에서는 농도 유의적으로 세포보효효과가 증가하 였다. 또한 녹색 콜라비 착즙액에서는 양성대조군으로 사용한 항 산화 물질인 NAC 수준까지 세포생존율이 증가하였다. H2-DCFDA 염색을 통하여 관찰한 ROS 생성 억제 효과는 세포 보호 효과와 유사한 경향으로 관찰되었다. 이상의 결과를 종합하여 볼 때 녹 색 및 자색 콜라비 착즙액이 다양한 항산화 모델에서 효능을 나 타내었으며, 피부 섬유아세포에서 세포 보호 효과 및 ROS 생성 억제효과가 관찰되어 기능성 식품원료로서의 활용도가 매우 넓 을 것으로 판단된다.감사의 글
본 연구는 지식경제부 광역경제권 선도산업 육성사업과제 (C1009004-01-02) 및 2013년도 강원대학교 학술연구조성비 (C1009939-01-01)로 수행한 연구의 일부로 이에 감사드립니다.References
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