1. 개요
□ 연구목적
○ 경기과학고등학교의 국제교류 프로그램 일환으로 싱가폴 영재학교 와 교류 프로그램에 참가하기로 계획되었던 학생들은 4월에 있었던 세월호 사건과 맞물려 싱가폴 방문 계획 및 교류 활동이 모두 취소되 었다. 당시 항구 도시인 싱가폴과 공동으로 한국의 상황과 싱가폴 상황에서 비교 연구가 가능한 주제를 탐색하고 있었던 학생들은 처음 엔 기름 유출 오염에 대한 방제 등에 대한 공통 주제를 생각하고 있었지만 계획이 취소되고 나자 실망하여 연구 활동을 시작조차 못하 고 있었다. 그러던 중 우연한 기회에 한 학생이 난분해성 물질인 PAH(Polycyclic aromatic hydrocarbons) 분해와 관련하여 자료를 다 른 친구들과 공유하였고, 또한 STEAM R&E 공고 계획을 알게 되어 자연스럽게 STEAM R&E 활동으로 이어질 수 있었다.
기름 유출과 같은 석유 화학물질에 의한 오염 발생 시 많은 경우 겉으로 보이는 정도에 따라 오염의 정도를 파악하고 방제의 수준을 결정하기 쉽다. 하지만 오염물질이 분해되면서 생성되는 난분해성 물질은 그 양이 점차로 증가하면서 보이지 않은 더 심각한 2차 피해를 유발하는 경우가 많다. 본 연구는 난분해성 물질 중에 2개 이상의 벤젠고리가 중합된 방향족 탄화수소(PAH)의 생물학적 분해에 초점 을 맞추어 연구를 진행하였다. 초기의 실험 목표는 1) 오랫동안 유류 등에 의해 오염된 토양 또는 해양으로부터 PAH를 전환 또는 분해시 킬 수 있는 미생물의 탐색과, 2) 발견된 PAH 분해능이 우수한 균주를 실제 오염된 환경에 적용할 수 있기 위한 방안을 제시하는 것으로 하여 연구를 진행하였으나 채집한 토양 샘플로부터 많은 종류의 미생 물들을 분리하고, 그 미생물들 중 PAH 분해능이 있는 균주를 테스트 하여 선별하고, 선별된 균주의 적용방안까지의 연구를 수행하기에는 익숙하지 않은 학생들이 감당하기에 예상보다 균의 분리와 관리에 많은 시간이 소요되었다. 분리된 많은 균주들 중 효과적인 PAH
분해 균주를 찾아내는 과정이 생각만큼 쉬운 과정이 아니었을 뿐 아니라 학생들이 신체에 유해한 PAH를 다뤄야하기 때문에 적절한 실험환경과 실험 장치에 대한 대책이 필요하였다. 더욱이 실험에 사용하고 있는 시료로부터 PAH 분해 균주를 선발하지 못할 가능성 도 있었다. 따라서 중간평가로부터의 의견과 자문교수의 자문을 통 해, 본 연구의 연구방향을 균주를 선발 과정을 위한 효율적인 시스템 을 구안하는 것으로 전환하였다.
실험 과정 중 가장 시간과 노력이 많이 드는 부분은 균주의 선발 과정이다. 권태형 외(2010)의 ‘다환 방향족 탄화수소(PAH) 분해 미생 물 탐색을 위한 승화법의 개발’에서 보면 상용휘발유 및 태안 유류 유출지 시료로부터 350 종류 이상의 균주를 분리하고 각 균주에 대한 pyrene, naphthalene 및 phenanthrene을 테스트한 결과 단일 PAH 또는 복수의 PAH 분해하는 7균주를 분리하였다[1]. 본 실험의 초기 에도 약 150개의 균주가 분리되어 그 균들을 보관, 관찰하는데 많은 시간이 걸렸다. 초기에 분리된 균주 수가 많은 수록 그 균들을 순수 배양하고 각 균주의 특성을 테스트하는 과정에 많은 비용과 노력이 들어간다. 균주 분리 과정의 효율을 높이기 위해 기존의 실험방법들 은 액체 배지의 경우 액상의 배지에 naphthalene 또는 phenanthrene 과 같은 PAH를 직접 첨가 후 진탕 배양하거나, 고체 배지의 경우 한천의 가장자리에 구멍을 만들어 PAH를 직접 얹어 주고 페트리접 시를 밀봉함으로써 페트리접시 내 PAH가 기체 상태로 공급되도록 하고 있다[2]. 하지만 물에 대한 용해도가 극히 낮은 PAH의 특성을 고려할 때 이러한 접근 방법의 효율성은 의심스럽다(naphthalene 용해도, × (mol/L); phenanthrene 용해도, × (mol/L); pyrene 용해도, × (mol/L))[3]. Edwards
et.
al.
(1991)에서는 4종의 비이온성 계면활성제들에 대한 naphthalene, phenanthrene, pyrene의 용해성을 조사하였으며, PAH가 용해 정도 가 미셀을 구성하는 계면활성제의 농도에 따라 달라짐을 보였다[3].즉, 계면활성제의 성질과 양에 따라 각 PAH 성분을 용해시키는 정도 가 달라질 수 있음을 의미한다. 또한 아세톤 또는 에탄올 등의 유기용 매의 경우 많은 양의 PAH를 녹여낼 수 있으나 이들 용매 자체가 미생물에게 독성으로 작용할 수 있어 사용에 제한이 따른다. 따라서 본 연구에서는 미생물에 대한 독성이 적은 천연 계면활성제를 이용하 여 PAH를 배지에 첨가할 수 있는 방법을 탐색함으로써 PAH 분해균 분리 과정의 효율성을 높이고자 하였다. 이러한 기능을 가진 미생물 배양 배지의 제작은 PAH의 분해능을 가진 균주의 선별 과정을 단순 화시킴으로써 PAH의 분해 균주 탐색 과정에서 효율을 높일 수 있을 것으로 생각된다.
□ 연구범위
○ 연구 분야 및 범위
- 난분해성물질인 PAH는 물에 대한 용해도가 낮고 유기물이나 미립자 에 대한 흡착도가 높아 육상 및 해양 퇴적물에 분해가 잘 되지 않은 상태로서 높은 농도로 축적되어 존재한다. 생물학적인 방제를 위하여 미생물을 탐색하는 과정에서 많은 노력과 비용이 발생하는 바, 실험과 정을 효율적으로 제어하기 위한 방법을 탐색하였다.
○ 진행 단계
- 실험 과정 중 균주 선발 단계는 가장 시간과 비율이 많이 드는 과정이 다. 따라서 이 과정에서의 효율성을 높이기 위해 본 연구에서는 PAH 를 배양 배지에 녹일 수 있는 계면활성제를 탐색하였으며, 특히 사용 한 계면활성제 자체가 균의 생장에 저해가 되지 않도록 천연물 계면활 성제를 테스트해 봄으로써 그 중 가장 효과가 높은 물질을 선발하는 과정까지의 실험을 진행하였다.
2. 연구 수행 내용
□ 이론적 배경 및 선행 연구
○ 최근 다환방향족탄화수소(PAH)에 대한 연구를 보면 그 분포가 유류
오염 지역[2]뿐 아니라 공단지역[3], 심지어 대도시 시내토양[5]에서 도 쉽게 고농도로 축적되어 보고되었다. 이것은 PAH가, 기름의 유출 과 같은 대형 사고는 물론이고 쓰레기 소각, 주행 차량, 아스팔트 제조 등, 산업용 보일러 숯불구이 등에서도 쉽게 발생되기 때문이다.
PAH의 분포는 물과 대기, 물과 퇴적물, 물과 생물 간의 분배 (partitioning)에 따라 나타난다. 유기용매와 분배계수가 물에 대한 분배계수보다 크기 때문에 퇴적물이나 토양, 생물상의 유기성분에 대한 친화도가 크다. 따라서 PAH는 육상 및 해양 퇴적물에 분해가 잘 되지 않은 상태로서 높은 농도로 축적되어 존재한다. 뿐만 아니라 PAH에 오염된 물이나 퇴적물에 서식하는 생물체 및 그들의 먹이에 쉽게 축적된다[6]. PAH는 높은 농도로 축적될 때, 건강상 유해한 물질이며, 암을 유발할 수 있는 성분이기도 하다. PAH는 세포의 지질 및 물에 구획을 갖고 침투 확산을 통해 폐에 도달할 수 있는 지질화합물로 PAH 또는 그 대사체는 혈액을 통해 조직으로 쉽게 분배된다. 특히, PAH 분해과정에서 생성되는 중간 물질인 diol epoxide는 단백질, DNA, RNA 등과 같이 세포 내 거대분자들과 상호 작용하여 세포독성, 세포돌연변이, 종양등을 유발할 수 있음이 알려져 있다[6]. 이에 1995년 이래로 미국 환경청(US Environmental Protection Agency, EPA)은 발암성에 근거하여 16종의 PAH를 정의 하였고 우리 나라 역시 PAH의 심각성을 점차 인식하여 중앙경험교환 위원회(ZEK)가 제정한 ZEK 01-08에 따라 2008년 4월 1일부터 PAH 테스트를 GS 마크 인증에 의무적으로 적용되도록 하고 제정하고 있다[6].
초기에 PAH 방제는 이를 물리적·화학적인 방법으로 제거하고자 하는 시도가 있었으나 토양입자 등에 강하게 흡착되어 있고 대부분 오염된 지역이 광범위하고 제거를 위해 사용되는 물질에 의한 2차 피해가 우려되는 등의 문제점으로 인해 생물학적 방제 방법을 모색해 가고 있다. 특히 자연환경 내에서 특정 미생물이 PAH의 전환과 분해 에 중요한 역할을 하는 것이 알려지게 됨에 따라 PAH를 분해하는
미생물의 탐색 및 이를 활용하고자 하는 노력들이 많이 시도되고 있다[7-10]. 또한 여러 종류의 PAH를 통합적으로 분해하고자 복합 균주를 이용하여 PAH를 분해하는 생물학적 정화(bioremediation) 가 많이 연구되고 있다[11].
□ 연구주제의 선정
○ 학생들과 함께 여러 차례 기름 유출로 인한 해양 생태계의 파괴에 관하여 토의가 진행되던 중 한 학생이 난분해성 석유 화학물질은 PAH에 대한 의견을 제시하였다. 생소했던 PAH라는 용어를 새롭게 알아가면서 학생들은 이 물질의 위험성에 대하여 인식하기 시작하였 고 특히, 오염이 지속적으로 축적될 지역인 인천, 여수, 부산 등 해양의 항만지역에서는 심각한 피해가 예상됨에도 불구하고 기름 유출 사고 가 발생할 당시에만 잠깐 단기적 관심이 집중되고 다시 시들해 지는 것에 대한 걱정을 표출하였다. 과학기술이 인간 생활의 유용한 방법 을 모색하는 기술 발전에만 사용되는 것이 아니라 이제 조금 더 인간 의 생존에 위협이 될 수 있는 환경 문제를 해결해 가는 첨병으로서 기능해야 한다는 생각을 하게 되면서 학생들은 자발적으로 본 연구에 대한 스스로의 의미를 부여하게 된 것 같다. 특히, 학생들은 비록 직접 교류를 통한 연구활동을 진행하지는 못했지만 경기과학고의 자매 학교인 싱가폴 영재학교의 학생들과 e-mail 등을 통해 관심 내용 을 주고받는 등 적극적인 관심을 보여주고 있으며, 경북해양 바이오 산업연구원(http://www.gimb.or.kr/)에 PAH 관련 선행연구를 문 의하고 관련분야의 선행연구를 탐색하는 등 학생들에게 생소한 새로 운 분야에 대한 정보를 모으고 PAH 방제에 대하여 의미 있는 결과를 얻어 우리 세상에 도움이 될 수 있기를 희망하며 연구를 진행하였다.
□ 연구 방법
○ 미생물 배양과 선별에 관련된 실험방법은 경기대학교 이진성 교수님 의 자문을 받아 수행하였고, 본교의 R&E 활동을 통해 기본적인 멸균
과 배지 제작법은 사전에 학생들이 알고 있어 자발적인 수행이 가능하 였다.
○ 해양 미생물 배양을 위한 배지와 승화장치 제작에 필요한 자문은 경북해양 바이오산업연구원의 자문을 얻어 실험하였다.
○ 본 연구에 있어 가장 중요한 부분인 천연물 계면활성제를 사용하여 PAH를 배지에 포함시킬 수 있는 방안에 대한 탐구는 순수하게 학생 들의 아이디어로 이루어진 것이며, 이 아이디어를 구안하기까지 미생 물의 배양에서부터 각 실험 단계마다의 시행착오에 기반하여 효율적 으로 방법을 개선시키고자 하였다.
□ 연구 활동 및 과정
○ 월별 추진실적
주요 활동 시기 예산사용(원)
오염 지역의 탐사 및 토양 샘플 채집 14.05 0
전문가 자문 14.05 0
채집 토양으로부터 미생물 분리 14.05 ~ 14.08 1,126,353 미생물 선별을 위한 승화장치 제작 시도 14.07 ~ 14.08 579,000 미생물의 PAH 분해능 평가 14.06~14.08 324,340
전문가 자문 14.08 0
연구방향 재설정 논의 14.09 33,800
활용 가능한 계면활성제 탐색 14.10 117,320
계면활성제를 이용한 PAH 용해도 테스트 14.10~14.11 359,420 계면활성제가 포함된 배지를 활용한 균 선별 14.12 0
전문가 자문 및 보고서 작성 14.12 38,500
○ 초기의 연구문제는 PAH 분해능이 우수한 균주를 선별하여 이를 활용할 수 있는 방향을 제시하고자 하였으나, 균주의 분리와 배양에 예상했던 것보다 훨씬 많은 시간과 노력이 들었다. 또한 이렇게 분리 된 많은 균들을 기존의 방법을 이용하여 한 개씩 테스트 하기란 처음 경험하는 학생들에게 큰 부담이 아닐 수 없었다.
○ 중간평가를 진행하면서 자문평가 위원의 자문을 받아 효율적으로 균주를 분리하고 테스트 하는 것으로 연구의 범위를 현실화 하였다. 학생들과 지금까지 수행한 과정을 짚어보면서 실험 과정 중 효율적으 로 개선할 수 있는 과정에 대하여 토의하였고, 균주의 분리와 선발 과정에서 초기의 테스트할 균 수를 줄이기 위해 계면활성제를 이용하 여 PAH를 배지에 포함시키는 방안을 생각해 보았다.
○ 유류 오염 토양 샘플 채취
적합한 장소 모색을 위해 학생들과 미군 유류보관 장소로 오랫동안 사용된 인천 문학산 일대의 오염 사례를 찾아 문학산 군부대 일대와 지하철 공사 현장과 인천항주변 등 여러 장소를 학생들과 돌아보면서 토의하였다. 토양 샘플은 인천 남항유선 승선장(북위 37도 27‘09 동경 126도 36’36)에서 채취하였다[그림1]. 인천항의 물류 수송을 위해 수시 로 배가 드나드는 곳이면서도 선착장의 사면이 ㄷ자 모양으로 막혀있 어 물 흐름과 파도가 적었다. 따라서 오랫동안의 물류작업 과정과 배들로부터 유출된 기름때가 주변 항구 주변의 토양에 축적되었을 것으로 예상되었으며, 실제로 토양을 들추었을 때, 검은색 띠와 오염 의 악취가 심했다. 항구 주변으로 제방 형태의 돌이 쌓여 있었으며, 돌 틈 사이에 적었지만 토양이 남아 있었다. 돌들과 토양은 기름때가 끼어 검은색을 띄고 있었고, 그런 가운데도 약간의 게와 갯강구 등의 생물들이 살고 있었다. 채집은 항구의 수면으로부터 3m 이내로 근접 한 안쪽사면에서 7~8m 간격으로 3개의 지점을 선정하였다. 각 지점의 토양이 젖어 있음을 통해 만조 시 물이 차는 지점임을 확인하였다. 각 지점에서 상부 토양을 약 3cm가량 걷어 낸 후 그 아래 부분의 토양을 채취하였다. 채집은 미리 준비해둔 멸균된 50mL 튜브에 담아 밀봉 후 실험실로 운반하였다. 실험실에 운반 즉시, 경북 해양 바이오 산업연구원의 조언을 받고 미리 준비해 둔 marine 배지(Difco™ Marine Agar 2216)에 희석법을 이용하여 순차적으로 도말하였다.
남은 시료는 –20°C 냉장보관 하였다(2014. 5월 말).
그림 1. 토양 샘플 채집지점: 남항유선 승선장(북위37 도27'09 동경 126도 36'36)
<토양 샘플 채집 사진>
○ 균주 분리
Marine 배지를 통해 콜로니 색깔과 크기가 다양한 많은 종류의 균이 출현하였다(그림4). 각 콜로니를 새로운 배지에 2~3차례 분주 배양하여 순수한 단일 균주 150여 종류를 수집하였다. 각 균주들은 그람염색을 통해 염색 성질과 형태적 특성을 관찰하였다(2014. ~7월 말).
그림 2. PAH 분해 균주 선별을 위한 장치 실험설계
○ 실험 주제의 변경
PAH 분해능의 효과적인 측정을 위해 권태형 외 (2010)를 참조하여 승화, 분무 실험장치를 고안하고 각 균주의 분해능을 측정하고자 계 획하였다(그림2). 하지만, 발암성이 있는 유해한 PAH를 효과적으로 도말하기 위한 안전관리 장치 구성 및 많은 균을 효율적으로 처리할 수 있는 방안을 모색하는 과정에서 많은 시행착오를 겪었다. 학생들 과 수차례 토의과정을 통해서, 초기에 샘플로부터 균을 분리하는 과 정부터 PAH 분해능을 가진 균주만을 선별적으로 찾아낼 수 있다면 굳이 승화실험 장비의 사용이 불필요할 것일 수 있음을 인지하였다. 승화장치를 사용하지 않는다면 또한 실험과정에서 겪어야 하는 불편 함과 유해성을 줄일 수 있을 것으로 판단하였다. 초기에 PAH 분리균 을 선별적으로 찾아낸다면 그 이후엔 HPLC 와 GC/MS 등의 분석 장비를 활용하여 각 균주의 PAH 분해 능력을 정량적으로 비교해 갈 수 있을 것이다[4,5,12]. 따라서 그 이후에는 초기부터PAH를 배지 에 포함시킬 수 있는 방안에 대하여 집중하여 연구를 수행하였다.
○ 나프탈렌(PAH)을 배지에 최대한 용해시키는 계면활성제 선별 소수성인 PAH를 물을 용매로 한 배지에 녹이기 위해 계면활성제를 필요로 하였다. 아세톤, 톨루엔 등 유기 용매는 PAH를 잘 녹여낼 것이지만 이들 용매들은 그 자체가 미생물의 생육에 영향을 줄 수 있기 때문에 균 선별을 위해 적합하지 못하다고 판단하였다. 따라서 실험은 1) ‘PAH를 배지에 잘 섞이도록 할 것’ 과 2) ‘사용하는 계면활
성제 자체가 균 생장에 미치는 영향이 적을 것’ 의 두 가지 측면에서 우수한 계면활성제의 탐구하였다. 실험에 사용한 PAH로는 나프탈렌 을 사용하였고(그림3), 주변에서 쉽게 구할 수 있으며 미생물에 대한 영향이 적을 것으로 예상되는 천연물 계면활성제 8종(표1의 7종과 레시틴)을 대상으로 본 연구의 목적에 최적인 계면활성제를 조사하였 다.
그림 3. 나프탈렌 구조
○ 계면활성제 포함 배지의 PAH 균주 분리 능력 검증
나프탈렌 입자를 가능한 작고 균질하게 녹는 조건에서 동일하게 실험 을 수행하기 위하여 나프탈렌을 직접 계면활성제가 섞여진 물에 넣지 않고, 먼저 아세톤-나프탈렌 포화용액을 제작하였다. 상온에서 아세 톤은 나프탈렌을 35%까지 녹여내었으며, 이 포화용액을 물에 넣을 때, 나프탈렌이 다시 석출되었다. 따라서 계면활성제에 의해 나프탈 렌이 녹을 경우 석출량이 줄어드는 것을 통해 최대한 나프탈렌을 녹여내는 배지를 선별할 수 있을 것으로 생각하였다. 물에 잘 녹지 않은 물성을 지닌 레시틴을 제외한 다른 7가지에 대하여 각 계면활성 제가 포함된 용액을 아래와 같이 준비하였다(표1). 아세톤-나프탈렌 포화용액(35%) 10 mL를 각 계면활성제 용액 50 mL에 넣고, 상온에서 1시간 동안 교반기를 이용하여 (150 rpm) 녹인 후 석출된 나프탈렌이 가장 적은 용액을 선택하였다.
표1. 사용한 각 계면활성제의 농도 계면활성제 계면활성제의 제조 방법
쌀뜬물 쌀 100g을 증류수 60mL에 2차례 세척 후 사용 EM 발효액 구입한 EM발효액을 증류수에 10배 희석 후 사용 코코넛 기름 구입한 원액을 100배 희석하여 사용
어성초 비누 비누 2g를 증류수 200mL에 풀어준 후 사용 율피오일 비누 비누 2g를 증류수 200mL에 풀어준 후 사용 Tween-80 증류수로 10배 희석하여 사용
알로에 안쪽 겔 성분을 추출 후 증류수로 5개 희석하여 사용
○ 선별된 균주들의 PAH 분해능 확인
위 단계에서 나프탈렌을 녹여내는 데 효과가 우수한 계면활성제 용액 2가지 (쌀뜬물과 tween 80 용액)를 이용하여 직접 PAH(나프탈렌)이 포함된 배지를 제작하였다. 나프탈렌 가루 1.6 g을 계면활성제가 포함 된 marine 배지 200 mL에 넣은 후 교반기를 이용하여 상온에서 24시 간 동안 섞어주었다. 그 후 일반 배지 제작 과정과 같이 멸균 후(15min at 121°C) 페트리접시(∅90)에 부어 굳혔다. 2005 광량 지역에서 원유 성분 분해 균주로 선발된
Kordiimonas gwangyangenesis
(KCTC 22491) 을 대조군으로 사용한다면 제작된 계면활성제 배지의 선별 효과를 확인할 수 있을 것으로 판단하여 으로 희석한 오염 토양 샘플에K. gwangyangenesis
를 희석하여 포함한 후 두 종류의 PAH-계면활성 제 배지와 그 두가지를 혼합한 배지(쌀뜬물, S; tween 80, T; 쌀뜬물 +tween 80, S+T)에 각각 도말하였다. 대조군으로 계면활성제 및 PAH 가 포함되지 않은 marine배지를 사용하였다. 항온기(30°C)에서 48시 간 동안 배양 후 콜로니를 관찰하였다.○ 새로운 배지에서 자란 균들의 PAH 분해능 확인
새로 제작된 배지에서 자란 균들의 PAH 분해능을 확인하기 위해
우선 각 균들이 어떤 종류인지, 어떤 특성을 지니고 있는지를 조사하 고, 각 균들의 생육상태를 PAH가 없는 조건에서와 비교하거나 HPLC 또는 GC/MS를 이용하여 분석하는 것을 실험하고자 계획하였 으나 결과 발표 직후 학생들의 기말고사 시험 기간과 겹쳐 더 이상의 실험을 진행하지 못하였다. 다만, 현재까지는 대조 미생물로 포함시 킨
K. gwangyangenesis
의 생존 가능여부를 PCR-RFLP 법을 이용하여 동일한 패턴이 관찰되는 것으로 간접적으로 확인하였다. 각 배지에서 자란 균들을 멸균된 팁 끝에 뭍인 후 직접 콜로니 PCR을 수행하였다.PCR은 원핵생물 16s rRNA 유전자의 일부분의 서열을 이용하여 유니 버셜 프라이머 (SSU-F:5’-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’, SSU-R:
5’-WTTACCGCGGCTGCTGG-3’)를 사용하였다. PCR 조건은 먼저 95°C에서 10min 동안 반응시켜 세균의 세포벽을 터트린 후, DNA 변성 94°C에서 30초, 프라이머 반응(annealing) 55°C 30초, 신장 72°C 45초를 30회 반복하였다. 그 후 PCR 산물을 직접 제한효소
Hinf
I (5’-G▼ANCC-3’)로 처리하였다. PCR 산물 7uL에 buffer 1x 1.5uL, BSA 0.5uL, NaCl(1M) 0.5uL, 제한효소(Hinf
I) 5 unit를 매뉴얼에 따라 섞은 후 37°C 항온수조에서 2시간 동안 반응 후, 1.5% 아가로스 젤 상에서 제한 절편들의 패턴을 확인하였다.3. 연구 결과 및 시사점
□ 연구 결과
○ 배지 상에 출현한 콜로니의 크기, 색깔, 형태 및 생장속도에 차이가 있는 150여개의 균을 구분하였으며, 2번 이상의 계대배양을 통해 균 들을 순수배양 하였다. 각 균주는 그람염색 후 현미경 상에서 그람염 색 상태, 균의 형태 및 분포형태를 관찰하였다(그림4).
그림 4. Marine배지를 이용해 배양된 다양한 형태의 세균
○ 나프탈렌을 배지에 용해시키기 위한 계면활성제 선별
아세톤 뿐 아니라 메탄올, 에탄올 등에 의해 나프탈렌은 일정한 용해 도 범위 내에서 잘 녹지만 이것을 물에 섞음과 동시에 거의 대부분 다시 석출되었다. 또한 이들 물질들은 균의 생장에 영향을 줄 수 있으 므로 사용하는 것이 적절하지 않다고 판단되었다. 준비한 8가지 계면 활성물질 중 레시틴은 그 성질이 마치 구리스 오일과 같아서 물에 녹이기조차 어려웠음으로 제외하고 나머지 7종에 대하여서만 비교실 험을 진행하였다. 승화하는 나프탈렌의 성질 때문에 석출된 나프탈렌 의 양을 정확하게 정량화하기가 어렵고 또한 본 실험의 단계에서 정확한 정량 보다 계면활성제 간의 최적 물질을 선별하는 것이기 때문에 나프탈렌이 용해되는 정도를 5단계 척도로 구분하여 각 계면 활성제를 비교하였다. 비누인 어성초와 율피오일의 경우 거품과 건더 기가 발생하였으나 나프탈렌은 거의 녹지 않은 상태로 침전되었고 알로에, 10배 희석한 EM발효액 그리고 코코넛 기름에서도 나프탈렌 의 용해도는 그다지 좋지 않았다. 반면 쌀뜬물에서는 거의 대부분의
나프탈렌이 녹았고 일부만 침전이 되었으며, tween-80 용액이 가장 많은 나프탈렌을 용해 시켰음을 관찰하였다.
표2. 각 계면활성제의 나프탈렌 용해도 척도 계면활성제 나프탈렌 용해도 척도(5점 만점)
쌀뜬물 4점 (미량만이 석출되었고 대부분 용해) EM 발효액 1점 (나프탈렌 침전물이 바닥에 가라앉음) 코코넛 기름 2점 (나프탈렌 침전물이 떠있음)
어성초 비누 0점 (나프탈렌이 거의 용해되지 않고 남음) 율피오일 비누 0점 (나프탈렌이 거의 용해되지 않고 남음) Tween-80 5점 (나프탈렌이 거의 남아 있지 않음)
알로에 2점 (균일한 크기의 침전물이 바닥에 가라앉음)
<계면활성제를 이용한 나프탈렌 용해 실험 과정>
○ 나프탈렌-계면활성제 배지에서의 균 생장
가장 나프탈렌에 대한 용해도가 높았던 쌀뜬물 용액과 tween-80 용액에 20%의 나프탈렌을 섞어 제작한 배지에서 출현한 콜로니 종류 와 수를 측정해 본 결과 일반 marine배지에서는 평균 47.3개 (표준 편차 3.38)였던 반면 쌀뜬물(S), tween-80(T), 쌀뜬물 +tween-80(S+T)에서는 각각 평균 19.5개 (표준편차: 3.96),
21.3 (표준편차:1.79), 16.0개 (표준편차: 2.83)로 대조군인 marine 배지와 비교할 때 약 40% 정도의 빈도로 콜로니 수가 적게 출현하였 으며(그림5-A), 육안으로 판단한 콜로니 다양성도 marine 배지에 서는 평균 8.7종류 (표준편차 1.19), 쌀뜬물(S), tween-80(T), 쌀 뜬물+tween-80(S+T)에서는 각각 평균 6.0 (표준편차: 0.94), 3.8 (표준편차:0.55), 3.8 (표준편차: 0.29)로 콜로니의 다양성 또한 50%이하로 적게 나타났다(그림5-B).
토양 샘플의 희석비율을 까지 높여 가면서 동일한 실험을 반복한 결과 희석비율이 높아지면서 쌀뜬물 배지에서는 콜로니 수가 감소하 였지만 그래도 3.7개의 콜로니가 나타났던 반면 Tween-80 배지에 서는 모두 사멸하였다. 쌀뜬물과 tween-80을 1:1로 섞은 배지 (S+T)의 경향성은 쌀뜬물(S)과 tween-80(T)에서의 중간 정도의 콜로니 수 1개가 관찰되었다(그림 6-A,B). 이 실험 결과를 통해 tween-80의 경우 계면활성제 자체가 균의 생장에 영향을 미칠 수 있음을 추론하였다. 따라서 PAH의 일종인 나프탈렌을 배지에 용해 시켜 효과적으로 균을 추출하는데 사용하기 위한 계면활성제로 쌀뜬 물이 가장 우수한 물질임으로 판단하였다. 계면활성제로 쌀뜬물을 사용한 경우 출현한 균의 개수와 균의 종류에 있어 대조군보다 59%, 34% 각각 감소하였으며, 이는 실험과정에서의 비효율적인 노력과 비용을 최소 2배 이상 감소시킬 수 있음을 보여준다.
A. B.
그림 5. 나프탈렌-계면활성제 배지에서의 균 생장( 희석). A, 출현한 콜로니 수; B, 출현한 콜로니의 종류. S, 쌀뜬물; T, tween-80; S+T, 쌀뜬물+tween-80; MA, marine 배지(대조군)
A. B.
그림 6. 나프탈렌-계면활성제 배지에서의 균 생장( 희석). A, 출현한 콜로니 수; B, 출현한 콜로니의 종류. S, 쌀뜬물; T, tween-80; S+T, 쌀 뜬물+tween-80; MA, marine 배지(대조군)
○ 나프탈렌-계면활성제 배지에서 생장한 균주의 확인
프라이머 SSU-F와 SSU-R에 의한 예상되는 PCR 산물의 DNA 밴드 길이는 약 550bp 이다. 각 콜로니 PCR 산물들을
Hinf
I에 의해 절단 후 조금씩 다른 길이의 절편 크기가 관찰되었는데, 아쉽게도 전기영 동 시간을 너무 오래 잡아서 그만 크기가 작은 부분의 밴드들이 빠져나가고 말았다(그림7). 하지만 쌀뜬물과 tween-80을 사용한 배지에서 모두
K. gwangyangenesis
와 같은 크기의 밴드 패턴을 가진 콜로니가 관찰되었다(그림7). 염기서열 분석으로 추가적인 확인이 필요하지만 나프탈렌(PAH) 분해능이 있는 것으로 보고된K. gwangyangenesis
가 살아남았고 그 외에 다른 몇 몇의 균들이 이 배지에서 함께 살아남았 다면 출현한 균들은 나프탈렌을 대사에 직접 이용하여 살아가는 특성 이 지닌 것이거나 아니면 나프탈렌의 독성을 완화 또는 제거시킴으로 서 살아갈 수 있는 특성을 지닌 균들일 것으로 판단되었다. 이들 균주 들의 특성은 추후 연구를 통해 밝혀갈 필요성이 있다.그림 7. 계면활성제가 포함된 배지에서 자란 세균들의 16s rRNA 유전자 PCR 산물의 제한효소
Hinf
I 처리 결과○ 계면활성제로서의 쌀뜬물
쌀을 씻어낼 때 얻어질 수 있는 계면활성 성분인 감마오리자놀 (gamma-oryzanol)은 쌀겨, 옥수수, 보리 등에서 얻어지는 트리테르 펜 알코올류가 에스터 결합한 화합물로서[13], 유지 및 유지함유 식품 에서 산화방지제로 사용되고 있으며, 혈당을 낮추며(한국특허 제 0496019호), 혈중 콜레스테롤을 낮추고, 갱년기 증상, 복통 등의 증상 을 완화시키며, 인간과 동물의 성장을 촉진하는 것으로 보고되고 있 다. 본 실험에서 살뜬물은 계면활성제인 naphthalene를 배지에 용해 시키는데 우수하게 작용하였으며, 구하기 쉽고, 가격도 매우 싸며, 특히 배지 제작 시 간단히 섞어서 일반적인 배지 제작과정을 진행하
면 되기 때문에 그 활용이 매우 간단하다. 이와 더불어 미생물에 대한 저해 작용이 거의 알려진 바가 없어 실제로 EM 발효액을 위한 원료 성분으로 사용되어지고 있다. 그럼에도 불구하고 본 실험에서 EM 발효액의 효과가 낮았던 이유는 EM 발효액을 다시 10배로 희석해서 사용했기 때문이거나 EM에 의해 발효되는 과정에서 계면활성 성분 의 변화가 생겼을 가능성이 있다. 따라서 적용이 쉽고, 균의 생장에 영향이 적은 쌀뜬물이 본 실험의 목적상 가장 적합한 천연물 계면활 성제로 판단했다.
□ 향후계획
○ 물에 녹아 쉽게 소실되지 않으며 토양 또는 해양에서 쉽게 분해되지 않는 상태로 오랜 기간 동안 축적되어 인체와 환경에 악영향을 미칠 수 있는 PAH의 처리와 방제를 위해 이들을 분해할 수 있는 효과적인 미생물의 탐색은 필수 불가결한 과정이다. 본 실험에서는 PAH 분해 능이 있는 균주의 선별과정의 효율성을 높이기 위하여 PAH를 배지 에 용해시킬 수 있으면서 균의 생장에 영향을 미치지 않은 계면활성 물질을 탐색하고 평가하였다. 실험 진행 여건 상 PAH-marine 배지에 서 자란 균들의 PAH 분해능을 확인하지 못한 것이 아쉽다. 이를 위하여 우선 각 균들이 종류와 특성을 조사하고, HPLC 또는 GC/MS 등의 분석 장비를 활용한 정량화가 이루어 질 수 있다면 보다 활용도 가 높은 데이터를 제공할 수 있을 것이다. 또한 PAH를 기질로 분해하 는 PAH dioxygenase와 catechol dioxygenase 유전자 존재의 유무를 확인하여 세균의 PAH 분해 능력을 추정해 볼 수 있을 것이다[14,15].
K. gwangyangenesis
와 같이 선행연구를 통해 PAH 성분을 분해하는 것으로 알려진 균주들은 본 실험에서 개발된 시스템의 효율성을 검증 하는 것에 있어 유용한 대조군으로 활용될 수 있을 것이다. 더불어 본 실험에서 사용한 나프탈렌 외에 anthracene, phenanthrene, pyrene 등 다른 종류의 PAH에 대해서도 실험을 확장 해볼 수 있을 것이다. 실험 과정 중의 시행착오를 통해 균주 선발을 위한 과정이시간과 노력이 가장 많이 필요하면서도 효율성이 낮은 점을 인지하게 되었으며, 본 연구의 결과를 보다 정량화 하여 활용한다면 앞으로의 PAH 연구에 구체적으로 이바지 할 수 있을 것으로 사료된다.
□ 시사점
○ PAH 오염에 대한 인식
1995년 7월 씨프리린스호 사건, 2007년 12월 충청남도 태안군 앞바다 의 기름 유출 사건과 올해 1월 말 전남 여수시의 송유관으로부터의 원유 유출 사건, 올해 2월의 부산 남외항에서 있었던 원유 유출 사건 등 이슈가 되었던 대형 기름 유출 사건 이외에도 작은 선박의 추돌, 수출물품의 선적 시의 기름의 유출, 해안 인근 지역 공업시설물로 부터의 기름 유출 등 공업화된 인간의 활동이 미치는 해안가는 회복될 기회도 없이 크고 작은 오염물질이 축적되고 있고 이에 따른 피해는 알게 모르게 우리 인간과 생태계에 되돌아 올 수밖에 없는 것이 현실 이다. 처음 PAH에 대하여 관심을 갖게 되어 자료를 수집하는 과정에 서 학생들은 이 난분해성 물질의 심각성을 스스로 깨닫게 되었고 실험과정 중 시행착오의 어려움을 극복하며 실험을 주도적으로 이끌 어 갈 수 있었던 동력이 되었다.
○ 연구활동을 통해 얻은 학습 효과
실험 자체는 환경적으로 문제가 될 수 있는 난분해성 물질의 분해를 생물학적 방법을 활용하여 모색해 가는 결과에 그 의의가 있기도 하지만 그에 앞서 미래 과학도로 성장할 학생들이 과학의 역할에 대한 인식을 새롭게 하고 자신이 가진 동기를 통해 실험에 의의를 부여하고 문제를 해결해 나가는 과정을 배울 수 있는 기회였다는 점에서 더 큰 의의가 있다고 생각한다. 학생들 중에는 학교에서 실시 하고 있는 R&E 등을 통해 생물 및 화학 실험을 해본 경험이 있었던 학생들도 있었지만 일부는 주로 수학과 물리를 공부하면서 미생물과 생명과학 실험 장비들을 이용한 경험이 거의 없는 학생들도 있었다.
그럼에도 불구하고, 학생들은 각자의 시간을 쪼개어 시간이 날 때 마다 실험실에 와서 자발적으로 실험을 했고 연구노트를 공유하여 다음에 다른 친구들이 실험할 때 참고할 수 있도록 도왔다. 현재까지 의 연구 성과가 큰 무엇은 아닐지라도 학생들 스스로 시행착오를 극복하는 과정에서 만들어낸 것이라는 점과 그 결과의 활용가능성이 높다는 의미에서 본 연구의 가치가 크다. 학문간 융합의 본질을 생각 해 볼 때, 한쪽 방향으로 향하던 시선을 또 다른 시각에서 바라볼 수 있게 하는 것, 그런 경험을 제공하는 것이야 말로 융합을 일으키는 부싯돌과 같은 역할을 할 수 있다. 이러한 측면에서, 본 연구의 구성원 과 연구의 목적과 의의가 STEAM R&E가 추구하려고 하는 기대에 충족하였다고 생각된다.
4. 홍보 및 사후 활용
□ 사후 활용 계획
○ 학생들의 연구 성과는 다양한 기회를 통해 연구 성과를 확산할 기회를 가진다. 우선 학생들은 관심 학회에 참여하여 포스터 등을 통해 연구 성과를 발표한다. 이러한 기회를 통해 학생들은 타인들로부터 자신들 의 연구 결과에 대한 피드백을 받고 더욱 발전할 수 있는 기회가 될 수 있을 것이다. 뿐만 아니라 매년 개최되는 모든 영재학교가 매년 의 연구 성과를 공유하는 ‘영재학교 R&E 공동발표’에 참여하여 발표 할 기회를 가질 수 있다.
○ 경기과학고의 모든 학생은 1인 1주제의 졸업논문을 작성하는 것이 졸업요건으로 하고 있다. 경기과학고에서의 경험에 따르면 학생들은 다른 R&E 등에서 교수님 또는 선생님으로부터 주제를 지정받아 수행 한 경우보다 결과는 비록 작더라도 자신이 애착을 가지고 실험한 주제를 졸업논문으로 발전하기를 원하고 있다. 그리고 졸업논문을 작성하는 과정에서 학생들은 추가실험을 수행하고 논리를 발전시키 는 등 발전의 기회가 된다. 이렇게 발전한 논문은 경우에 따라 정규
학회지에 투고할 정도 이상의 연구 성과를 얻게 되는 경우가 다수 있으며 본 연구에서도 그럴 수 있는 가능성이 충분히 있다고 생각한 다.
○ PAH 특성상 본 프로젝트는 실제 오염된 해양지형에 적용되었을 때 장기간의 모니터링과 끊임없는 방법의 개선을 필요로 한다. PAH 가 인체와 생태계에 미칠 수 있는 영향을 생각해 볼 때, 장기적으로 수행하는데 있어 어려움이 따르더라도 지속적인 조사연구가 이루어 져야 할 부분이며, 본 연구결과는 다른 학생들(현 연구팀의 후배 학년 학생들)로 하여금 환경문제에 관련하여 지속적으로 깊이 있는 관심을 가질 수 있게 하는 기회를 제공할 수 있을 것이다. 그리고 이를 통해 꾸준한 연구 결과를 제시할 수 있다면 과학, 환경 교육은 물론 융합교 육의 좋은 모델을 제시할 수 있을 것이다.
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【연구성과 보고서 작성 시 유의 사항】
․폰트 휴먼명조, 15pt, 보고서 분량은 A4 20쪽 이내
․연구 과정을 충실하게 기술하되 간결하고 경제적으로 표현할 것
․불필요한 폰트, 디자인 서식, 이미지 등을 가급적 자제할 것
․사진, 그림 등을 적절히 배치하되, 이미지 해상도를 적절하게 조정하여 보고서 파일은 20MB를 초과하지 않도록 할 것
